Xây dựng quy trình bradford phân tích protein tổng số huyết tương ở các bệnh nhân đái tháo đường type 2

z [Date]  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021  z  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS VŨ THỊ THƠM ThS VŨ VÂN NGA HÀ NỘI – 2021  LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thành đánh dấu kết thúc năm rèn luyện miệt mài giảng đường Trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN, tiền đề trang bị cho sinh viên chúng em kỹ năng, kiến thức quý báu trước bước chân vào đường lập nghiệp Vì vậy, có ý nghĩa vô to lớn sinh viên Để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, ngồi kỹ năng, kiến thức nỗ lực mình, thân em cịn nhận giúp đỡ tận tình từ thầy giáo, giáo viên hướng dẫn cổ vũ, động viên gia đình, bạn bè Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người đồng hành em suốt chặng đường học vừa qua Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS Vũ Thị Thơm – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở tạo điều kiện thuận lợi nhất, hướng dẫn truyền thụ đến em niềm đam mê học tập, nghiên cứu y sinh Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths Vũ Vân Nga – Giảng viên Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở, người đồng hành, tận tâm hướng dẫn dạy kiến thức, kỹ cần thiết, giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến cán giáo viên môn Y Dược Học Cơ Sở thầy cô, cán Trường Đại học Y Dược giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn đề tài “Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng số biomarker bệnh nhân bị bệnh võng mạc mắt đái tháo đường”, mã số nhiệm vụ NĐT.69/CHN/19 – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội hỗ trợ nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người ln cổ vũ, động viên khuyến khích em suốt chặng đường học tập vừa qua Xin chúc cho điều tốt đẹp luôn đồng hành sống người Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa LỜI CAM ĐOAN Em tên là: Nguyễn Ngọc Hòa MSSV: 16100085 Là sinh viên lớp QHY 2016 ngành Dược học Em xin cam đoan đề tài: “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2” cơng trình nghiên cứu độc lập đồng hướng dẫn giáo viên hướng dẫn: TS Vũ Thị Thơm Ths Vũ Vân Nga – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở Ngồi khơng có chép người khác Đề tài, nội dung báo cáo thực tập sản phẩm mà em nỗ lực nghiên cứu trình học tập trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN Các số liệu, kết trình bày báo cáo hoàn toàn trung thực, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm, kỷ luật mơn nhà trường đề có vấn đề xảy Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường IFG Rối loạn đường huyết lúc đói (Impaired fasting glucose) IGT Rối loạn dung nạp glucose (Impaired glucose tolerance) HbA1c Lượng glucose gắn với hemoglobin (Hemoglobin glycated) WHO Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) GDM Đái tháo đường thai kỳ (Gestational diabetes mellitus) ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) BN Bệnh nhân OD Mật độ quang (Optical density) BL Mẫu trắng (Blank) DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ tiền ĐTĐ người lớn khơng có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020 Bảng 2.1 Vị trí tra mẫu chuẩn vào khay 96 giếng 19 Bảng 3.1 OD khay 96 giếng 21 Bảng 3.2 Tỉ lệ 1/10, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 22 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Bảng 3.3 Tỉ lệ 1/10, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL 23 Bảng 3.4 Tỉ lệ 1/10, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL 24 Bảng 3.5 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/10 25 Bảng 3.6 Tỉ lệ 1/20, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL 26 