VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại hai chủng XK
Theo phương pháp của Chương trình XK Quốc tế (ISP) 1966 và 1974 (Stanley, 1989; Shirling, 1966; Washman, 1961), Sổ tay phân loại của Bergey,1989, 2012.
2.3.2.1. Đặc điểm hình thái a. Các đặc điểm nuôi cấy
• Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ty khí sinh): màu sắc của khuẩn ty khí sinh được so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus (1963): xanh da trời, xám, xanh lá, đỏ, tím, trắng, vàng.
• Màu sắc của khuẩn ty cơ chất: chia vào 5 nhóm: vàng- nâu (gồm cả các loại không tiết săc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím...
• Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi trường ISP2-5. Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ty cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
• Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin, nuôi cấy XK trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp. Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen.
b. Các đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử
XK được nuôi cấy trên môi trường ISP3 và ISP 4 có đặt lamen trên mặt đĩa. Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28-30OC XK phát triển tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét.
• Hình dạng chuỗi bào tửđược kí hiệu:
o RF: thẳng hay hơi lượn sóng
o RA: hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn
o S: dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn
o SRF: dạng xoắn lượn sóng
o SRA: dạng xoắn có móc câu (Pridham et al, 1958)
• Bề mặt bào tử: Bề mặt của khuẩn ty khí sinh có bào tử được phủ platin trong 30 giây sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quét (Viện 69-Bộ tư lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh) để xác định đặc điểm bề mặt bào tử:
o Bào tử hình tròn, ovan, hình que.
o Bề mặt bào tửđược ký hiệu: Trơn nhẵn: sm; Gai: sp; Xù xì: wa; Tóc: ha.
2.3.2.2. Các đặc điểm sinh lý – sinh hóa a. Khả năng sử dụng nguồn cacbon
Quan sát khả năng đồng hoá nguồn cacbon của hai chủng XK trên môi trường ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đường glucose, fructose, sacarose, arabinose, xenlobiose, myo-inositol, manitơl, xylose, raffinose, rhamnose, tinh bột, dextrose. Nuôi cấy 5-7 ngày ở nhiệt độ 28-30oC, so sánh với đối chứng dương là môi trường ISP9 bổ sung glucose, đối chứng âm là môi trường ISP9 cơ sở (môi trường khoáng).
b. Khả năng sử dụng nguồn nitơ
XK được nuôi trên môi trường ISP8 bổ sung các nguồn nitơ khác nhau (0,1%). Kết quả sinh trưởng được xác định sau 15 ngày, so sánh với đối chứng âm (môi trường ISP8 cơ sở) và đối chứng dương (môi trường có L-Asparagine monohydrate).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi
Hai chủng XK TB5.3 và VD111 được nuôi cấy trên môi trường ISP2 ở 4, 10, 30, 37 và 45 (oC), quan sát sự sinh trưởng sau 7 ngày và 14 ngày.
d. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Hai chủng XK được nuôi ở các điều kiện pH ban đầu khác nhau là: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 11 ở nhiệt độ thích hợp, quan sát sự sinh trưởng sau 7 ngày.
e. Khả năng chịu muối
Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối, môi trường ISP2 được bổ sung NaCl với các nồng độ: 1, 3, 5, 7, 10, 13, 15%. Sau đó cấy chủng XK, nuôi ở nhiệt độ thích hợp, quan sát sự sinh trưởng sau 7 ngày.
f. Hoạt phổ kháng khuẩn
Các chủng VSV kiểm định được nuôi ở trong ống nghiệm có môi trường LB lỏng, lắc ở 180-200 vòng/phút, ở 37oC trong 24h.
XK được nuôi ở môi trường và các điều kiện thích hợp đã được lựa chọn và lắc với tốc độ 180-200 vòng/phút. Sau 2-5 ngày đem thử hoạt tính kháng khuẩn với các VSV kiểm định khác nhau.
g. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Xác định hoạt tính một số enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Bảng 2.1. Cơ chất và thuốc thử của một số enzyme ngoại bào
Enzyme Cơ chất (2g/l) Thuốc thử
Amylase Tinh bột tan Lugol 1%
Protease Casein Axit tricloaxetic 5%
Cellulase CMC Lugol 1%
Chitosanase Chitosan Lugol 1%
Xylanase Xylan Ethanol 70%
Cấy chấm điểm hai chủng XK nghiên cứu vào các đĩa petri đã chuẩn bị sẵn môi trường thử hoạt tính enzyme. Sau đó đặt vào tủ ấm 30oC trong 3 – 5 ngày để chủng XK phát triển và sinh enzyme phân giải cơ chất.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
giải cơ chất của enzyme. Vòng phân giải cơ chất không bắt màu ở xung quanh điểm cấy. Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng thuỷ phân cơ chất, d là đường kính lỗ thạch.