VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Phân loại hai chủng XK bằng phương pháp sinh học phân tử
2.3.3.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ XK bằng đệm CTAB Nguyên tắc:
Phá vỡ thành tế bào của XK bằng lysozym sau đó loại bỏ protein khỏi DNA nhờ protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ bằng phức hợp Phenol: Chloroform : Isoamin alcohol (25 : 24 : 1). Sau đó dịch có chứa DNA được tủa bằng Isopropanol và rửa bằng ethanol. Cặn DNA được hòa tan trong đệm TE. Bảo quản ở 4oC.
Hai chủng XK VD111 và TB5.3 được nuôi trên môi trường ISP2 ở 28oC trong 3 ngày, sau đó tiến hành tách DNA tổng số theo quy trình:
o Lấy 2 ml dịch nuôi cấy đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế bào. Hòa tan cặn trong 510 µl TE, pH = 8. Đảo đều bằng voltex. Bổ sung thêm 60 µl EDTA (nồng độ cuối 45mM). Sau đó thêm 60 µl lysozym (50 mg/ml), ủ trong 2 giờở 650C. Bổ sung thêm 5 µl protease K, 30 µl SDS 10%. Đảo nhẹ, ủ 1 giờở 370C. Thêm 110 µl NaCl 5M, 90 µl CTAB, đảo nhe. Bổ sung thêm 700 µl Chloroform: Isoamin alcohol (24:1), mix đều sau đó li tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút.
o Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới. Bổ sung thêm 700 µl hỗn hợp Phenol : Chloroform : Isoamin alcohol (25:24:1), đảo nhẹ sau đó li tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới (lặp lại 3 lần).
o Kết tủa DNA với propanol, để qua đêm ở -200C.
o Li tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch.
o Rửa tủa 2 lần với 500 µl cồn tuyệt đối.
o Làm khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
o Thêm 1 µl TE/RNase, sau đó ủở 370C trong 2 giờ
o Hòa tan lại tủa với 40 µl TE, pH = 8
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
2.3.3.2. Phản ứng PCR và giải trình tự gen 16S - rDNA
DNA tổng số sau khi được tinh sạch sẽđược chạy PCR để tách đoạn gen 16S- rDNA với thành phần phản ứng như sau: DNA template 1 µl H2O 12 µl dNTP (A,T,G,C) 0,8 µl Primer F 1 µl Primer R 1 µl Buffer 4 µl Taq polymerase 0,2 µl Tổng thể tích 20 µl
Hỗn hợp phản ứng sau khi mix được chạy PCR với chương trình như sau:
94oC 5 phút 94oC 1 phút 30 giây Lặp lại 30 lần 51oC 1 phút 30 giây 72oC 2 phút 72oC 10 phút 4oC ∞ Sử dụng cặp mồi FC27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và RC1492 (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) (hãng GENSET- Singapore BioTech pte, Ltd) để nhân gen mã hóa 16S rDNA.
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1 %. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Gentic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Sản phẩm sau khi giải trình tự được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI. Sau đó bằng việc sử dụng phần mềm ClustalX2 và MEGA4.0.2, cây phát sinh chủng loại được thiết lập trên cơ sở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
khoảng cách di truyền theo Kimura và sử dụng phương pháp Neighbor-joining. Phân tích Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với 1000 mẫu thử.