VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Nghiên cứu điều kiện thu nhận chất kháng khuẩn từ hai chủng XK tuyển chọn
chọn
2.3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh chất kháng khuẩn
• Ảnh hưởng của môi trường lên men
Hai chủng XK được nuôi lắc 200 vòng/phút trên các môi trường MT72, MT79, MT7, M1ASW, TH4-47, A4H, MN1ASW ở 30oC. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy bằng phương pháp đục lỗ thạch.
Môi trường lên men cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất sẽđược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
• Ảnh hưởng của môi trường nhân giống
XK được nuôi trên các môi trường MT 48, Gauze 1 và ISP2, lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC, sau 3 – 5 ngày nuôi, cân sinh khối và chuyển vào lên men sau đó tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn, từ đó chọn ra môi trường nhân giống thích hợp nhất.
• Ảnh hưởng của hàm lượng các nguồn dinh dưỡng
Sau khi chọn được môi trường lên men thích hợp, tiến hành thay đổi lần lượt hàm lượng nguồn cacbon và nguồn nitơ có trong môi trường . Từ đó chọn ra một môi trường với thành phần thích hợp nhất để tiến hành nghiên cứu tiếp theo đối với hai chủng XK.
• Ảnh hưởng của pH
Tiến hành nuôi lắc 200 vòng/phút đối với các chủng XK trong các điều kiện pH môi trường ban đầu là: 5; 6; 7; 8; 9. Sau 3 - 5 ngày lên men, xác định hoạt tính kháng khuẩn trong dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ thạch.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ
Các chủng XK được nuôi lắc 200 vòng/phút với các mức nhiệt độ: 20, 25, 30, 35 (oC). Sau 3 - 5 ngày lên men, xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ thạch.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
• Ảnh hưởng của tuổi giống
Các chủng giống XK được nuôi 24, 36, 48 và 60h, sau đó cấy chuyển vào môi trường lên men. Sau 3 - 5 ngày nuôi trên máy lắc 200 vòng/phút, thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch.
• Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
Tiến hành nuôi lắc các chủng XK đến khi đạt tuổi giống thích hợp, tiếp vào môi trường lên men với các tỉ lệ 2, 4, 5, 6, 8 (%). Sau 3 - 5 ngày nuôi trên máy lắc 200 vòng/phút, thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch.
• Ảnh hưởng của độ thông khí
XK được cấy vào các bình tam giác 250ml với các thể tích dịch nuôi tương ứng với 10, 15, 20, 25, 30 (%) thể tích bình và lắc ở tốc độ 200 vòng/phút. Sau 3 - 5 ngày, thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch.
2.3.4.2. Xác định động thái quá trình lên men
Sau khi chọn được môi trường và các thông số điều kiện lên men thích hợp, tiến hành lên men để xác định động thái quá trình lên men. Trong quá trình lên men các thông số được nghiên cứu bao gồm pH, sinh khối, hoạt tính kháng khuẩn của hai chủng XK.
2.3.4.3. Lựa chọn dung môi chiết tách chất kháng khuẩn từ dịch lên men
Dịch lên men sau khi loại sinh khối được tách bằng các loại dung môi hữu cơ: n- Butanol (1:1); 2-Butanol (1:1); n-Butyl acetate (1:1); Ethyl - acetate (1:1); Ethyl – acetate (2:1); n-Butanol (2:1); Acetol (1:1). Tỷ lệ giữa dịch nuôi và dung môi là 1:1 hoặc 1:2 theo đơn vị thể tích/ thể tích. Hỗn hợp dịch lên men và dung môi được lắc ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Sau đó thử hoạt tính kháng sinh trong dung môi chiết.