Bài viết trình bày thu Glyco qua cột con A; nhận dạng Gly bằng khối phổ liên tiếp MS/MS; xác định sự thay đổi hàm lượng Gly huyết thanh bằng 2-DE. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu, mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
29(3): 90-94 9-2007 Tạp chí Sinh học Phân tích thay đổi glycoprotein huyết bệnh nhân đái tháo đờng type Nguyễn Thị Minh Phơng, Trần Thành, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học Đái tháo đờng (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hoá glucose thờng gặp có tỷ lệ ngời mắc bệnh ngày gia tăng, đặc biệt nớc phát triển có Việt Nam Năm 2002, theo tài liệu nghiên cứu tổ chøc Y tÕ thÕ giíi, t¹i ViƯt Nam, tû lƯ bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ 0,12% Với tính chất bệnh mãn tính, kéo dài gần nh suốt ®êi, l¹i kÌm theo nhiỊu biÕn chøng nguy hiĨm nh− béo phì, tăng huyết áp, tăng lợng lipit máu, bệnh tim mạch [1], nên ĐTĐ không làm giảm chất lợng sống ngời bệnh, mà gây gánh nặng mặt kinh tế làm giảm lực lợng lao động xã hội chi phí tốn cho điều trị bệnh Với lí ĐTĐ vấn đề cần đợc quan tâm đầu t nhiều Trên giới, có nhiều nghiên cứu hệ proteome bệnh nhân ĐTĐ type Các công bố cho thấy mức độ biểu cđa c¸c protein nh− haptoglobulin, complement component 3, complement component 4, alpha2-HS glycoprotein, Alpha 1B-glycoprotein, Alpha-1antichymotrypsin, Apolipoprotein AI, Apolipoprotein B100, Factor H, Pro-platelet basic protein, Serine (hc cysteine) proteinase Inhibitor clade A, Serine (hc cysteine) proteinase Inhibitor clade C, Vitronectin precursor, Fibronectin, C1 inhibitor, Alpha-2 macroglobulin cã sù thay ®ỉi bệnh nhân ĐTĐ type [10] Việt Nam, ĐTĐ type đợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nh quan hệ nồng độ CRP (C reactive protein) víi BMI (body mass index), hay giá trị HBA1C huyết chẩn đoán ĐTĐ [5] Tuy nhiên, phơng pháp chẩn đoán bệnh thờng dựa vào nồng độ đờng huyết bệnh thờng đợc phát nồng độ đờng máu tăng Hệ thống dự phòng, chẩn đoán bệnh sớm cha đợc hoàn thiện Do đó, năm có 70% bệnh nhân không đợc phát điều trị Vì vậy, việc tìm kiếm phơng pháp chẩn đoán sớm bệnh ĐTĐ type dựa thị phân tử cần thiết bệnh nhân ĐTĐ type 2, nồng độ glucose máu tăng cao gây nên bất thờng trình glycosyl hóa protein enzyme huyết [2] Vì vậy, có khả sử dụng glycoprotein huyết nghiên cứu chẩn đoán Trong báo trình bày kết nghiên cứu dùng concanavalin A (Con A) làm chất lực để thu nhận glycoprotein huyết ngời Các glycoprotein tiếp đợc tiến hành điện di hai chiều phân tích hệ thống sắc ký lỏng kết hợp khối phổ liên tiếp, nhận dạng so sánh ngời bình thờng bệnh nhân ĐTĐ type i phơng pháp nghiên cứu VËt liƯu Hut lÊy tõ c¸ thĨ gåm nam nữ (4 ngời bình thờng, khỏe mạnh bệnh nhân ĐTĐ type 2, bệnh nhân §T§ type cã ®é ti tõ 46 - 69 tuổi, thời gian mắc bệnh từ 20 năm, ngời bình thờng có sức khỏe tốt, biểu mắc bệnh gì, có độ tuổi từ 27 - 55), đợc chia nhỏ bảo quản - 25oC