Xây dựng quy trình bradford phân tích protein tổng số huyết tương ở các bệnh nhân đái tháo đường type 2

z [Date]  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2021  z  ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN NGỌC HÒA XÂY DỰNG QUY TRÌNH BRADFORD PHÂN TÍCH PROTEIN TỔNG SỐ HUYẾT TƯƠNG Ở CÁC BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS VŨ THỊ THƠM ThS VŨ VÂN NGA HÀ NỘI – 2021  LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thành đánh dấu kết thúc năm rèn luyện miệt mài giảng đường Trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN, tiền đề trang bị cho sinh viên chúng em kỹ năng, kiến thức quý báu trước bước chân vào đường lập nghiệp Vì vậy, có ý nghĩa vô to lớn sinh viên Để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, ngồi kỹ năng, kiến thức nỗ lực mình, thân em cịn nhận giúp đỡ tận tình từ thầy giáo, giáo viên hướng dẫn cổ vũ, động viên gia đình, bạn bè Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người đồng hành em suốt chặng đường học vừa qua Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS Vũ Thị Thơm – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở tạo điều kiện thuận lợi nhất, hướng dẫn truyền thụ đến em niềm đam mê học tập, nghiên cứu y sinh Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths Vũ Vân Nga – Giảng viên Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở, người đồng hành, tận tâm hướng dẫn dạy kiến thức, kỹ cần thiết, giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến cán giáo viên môn Y Dược Học Cơ Sở thầy cô, cán Trường Đại học Y Dược giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn đề tài “Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng số biomarker bệnh nhân bị bệnh võng mạc mắt đái tháo đường”, mã số nhiệm vụ NĐT.69/CHN/19 – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội hỗ trợ nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người ln cổ vũ, động viên khuyến khích em suốt chặng đường học tập vừa qua Xin chúc cho điều tốt đẹp luôn đồng hành sống người Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa LỜI CAM ĐOAN Em tên là: Nguyễn Ngọc Hòa MSSV: 16100085 Là sinh viên lớp QHY 2016 ngành Dược học Em xin cam đoan đề tài: “Xây dựng quy trình Bradford phân tích protein tổng số huyết tương bệnh nhân Đái tháo đường type 2” cơng trình nghiên cứu độc lập đồng hướng dẫn giáo viên hướng dẫn: TS Vũ Thị Thơm Ths Vũ Vân Nga – Bộ môn Y Dược Học Cơ Sở Ngồi khơng có chép người khác Đề tài, nội dung báo cáo thực tập sản phẩm mà em nỗ lực nghiên cứu trình học tập trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN Các số liệu, kết trình bày báo cáo hoàn toàn trung thực, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm, kỷ luật mơn nhà trường đề có vấn đề xảy Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hòa ĐTĐ IFG IGT HbA1c WHO GDM ADA BN OD BL DANH MỤC BẢNG Tên bảng Bảng 1.1 Tiêu chuẩn xét nghiệm bệnh ĐTĐ tiền ĐTĐ người lớn khơng có triệu chứng theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association) Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ theo ADA 2020 Bảng 2.1 Vị trí tra mẫu chuẩn vào khay 96 giếng Bảng 3.1 OD khay 96 giếng Bảng 3.2 Tỉ lệ 1/10, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Bảng 3.3 Tỉ lệ 1/10, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Bảng 3.4 Tỉ lệ 1/10, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Bảng 3.5 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/10 Bảng 3.6 Tỉ lệ 1/20, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240; 480 μg/mL Bảng 3.7 Tỉ lệ 1/20, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Bảng 3.8 Tỉ lệ 1/20, OD đo protein chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920, 