Bảng 3.7 Tỉ lệ 1/20, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL 27 Bảng 3.8 Tỉ lệ 1/20, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL 28 Bảng 3.9 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/20 29 Bảng 3.10 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị 32 p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, tỉ lệ 1/20 Bảng 3.11 Vị trí tra mẫu protein chuẩn mẫu thử vào khay 96 giếng 32 Bảng 3.12 OD đo khay 96 giếng gồm protein chuẩn mẫu 33 BN Bảng 3.13 Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN ĐTĐ để vẽ đường chuẩn 34 Bảng 3.14 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị p-value cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ 34 Bảng 3.15 OD mẫu protein BN ĐTĐ 34 Bảng 3.16 Nồng độ protein huyết tương mẫu pha loãng 300 lần (μg/mL) 35 Bảng 3.17 Nồng độ protein huyết tương mẫu BN ban đầu (g/L) 35 Bảng 3.18 Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E 37 DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Biểu đồ biểu diễn thành phần protein huyết tương Hình 3.1 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 22 μg/mL Hình 3.2 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 23 960 μg/mL Hình 3.3 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 24 1920 μg/mL Hình 3.4 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL sau phương pháp kiểm định trị số P Hình 3.5 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL 25 Hình 3.6 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 27 26 μg/mL Hình 3.7 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920 μg/mL 28 Hình 3.8 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL sau kiểm định trị số P 29 Hình 3.9 Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/10 sau kiểm định trị số P 30 Hình 3.10 So sánh đường chuẩn tối ưu tỉ lệ 1/10 1/20 30 Hình 3.11 Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ 33 [Date] MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Đái tháo đường 1.1.1 Dịch tễ bệnh ĐTĐ 1.1.2 Khái niệm .2 1.1.3 Triệu chứng biến chứng 1.1.4 Chẩn đoán 1.1.5 Phân loại 1.2 Tổng quan protein huyết tương người 1.2.1 Khái niệm huyết tương người 1.2.2 Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người 1.2.3 Chức protein huyết tương 1.2.4 Ý nghĩa việc nghiên cứu hệ protein huyết tương 10 1.3 Tổng quan phương pháp định lượng protein 10 1.3.1 Phương pháp Western blot- Định lượng protein phương pháp kháng thể 11 1.3.2 Định lượng protein phương pháp khối phổ 11 1.3.3 Định lượng protein phương pháp đo quang 12 1.4 Tổng quan phương pháp Bradford .13 1.4.1 Giới thiệu chung 13 1.4.2 Cơ chế 13 1.4.3 Thuốc thử .14 1.4.4 Ưu điểm hạn chế .14 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu .15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16 2.1.3 Hóa chất .16 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .16 2.2.1 Thu nhận mẫu máu từ bệnh nhân 16 2.2.2 Phân lập huyết tương từ mẫu máu bệnh nhân, vận chuyển, bảo quản lưu trữ 16 2.2.3 Tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford .17 2.2.4 Xác định nồng độ protein mẫu huyết tương bệnh nhân ĐTĐ type phương pháp Bradford 20 2.3 Phương pháp xử lý số liệu .21 2.4 Đạo đức nghiên cứu 21 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .22 3.1 Kết tối ưu hóa quy trình xác định hàm lượng protein mẫu huyết tương phương pháp Bradford 22 3.2 Kết xác định hàm lượng protein mẫu huyết tương phương pháp Bradford .33 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết đo nồng độ protein huyết tương phương pháp Bradford .39 3.4 Một số lưu ý 40 3.5 Một số hạn chế đề tài .41 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ .42 TÀI LIỆU THAM KHẢO OD TỶ LỆ 1/10 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 y = 