đến sử dụng Công trình đợc hỗ trợ kinh phí đề tài 46-RF1 (Quỹ nghiên cứu Việt Nam - Thụy Điển) 90 Các hóa chất có độ tinh cần thiết: methanol, acetonitrile (ACN) đợc mua tõ J.T Barker (Pittsburgh, Mü); formic acid (FA), trifluor acetic acid (TFA) mua cña Fluka (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Switzerland); dithiothreitol (DTT), iodoacetamide (IAA), enzim trypsin, ®−êng methyl alpha-D-glycopyranoside mua tõ Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Mü); Agarose bound Concanavalin A mua tõ Amersham Bioscience, GE C¸c hãa chÊt dïng cho ®iÖn di mua tõ Bio-Rad (Hercules, Mü) Thu nhËn glycoprotein sắc ký lực với Con A Glycoprotein huyết đợc thu nhận qua cột sắc ký lực Con A theo quy trình [8] 200 àl huyết đợc hòa 10 lần thể tích đệm cân đa lên cột sắc ký với tốc độ dòng khỏi cột 0,12 ml/phút Sau 15 phút, phần không bám cột đợc rửa 10 ml đệm cân Thành phone glycoprotein bum turn cột A đợc ml dung dịch mẫu chøa 0,3 M methyl-α-D-glucopyranoside §iƯn di hai chiỊu (2DE) Hỗn hợp glycoprotein (160 àg) sau qua cột sắc ký lực đợc tủa acetone lạnh với tỷ lệ mẫu/acetone:1/3 (v/v) -20oC qua đêm sau đợc hòa lại 125 àl dung dịch rehydration (8 M Urea, 2% CHAPS, ®Ưm 0,8% IPG pH 4-7, 13 mM DTT) Hỗn hợp mẫu đợc rehydrate hóa strip cố định (7 cm, pH 4-7; Bio-Rad, Mỹ) 12 h Quá trình điện di đẳng điện đợc tiến hành hệ thống PROTEAN IEF cell (Bio-Rad, Mỹ) theo quy trình hớng dẫn nhà sản xuất Sau đó, strip đợc khử đệm cân (đệm 50 mM Tris-HCl pH 8,8, M Urea, 30% Glycerol, 2% SDS, 1% DTT) alkyl hoá đệm cân (Urea 6M, SDS 2%, Tris-HCl pH 8,8 nång ®é 0,375M, Glycerol 20% IAA 40 mg/ml) Các glycoprotein đợc phân tách chiều hai gel SDS-PAGE 12,6% sử dụng hƯ thèng ®iƯn di Mini PROTEAN Cell (Bio-Rad, Mü) Gel đợc nhuộm dung dịch Commassie Brilliant Blue R-250 (CBBG) Bản gel đợc quét phân tích hình ¶nh b»ng phÇn mỊm Quantity One v 1.8 Thđy phân glycoprotein gel dung dịch Hỗn hợp glycoprotein đợc thủy phân trypsin theo qui trình đợc mô tả [8] (1 phần đợc thủy phân dung dịch để nhận dạng tổng thể, phần chạy 2DE) Trypsin đợc bổ sung vào dung dịch với tỷ lệ enzyme: chất 1:50 ủ qua đêm 37oC LC MS/MS nhận dạng protein Hỗn hợp peptide sau thủy phân đợc phân tích hƯ thèng s¾c ký láng nano (nanoLC Packing, Dionex, Netherland) kết nối khối phổ liên tục LC/MS/MS Các protein đợc nhận dạng thông qua phần mềm MASCOT v.1.4 (MatrixScience Ltd., London, UK) sở liệu NCBInr Các tham số tìm kiếm đợc thiết lập gồm: liệu protein Homo sapiens, enzyme thủy phân trypsin, sửa đổi cố định biến đổi đợc thiết lập tơng ứng carbamidomethyl (C) oxidation (M), sai số mảnh peptide phổ MS/MS 0,5 Dalton ii Kết thảo luËn Thu glycoprotein qua cét Con A ChÊt ¸i lùc sư dơng thÝ nghiƯm nµy lµ Con A, mét lectin cã ¸i lùc víi c¸c gèc alpha mannose, thành phần tơng đối phổ biến glycoprotein loại N-linked glycan Nh− vËy nÕu cho dung dÞch huyÕt qua cột glycoprotein có lực với Con A đợc giữ lại cột, protein khác bị loại bỏ Các glycoprotein bám cột tiếp đợc methyl--D-glucopyranoside Nồng độ protein huyết nguyên, protein bám cột sắc ký protein không bám cột đợc xác định tơng đối hai phơng pháp đo độ hấp thụ quang bớc sóng 280 nm quan sát gel SDS-PAGE 12,6% Kết nhận đợc cho thấy hàm lợng protein bám cột đợc xác định hai phơng pháp xấp xỉ 25% so với huyết nguyên thành phần protein bám cột mặt albumin protein có hàm lợng lín, chiÕm kho¶ng 50% protein hut tỉng sè, th−êng gây cản trở trình phân tích không bị glycosyl hóa Nh phơng pháp sắc ký lực với cột Con A hầu hết glycoprotein đợc thu nhận loại bỏ đợc protein hàm lợng lớn, làm giảm bớt độ phức tạp mẫu phân tích, tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu 91 Nhận dạng glycoprotein khối phổ liên tiếp MS/MS Các phân đoạn protein thu nhận từ sắc ký lực Con A đợc thủy phân trypsin phân tích hệ thống sắc ký lỏng hai chiỊu nano kÕt nèi khèi phỉ (LC MS/MS) ChØ nh÷ng protein có điểm số ion peptide lớn 30 đợc xác định Các protein nhận dạng kết tìm kiếm, đợc xác định glycoprotein so sánh với sở liệu glycoprotein SwissProt (http://us.expasy.org/sprot) Kết nhận dạng đợc 57 loại glycoprotein (số liệu cụ thể không trình bày báo này), bao gồm loại immunoglobin, thành phần bổ thể, protein liên kết, enzyme, thụ thể, có phù hợp hầu hết thành phần huyết Để so sánh mức độ biểu glycoprotein bệnh nhân ĐTĐ type ngời bình thờng tiến hành điện di hai chiều (2-DE) Xác định thay đổi hàm lợng glycoprotein huyết 2-DE Thành phần nồng độ glycoprotein bệnh nhân ĐTĐ type ngời bình thờng đợc so sánh điện di hai chiều với hỗ trợ phần mềm Quantity One v 4.4 Kết điện di 2DE glycoprotein huyết đợc thĨ hiƯn h×nh SDS-PAGE Mẫu bệnh Mẫu thường Hình Hình ảnh điện di hai chiều glycoprotein từ huyết ngời bình thờng bệnh nhân ĐTĐ type Bảng Các glycoprotein đợc nhận dạng khối phổ liên tiếp LC - MS/MS Số đăng ký NCBInr gi|2521983 Alpha-2-HS-glycoprotein Khối lợng (kDa) 40,1 gi|178855 Clusterin percursor 38,05 47/5 gi|4557325 Apolipoprotein E percursor 34 59/6 gi|11275306 Anti TNFα antibody light chain 23,65 353/6 gi|4826762 Haptoglobin alpha chain 16,8 545/28 STT 92 Tên glycoprotein Số mảnh peptide bắt cặp 75/2 Mức độ thay đổi Hình cho thấy khác biệt rõ rệt hệ glycoprotein huyết bệnh nhân ĐTĐ type ngời bình thờng Có nhiều điểm protein đợc phát hai điện di có vùng protein với vị trí tơng ứng - mẫu huyết bệnh nhân ĐTĐ type có nồng độ cao so mẫu đối chứng Các điểm đợc cắt ra, thủy phân enzyme trypsin nhận dạng khối phổ liên tiếp LC - MS/MS với hỗ trợ phần mềm Mascot v1.4, loại glycoprotein đợc nhận dạng với thông số nh: số đăng ký NCBInr, khối lợng, điểm số, trình tự peptide bắt cặp số mảnh peptide đợc nhận dạng đợc thể bảng Nh hệ thống LC/MS/MS nhận dạng đợc glycoprotein có nồng độ tăng hẳn huyết bệnh nhân ĐTĐ type Điều hoàn toàn phù hợp với sở lý thuyết ĐTĐ bệnh chuyển hóa mà hàm lợng glucose máu tăng cao, dẫn