3840 μg/mL Bảng 3.9 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/20 Bảng 3.10 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị p-value cho phương trình đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL, tỉ lệ 1/20 Bảng 3.11 Vị trí tra mẫu protein chuẩn mẫu thử vào khay 96 giếng Bảng 3.12 OD đo khay 96 giếng gồm protein chuẩn mẫu BN Bảng 3.13 Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN ĐTĐ để vẽ đường chuẩn Bảng 3.14 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số P tính tốn giá trị p-value cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ Bảng 3.15 OD mẫu protein BN ĐTĐ Bảng 3.16 Nồng độ protein huyết tương mẫu pha loãng 300 lần (μg/mL) Bảng 3.17 Nồng độ protein huyết tương mẫu BN ban đầu (g/L) Bảng 3.18 Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E DANH MỤC HÌNH Tên hình Hình 1.1 Biểu đồ biểu diễn thành phần protein huyết tương Hình 3.1 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL Hình 3.2 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL Hình 3.3 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Hình 3.4 Tỉ lệ 1/10, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL sau phương pháp kiểm định trị số P Hình 3.5 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL Hình 3.6 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 120; 240; 480; 960 μg/mL Hình 3.7 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 240; 480; 960; 1920 μg/mL Hình 3.8 Tỉ lệ 1/20, Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL sau kiểm định trị số P Hình 3.9 Đường chuẩn dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/10 sau kiểm định trị số P Hình 3.10 So sánh đường chuẩn tối ưu tỉ lệ 1/10 1/20 Hình 3.11 Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ [Date] MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Đái tháo đường 1.1.1 Dịch tễ bệnh ĐTĐ 1.1.2 Khái niệm 1.1.3 Triệu chứng biến chứng 1.1.4 Chẩn đoán 1.1.5 Phân loại 1.2 Tổng quan protein huyết tương người 1.2.1 Khái niệm huyết tương người 1.2.2 Đặc điểm, thành phần, phân loại hệ protein huyết tương người 1.2.3 Chức protein huyết tương 1.2.4 Ý nghĩa việc nghiên cứu hệ protein huyết tương 10 1.3 Tổng quan phương pháp định lượng protein 10 1.3.1 Phương pháp Western blot- Định lượng protein phương pháp kháng thể 11 1.3.2 Định lượng protein phương pháp khối phổ 11 1.3.3 Định lượng protein phương pháp đo quang 12 1.4 Tổng quan phương pháp Bradford 13 1.4.1 Giới thiệu chung 13 1.4.2 Cơ chế 13 1.4.3 Thuốc thử 14 1.4.4 Ưu điểm hạn chế 14 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 16 2.1.3 Hóa chất 16 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Thu nhận mẫu máu từ bệnh nhân 16 2.2.2 Phân lập huyết tương từ mẫu máu bệnh nhân, vận chuyển, bảo quản lưu trữ 16 2.2.3 Tối ưu hóa quy trình thử nghiệm Bradford 17 2.2.4 Xác định nồng độ protein mẫu huyết tương bệnh nhân ĐTĐ type phương pháp Bradford 20 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 21 2.4 Đạo đức nghiên cứu 21 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Kết tối ưu hóa quy trình xác định hàm lượng protein mẫu huyết tương phương pháp Bradford 22 3.2 Kết xác định hàm lượng protein mẫu huyết tương phương pháp Bradford 33 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết đo nồng độ protein huyết tương phương pháp Bradford 39 3.4 Một số lưu ý 40 3.5 Một số hạn chế đề tài 41 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 3.2 Kết xác định hàm lượng protein mẫu huyết tương phương pháp Bradford Tỉ lệ pha loãng protein huyết tương chọn 1/300 Giải thích cho mức độ pha lỗng sau: nồng độ protein huyết tương người bình thường rơi vào khoảng 60-70g/l, khoảng tuyến tính đường chuẩn 0-240 μg/mL Như vậy, pha loãng 300 lần nồng độ protein huyết tương mẫu nằm khoảng tuyến tính Sử dụng OD protein chuẩn để vẽ đường chuẩn thử nghiệm đo nồng độ protein toàn phần BN ĐTĐ, với dãy nồng độ protein chuẩn 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL, tỉ lệ 1/20, mẫu lặp lại lần Các mẫu protein BN tra vào giếng theo thứ tự ghi bảng 3.11 với trình tra mẫu tiến hành sau: Tiến hành tra mẫu chuẩn, mẫu thử thuốc thử vào khay 96 giếng theo vị trí, mẫu thực lần, theo vị trí ghi bảng, giếng bao gồm 10 μL protein chuẩn protein thử/ 190 μL thuốc thử Bảng 3.11 Vị trí tra mẫu protein chuẩn mẫu thử vào khay 96 giếng A BL B C 30 D 60 E 120 F 240 G 60 H Kết OD đo khay 96 giếng bao gồm OD protein chuẩn protein mẫu BN thể bảng 3.12 33 Bảng 3.12 OD đo khay 96 giếng gồm protein chuẩn mẫu BN 0,263 0,268 0,337 0,381 0,423 0,553 0,380 Chúng sử dụng số liệu OD đo protein chuẩn để tính tốn dựng đường chuẩn, cách tính trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 Xử lý OD dãy nồng độ 0; 30; 60; 120; 240 μg/mL BN ĐTĐ để vẽ đường chuẩn Nồng độ BL 30 60 120 240 60 Đường chuẩn dựng dựa thể mối quan hệ OD trừ BLvà nồng độ protein, biểu diễn đồ thị 3.14 34 OD Hình 3.11 Đường chuẩn định lượng protein huyết tương BN ĐTĐ Dùng phương pháp kiểm định trị số P cho đường chuẩn vừa dựng, thu kết bảng 3.14 Bảng 3.14 Sử dụng phương pháp kiểm định trị số p tính tốn giá trị pvalue cho phương trình đường chuẩn BN ĐTĐ Hệ số tự Hệ số nồng độ Từ bảng số liệu thu được, thấy p-value hệ số tự phương trình > 0,05, hệ số tự khơng có ý nghĩa thống kê Phương trình viết không sử dụng hệ số tự Từ OD đo khay 96 giếng, chúng tơi tính tốn OD trung bình lần tra mẫu, sau trừ OD mẫu BL để thu OD thực mẫu protein BN bảng 3.15 35 Bảng 3.15 OD mẫu protein BN ĐTĐ Mã BN O 0,3 13 0,3 16 0,2 21 0,3 23 0,2 26 0,2 29 0,3 33 0,3 Dùng OD thu bảng 3.15 hồi quy sử dụng phương trình đường chuẩn đồ thị 3.14, thu nồng độ protein huyết tương mẫu thử sau pha loãng 300 lần sau: Bảng 3.16 Nồng độ protein huyết tương mẫu pha loãng 300 lần (μg/mL) Mã BN Nồng độ 245,38 13 230,77 16 221,92 21 236,92 23 228,85 26 230,00 29 243,46 33 253,85 36 Từ nồng độ protein pha loãng 300 lần (tính theo μg/mL), tính nồng độ protein mẫu lúc chưa pha loãng, kết thể bảng 3.17 Bảng 3.17 Nồng độ protein huyết tương mẫu BN ban đầu (g/L) Mã BN Nồng độ 73,6 13 69,2 16 66,5 21 71,0 23 68,6 26 69,0 29 73,0 33 76,1 Sử dụng kết thu bảng để so sánh với nồng độ protein đo bệnh viện E tiêu chuẩn Độ lệch tính theo % nồng độ protein đo phương pháp Bradford so với sử dụng máy hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800 thể bảng sau: Bảng 3.18 Phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E Đ Mã lệch BN (% 3, 13 3, 16 3, 21 0, 23 5, 26 6, 29 7, 33 19 Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016, tính giá trị trung bình độ lệch 6,9% với độ lệch chuẩn 5,8% Như vậy, nhìn tổng thể, khác biệt nồng độ protein huyết BN đo thử nghiệm Bradford đo bệnh viện E 6,9 ± 5,8 % Cũng từ liệu thu được, thấy 9/40 kết thu có độ lệch 10% so với nồng độ protein đo bệnh viện E Khơng hồn tồn rõ ràng khác biệt lại phát sinh; nhiên, khác biệt phương pháp, hóa chất, thiết bị dụng cụ phịng thí nghiệm thân người thực nguyên nhân dẫn đến sai khác Do đó, ln nên xây dựng khoảng tham chiếu bình thường cho thử nghiệm Bradford chấp nhận giá trị tính tốn cách thận trọng Sử dụng kiểm định T-student để so sánh giá trị trung bình phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E với 0, kết thu bảng 3.19 Bảng 3.19 So sánh giá trị trung bình phần trăm độ lệch nồng độ protein đo phương pháp Bradford máy hóa sinh bán tự động BV E với Gía trị trung bình Phương sai Số mẫu df P(T