Là trực khuẩn gram âm không sinh bào tử. Hiếu khí hoặc kị khí tùy ý Có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37o C trong 2448 giờ Nhiệt độ phát triển: ()2 50o C pH:4,49,0 Nhiễm trong nước hoặc thực phẩm Coliforms được xem là nhóm vsv chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vsv khác.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM Khoa cơng nghệ thưc phẩm QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS ĐẶC ĐIỂM COLIFOMRS • • • • • • Là trực khuẩn gram âm khơng sinh bào tử Hiếu khí kị khí tùy ý o Có khả lên men lactose sinh acid sinh 37 C 24-48 o Nhiệt độ phát triển: (-)2- 50 C pH:4,4-9,0 Nhiễm nước thực phẩm Coliforms xem nhóm vsv thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay mẫu môi trường dùng để thị khả diện loại vsv khác Coliforms gồm nhóm : echerichia enterobacter coliforms klebsiella citrobacter ĐỊNH NGHĨA COLIFORMS E.Coli Coliform phân Coliforms phân + IMViC Coliform chịu nhiệt Coliform tổng số Môi trường thiết bị VRB ( Violet Red Bile Agar) Cao nấm men 3g Peptone hay gelysate 7g NaCl 5g Muối mật 1,5g Lactose 10g Neutral red 0,03g Crystral violet 0,002g Agar 15g Nước cất lít Hịa tan thành phần nước đ/c pH 7,4 ± 0,2 Đun sôi 2p, Không hấp khử trùng, làm MT đổ đĩa BGBL ( Brilliant Green Bile Lactose Broth ) Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nước cất lít Hịa tan pepton lactose vào 500ml nước cất, mật bò khoảng 200kl brilliant green khoảng 100ml nước Trộn dd đạt V cuối 1lit1, chỉnh pH MT khoảng 7,4 Rót vào ống nghiệm chứa ống Durham 10ml MT BGBL Hấp 110 oC 15p, pH 7,2 ± 0,2 25 oC - Tủ ấm 37±1 C ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIẾM KHUẨN LẠC NGUYÊN TẮC Dựa vào lên lên men đường lactose mơi trường thích hợp (thạch Violet red bile) 37 C 24 Sau khẳng định lại môi trường canh Brilliant Green Bile Salt Coliforms sinh khí mơi trường 37 C 24 PHÂN TÍCH Sử dụng phương pháp đỗ đĩa Ủ 370C, 24h Thể tích mẫu sử dụng: ml Đổ mơi trường VRB 10 – 15ml, để đông Đọc kết Đếm đĩa có khuẩn lạc sau 24 ni cấy Khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính > 0,5 mm, có vịng tủa muối mật KHẲNG ĐỊNH Cấy riêng khuẩn lạc nghi ngờ loại vào ống nghiệm chứa môi trường canh BGBL có ống Durham, ủ 37 C 24 Phản ứng coi dương tính có tạo khí dù ống nghiệm Sử dụng môi trường BGBL - (+) vi khuẩn tăng trưởng làm đục MT & sinh TÍNH KẾT QUẢ Tính giá trị trung bình từ độ pha loãng để qui số coliform g mẫu ∑C Coliform tổng số = (cfu/ml) hay (cfu/g) Trong đó: C: tổng số khuẩn lạc điếm n1: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ n2: Số đĩa giữ lại độ pha lỗng thứ hai V: thể tích mẫu d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ xR V x (n1 + 0,1 x n2) x d ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Phương pháp MPN dựa nguyên tắc xác suất thống kê phân bố vsv độ pha loãng khác mẫu Mỗi độ pha lỗng ni cấy lặp lại nhiều lần ( 3- 10 lần) Số lần dương tính ghi nhận so sánh với bảng thống kê => giá trị ước đoán số lượng vsv mẫu Các độ pha loãng chọn lựa cho lần lặp lại có số lần dương tính có số lần âm tính Hệ thống MPN: Hệ thống ống Hệ thống 15 ống Đặc điểm: Vi sinh vật mục tiêu phải có biểu đặc trưng mơi trường nuôi cấy : Sự tạo : Coliforms Sự đổi màu : S aurius Cho phép định lượng mật độ vsv thấp thể tích mẫu lớn Hệ thống MPN /g (ml) MƠI TRƯỜNG HĨA CHẤT CỒN 70 Đ Thiết bị + Tủ cấy vô trùng + Nồi hấp + Tủ ấm HCL 10% + Máy dập mẫu + Máy trộn mẫu + Cân kỹ thuật NAOH 10% QUY TRÌNH THỰC HIỆN - Bước : Chuẩn bị mẫu Cân 10g mẫu cho vào túi dập mẫu ( mẫu rắn) 10ml mẫu ( mẫu lỏng ) cho vào bình tam giác chứa 90ml dd SPW vô trùng , đồng mẫu phút Bước : Chuyển 1ml dung dịch mẫu pha loãng nồng độ 101 , 10-2, 10-3 vào ống nghiệm có chứa 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ống nghiệm Durham cho ống Bước : + Sau 48 - ống nghiệm ủ 37o C Ghi nhận ống LSB sinh canh trường đục + Kết luận ống LSB dương tính (+) Bước : Chuyển 1ml từ ống nghiệm LSB ( + ) nồng độ vào ống nghiệm có chứa 10ml canh BGLB ủ 37 O C , 48 10 ML BGLB Bước : + Ghi nhận số ống sinh canh trường đục độ pha loãng + Kết luận ống BGLB ( + ) Bước : Tính kết - Từ kết thí nghiệm ta có: • Nồng độ 10-1: có ống 10-2: có ống BGLB(+) • Nồng độ BGLB(+) • Nồng độ 10-3 : khơng có ống BGLB(+) - Tra bảng Mac Crady : Tra bảng MPN/100ml ta có kết : 430 coliform tổng / 100 ml mẫu ... echerichia enterobacter coliforms klebsiella citrobacter ĐỊNH NGHĨA COLIFORMS E.Coli Coliform phân Coliforms phân + IMViC Coliform chịu nhiệt Coliform tổng số Môi trường thiết bị VRB ( Violet Red Bile... nước thực phẩm Coliforms xem nhóm vsv thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay mẫu môi trường dùng để thị khả diện loại vsv khác Coliforms gồm nhóm : echerichia enterobacter coliforms klebsiella... tăng trưởng làm đục MT & sinh TÍNH KẾT QUẢ Tính giá trị trung bình từ độ pha loãng để qui số coliform g mẫu ∑C Coliform tổng số = (cfu/ml) hay (cfu/g) Trong đó: C: tổng số khuẩn lạc điếm n1: Số