đến bất thờng trình glycosyl hoá [2] protein huyết Gen Haptoglobin (Hp) gen đa hình với kiểu hình khác (Hp 1-1, Hp 2-2, Hp 1-2), đợc biểu từ hai alen (Hp1 Hp2) gen Hp nằm nhiễm sắc thể 16q22 Protein Hp đợc tổng hợp gan giải phóng vào huyết thanh, liên kết lỏng lẻo với Hb, chuyển Hb đến protease gan để phân hủy Do đó, haptoglobin đa hình có liên quan đến phát triển nhiều bệnh viêm nhiễm bao gồm nhiễm trùng, chứng xơ vữa động mạch bệnh tự miễn [3] Kết điện di chiều (hình 1) cho thấy nồng độ haptoglobin alpha chain tăng cao hẳn huyết bệnh nhân §T§ type Alpha HS glycoprotein (α2-HSG) lµ mét glycoprotein hàm lợng cao huyết với nồng độ từ 300 đến 600 mg/l, đợc tổng hợp gan, cấu tạo hai chuỗi liên kết với cầu disulfua Gen 2-HSG định vị nhiễm sắc thể 3q27, nhạy cảm với bệnh ĐTĐ type bệnh trao đổi chất Protein 2-HSG đợc chứng minh có tơng tác với thụ thể insulin (IR), kìm hãm hoạt tính tyrosine kinase tự phosphoryl hóa [4] Sự thay đổi nồng độ 2-HSG quan sát thấy bệnh nhân ung th máu Hình nồng độ 2-HSG tăng lên rõ rệt bệnh nhân ĐTĐ type Kết thực bổ sung cho nghiên cứu trớc mối liên hệ gen 2-HSG với bệnh ĐTĐ type Clusterin glycoprotein, đợc mã hóa gen nằm nhiễm sắc thể số (8q21) Những nghiên cứu mRNA phát thay đổi hàm lợng protein giai đoạn bệnh lý mức độ in vitro chứng minh clusterin có vai trò tái sinh màng lipit, màng tế bào, điều khiển bổ thể trung gian phân giải màng, chu trình chết tế bào, tơng tác tế bào tế bào [7] Apolipoprotein E (Apo-E) protein mang có mặt huyết víi nång ®é mg/dl, gåm 299 amino acid, cã khèi l−ỵng xÊp xØ 34 kDa Apo E huyết đợc tổng hợp chủ yếu từ gan số quan khác nh não, lách, phổi, thợng thận, buồng trứng, thận, tế bào cơ, đại thực bào Apo-E tham gia vào trình vận chuyển cholesterol, phân phối lại cholesterol, chống lại phát triển thơng tổn Zhang cộng (2001) chứng minh thay đổi nồng độ Apo-E liên quan ®Õn bƯnh Alzheimer's [9] Anti TNFα antibody light chain lµ kháng thể kháng TNF Mà TNF protein đại thực bào tiết ra, gây nên trình hoại tử ung th Thông thờng, kháng thể xuất trạng thái bệnh lý, thấy ngời bình thờng [6] Kết nghiên cứu bớc đầu cho thấy nồng độ loại glycoprotein tăng cao huyết bệnh nhân ĐTĐ type Tuy nhiên, vai trß cđa Clusterin, Apolipoprotein E (Apo-E), Anti TNFα antibody light chain bệnh ĐTĐ type cha đợc biết rõ Để khẳng định thay đổi glycoprotein thị cho xuất bệnh cần nghiên cứu tiếp tục iii Kết luận Bằng sắc ký lực Con A để thu giữ glycoprotein, phân tách glycoprotein điện di hai chiều xác định nhờ hệ thống LC/MS/MS nhận dạng đợc 57 glycoprotein huyết bệnh nhân ĐTĐ type 2, cã glycoprotein (Alpha93 2-HS-glycoprotein, Clusterin percursor, ApolipoproteinE, Anti TNFα antibody light chain percursor, Haptoglobin) cã møc ®é biĨu hiƯn tăng rõ rệt huyết bệnh nhân ĐTĐ type so với ngời bình thờng Tài liệu tham khảo Korc M., 2003: Molecular & Cellular Proteomics, 2: 399-404 Lê Thị Thu cs., 2006: Hội nghị Khoa häc Hãa