0,002x R² = 0,932 50 100 150 200 Nồng độ (μg/mL) 250 300 250 300 OD TỶ LỆ 1/20 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 y = 0,0012x R² = 0,9699 50 100 150 200 Nồng độ (μg/mL) Hình 3.10 So sánh đường chuẩn tối ưu tỉ lệ 1/10 1/20 Hệ số R2 đường chuẩn tỉ lệ 1/20 lớn 0,95, đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL tỷ lệ 1/20 sử dụng để làm kết trình tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford Như vậy, trình thử nghiệm Bradford để xác định nồng độ protein huyết tương người tuân theo bước xây dựng đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL tỷ lệ 1/20, bao gồm: • Tiến hành pha loãng dung dịch protein chuẩn 3840 μg/mL thành dung dịch protein có nồng độ: 0, 30, 60, 120, 240 μg/mL ống Eppendorf 1,5 mL • Tiến hành tra mẫu chuẩn, mẫu thử thuốc thử vào khay 96 giếng theo vị trí, mẫu thực lần, giếng bao gồm 10 μL protein chuẩn protein thử/ 190 μL thuốc thử 32 3.2 Kết xác định hàm lượng protein mẫu huyết tương phương pháp Bradford Tỉ lệ pha lỗng protein huyết tương chọn 1/300 Giải thích cho mức độ pha loãng sau: nồng độ protein huyết tương người bình thường rơi vào khoảng 60-70g/l, khoảng tuyến tính đường chuẩn 0-240 μg/mL Như vậy, pha lỗng 300 lần nồng độ protein huyết tương mẫu nằm khoảng tuyến tính Sử dụng OD protein chuẩn để vẽ đường chuẩn thử nghiệm đo nồng độ protein toàn phần BN ĐTĐ, với dãy nồng độ protein chuẩn 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/20, mẫu lặp lại lần Các mẫu protein BN tra vào giếng theo thứ tự ghi bảng 3.11 với trình tra mẫu tiến hành sau: Tiến hành tra mẫu chuẩn, mẫu thử thuốc thử vào khay 96 giếng theo vị trí, mẫu thực lần, theo vị trí ghi bảng, giếng bao gồm 10 μL protein chuẩn protein thử/ 190 μL thuốc thử Bảng 3.11 Vị trí tra mẫu protein chuẩn mẫu thử vào khay 96 giếng 10 11 12 A BL BL 7 36 36 61 61 91 91 123 123 B 0 13 13 41 41 67 67 92 92 127 127 C 30 30 16 16 45 45 72 72 101 101 134 134 D 60 60 21 21 48 48 73 73 115 115 138 138 E 120 120 23 23 49 49 76 76 117 117 139 139 F 240 240 26 26 50 50 83 83 119 119 143 143 G 60 60 29 29 58 58 86 86 120 120 150 150 33 33 59 59 89 89 121 121 163 163 H Kết OD đo khay 96 giếng bao gồm OD protein chuẩn protein mẫu BN thể bảng 3.12 33 Bảng 3.12 OD đo khay 96 giếng gồm protein chuẩn mẫu BN 0,263 0,267 0,588 0,580 0,561 0,585 0,621 0,567 0,492 0,564 0,554 0,559 0,268 0,267 0,576 0,554 0,560 0,568 0,557 0,581 0,478 0,507 0,577 0,584 0,337 0,378 0,556 0,551 0,590 0,500 0,568 0,567 0,564 0,552 0,577 0,587 0,381 0,393 0,560 0,586 0,509 0,523 0,587 0,561 0,583 0,602 0,449 0,528 0,423 0,411 0,579 0,546 0,561 0,544 0,568 0,560 0,596 0,598 0,551 0,551 0,553 0,553 0,560 0,568 0,586 0,562 0,552 0,558 0,560 0,568 0,577 0,590 0,380 0,397 0,594 0,569 0,586 0,524 0,571 0,580 0,570 0,585 0,574 0,525 0,590 0,600 0,538 0,545 0,597 0,568 0,554 0,559 0,580 0,586 Chúng sử dụng số liệu OD đo protein chuẩn để tính tốn dựng đường chuẩn, cách tính trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN ĐTĐ để vẽ đường chuẩn Nồng độ OD lần OD lần OD trung bình OD trừ BL BL 0,263 0,267 0,265 0,268 0,267 0,2675 0,0025 30 0,337 0,338 0,3375 0,0725 60 0,381 0,393 0,387 0,122 120 0,423 0,411 0,417 0,152 240 0,553 0,553 0,553 0,288 60 0,380 0,397 0,3885 0,1235 Đường chuẩn dựng dựa thể mối quan hệ OD trừ BLvà nồng độ protein, biểu diễn đồ thị 3.14 34 0.35 y = 0,0013x R² = 0,9717 0.3 OD 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 50 100 150 200 Nồng độ (μg/mL) 250 300 Hình 3.11 Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ Dùng phương pháp kiểm định trị số P cho đường chuẩn vừa dựng, thu kết bảng 3.14 Bảng 3.14 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số p tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ p-value Hệ số