sinh Y D−ỵc häc, 99-108 Langlois M R., Delanghe J R., 1996: Clinical Chemisstry, 42(10): 1589-1600 Mathews S T et al., 2002: Mol Cell Endrocrinol., 264: 87-98 Nguyễn Thị Mai Phơng cs., 2006: Hội nghị Khoa học Hóa sinh Y Dợc học, 9299 Okubo A et al., 1990: Jpn J Cancer Res., 81(4): 403-409 Redondo M et al., 2000: Am J Pathol., 157: 393-399 Vũ Minh Thiết cs., 2006: Tạp chÝ C«ng nghƯ Sinh häc, 4(1): 13-22 Zhang D et al., 2001: Alzheimer's Reports, 4: 67-79 10 Zhang R et al., 2004: Proteomics, 4: 244256 Analysis of glycoproteins in serum of Type diabetes mellitus patients Nguyen Thi Minh Phuong, Tran The Thanh, Nguyen Bich Nhi, Phan Van Chi summary Type diabetes mellitus is a metabolic disorder that is primarily characterized by insulin resistance This disease is not infectious but common in the world Type diabetes mellitus may lead to many dangerous complications such as diabetic retinopathy, possible blindness, risk of heart stroke, diabetic neuropathy, chronic diarrhea, kidney failure Recently, many investigations have been carried out to search for effective therapies which can then be used to diagnose and cure this disease However, most of known therapies are mainly based on measurement of blood glucose levels, which does not allow detecting the early stage of diabetes disease To overcome this disadvantage, biomarkers, that are very promising factor to early prognosis of type diabetes mellitus, have recently been considered and searched In this study, such biomarkers were looked for by employing proteomics tools Lectin concanavalin A (ConA) was used to receive glycoproteins from human serum These collected glycoproteins were then digested and analyzed by nanoLC coupled with ESI MS/MS Afterward, 57 glycoproteins were identified In addition, glycoprotein expression level of the patients was compared with that of healthy individuals by using 2-D electrophoresis technique As a result, expression of five proteins (haptoglobin alpha chain, alpha-2-HS-glycoprotein, clusterin percursor, Apolipoprotein E percursor, Anti TNFα antibody light chain) increased significantly Key words: 2-D electrophoresis, Concanavalin A, glycoprotein, marker, type diabetes mellitus, nano chromatography-tandem mass spectrometry (nanoLC-MS/MS) Ngµy nhËn bµi: 27-3-2007 94 ... phần huyết Để so sánh mức độ biểu glycoprotein bệnh nhân ĐTĐ type ngời bình thờng tiến hành điện di hai chiều (2- DE) Xác định thay đổi hàm lợng glycoprotein huyết 2- DE Thành phần nồng độ glycoprotein. .. Sù thay ®ỉi nång ®é cđa 2- HSG quan sát thấy bệnh nhân ung th máu Hình nồng độ 2- HSG tăng lên rõ rệt bệnh nhân ĐTĐ type Kết thực bổ sung cho nghiên cứu trớc mối liên hệ gen 2- HSG với bệnh ĐTĐ type. .. di hai chiỊu glycoprotein tõ hut cđa ng−êi b×nh thờng bệnh nhân ĐTĐ type Bảng Các glycoprotein đợc nhận dạng khối phổ liên tiếp LC - MS/MS Số đăng ký NCBInr gi |25 21983 Alpha -2- HS-glycoprotein