tự Hệ số nồng độ 0,271905 0,005534 Từ bảng số liệu thu được, thấy p-value hệ số tự phương trình > 0,05, hệ số tự khơng có ý nghĩa thống kê Phương trình viết khơng sử dụng hệ số tự Từ OD đo khay 96 giếng, chúng tơi tính tốn OD trung bình lần tra mẫu, sau trừ OD mẫu BL để thu OD thực mẫu protein BN bảng 3.15 35 Bảng 3.15 OD mẫu protein BN ĐTĐ Mã BN OD Mã BN OD Mã BN OD Mã BN OD Mã BN OD 0,319 36 0,306 61 0,308 91 0,338 123 0,329 13 0,300 41 0,292 67 0,299 92 0,298 127 0,304 16 0,289 45 0,306 72 0,280 101 0,269 134 0,303 21 0,308 48 0,283 73 0,251 115 0,290 138 0,309 23 0,298 49 0,289 76 0,288 117 0,291 139 0,299 26 0,299 50 0,312 83 0,309 119 0,292 143 0,290 29 0,317 58 0,313 86 0,290 120 0,283 150 0,311 33 0,330 59 0,304 89 0,277 121 0,306 163 0,318 Dùng OD thu bảng 3.15 hồi quy sử dụng phương trình đường chuẩn đồ thị 3.14, thu nồng độ protein huyết tương mẫu thử sau pha loãng 300 lần sau: Bảng 3.16 Nồng độ protein huyết tương mẫu pha loãng 300 lần (μg/mL) Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ 245,38 36 235,00 61 236,92 91 260,00 123 253,08 13 230,77 41 224,62 67 230,00 92 228,85 127 233,85 16 221,92 45 235,00 72 215,38 101 206,92 134 232,69 21 236,92 48 217,31 73 193,08 115 223,08 138 237,69 23 228,85 49 221,92 76 221,15 117 223,85 139 230,00 26 230,00 50 240,00 83 237,69 119 224,62 143 223,08 29 243,46 58 240,38 86 223,08 120 217,31 150 238,85 33 253,85 59 233,85 89 212,69 121 235,38 163 244,23 36 Từ nồng độ protein pha loãng 300 lần (tính theo μg/mL), tính nồng độ protein mẫu lúc chưa pha loãng, kết thể bảng 3.17 Bảng 3.17 Nồng độ protein huyết tương mẫu BN ban đầu (g/L) Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ Mã BN Nồng độ 73,62 36 70,50 61 71,08 91 78,00 123 75,92 13 69,23 41 67,38 67 69,00 92 68,65 127 70,15 16 66,58 45 70,50 72 64,62 101 62,08 134 69,81 21 71,08 48 65,19 73 57,92 115 66,92 138 71,31 23 68,65 49 66,58 76 66,35 117 67,15 139 69,00 26 69,00 50 72,00 83 71,31 119 67,38 143 66,92 29 73,04 58 72,12 86 66,92 120 65,19 150 71,65 33 76,15 59 70,15 89 63,81 121 70,62 163 73,27 Sử dụng kết thu bảng để so sánh với nồng độ protein đo bệnh viện E tiêu chuẩn Độ lệch tính theo % nồng độ protein đo phương pháp Bradford so với sử dụng máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800 thể bảng sau: Bảng 3.18 Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E Độ lệch (%) 3,69 36 Độ lệch (%) 6,16 61 Độ lệch (%) 2,50 13 3,44 41 0,91 67 7,13 92 7,77 127 2,26 16 3,55 45 4,44 72 6,75 101 6,65 134 3,84 21 0,73 48 17,04 73 19,78 115 4,67 138 0,54 23 5,18 49 3,23 76 4,39 117 8,51 139 12,75 26 6,15 50 20,81 83 3,25 119 4,96 143 0,86 29 7,25 58 1,15 86 6,54 120 1,23 150 10,57 33 19,36 59 12,24 89 1,61 121 13,35 163 1,34 Mã BN Mã BN Mã BN 37 91 Độ lệch (%) 19,82 123 Độ lệch (%) 8,15 Mã BN Mã BN Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016, chúng tơi tính giá trị trung bình độ lệch 6,9% với độ lệch chuẩn 5,8% Như vậy, nhìn tổng thể, khác biệt nồng độ protein huyết BN đo thử nghiệm Bradford đo bệnh viện E 6,9 ± 5,8 % Cũng từ liệu thu được, thấy 9/40 kết thu có độ lệch 10% so với nồng độ protein đo bệnh viện E Khơng hồn tồn rõ ràng khác biệt lại phát sinh; nhiên, khác biệt phương pháp, hóa chất, thiết bị dụng cụ phịng thí nghiệm thân người thực nguyên nhân dẫn đến sai khác Do đó, ln nên xây dựng khoảng tham chiếu bình thường cho thử nghiệm Bradford chấp nhận giá trị tính tốn cách thận trọng Sử dụng kiểm định T-student để so sánh giá trị trung bình phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E với 0, kết thu bảng 3.19 Bảng 3.19 So sánh giá trị trung bình phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E với Độ lệch % So với Gía trị trung bình 6,86375 Phương sai 33,79813686 Số mẫu 40 df 39 P(T