ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC XUẤT LỚN NHẤT (MPN)

 Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính..  Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê => giá

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ SÁC XUẤT

LỚN NHẤT (MPN)

GVHD :NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

NỘI DUNG

I ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH: COLIFORMS

II PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG : MPN

III QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

IV VÍ DỤ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VSV TRONG NƯỚC

I COLIFORMS

 Coliforms là những trực khuẩn gram (-)

 Không sinh bào tử

 Hiếu khí hoặc kị khí tùy ý

 Có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 0c trong 24- 48h

 Coliforms được xem là nhóm vsv chỉ thị

echerichia

citrobacter

klebsiella enterobacter

Coliforms gồm 4 nhóm :

Echerichia Coli Citrobacter Freundii Bacteria

Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase Enterobacter aerobacter

Coliforms phân + IMViC

Là coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ ở 44.5 0c /24h trong tryptone

II PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER

 Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vsv trong các

độ pha loãng khác nhau của mẫu.

 Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần ( 3- 10 lần).

 Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương

tính và có một số lần âm tính.

 Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê => giá trị ước đoán

số lượng vsv trong mẫu.

Sự tạo hơi : Coliforms

Sự đổi màu : S aurius

Cho phép định lượng được mật độ vsv thấp trong thể tích mẫu lớn

HỆ THỐNG MPN /g (ml)

La

ury

l

Sulfa

te

T rypto

ne

Broth

g

( pre

ca

nh

Brillia

nt

Gree

n

Lacto

se

Sa

lt (

BGLB

–

48

giờ

a :

kh

ả n ăn

g

lê

n m en

sinh hơ

i ở

mô

i

trư ờng

nuô

i c ấy

ủ

ở 37

oC –

48 g

iờ

sử d ụn

g t est

đoá

n

ch ừn

g : để

h h

ơi

( c

ác ống

dư ơn

g t ín

h )

– q ua cá

c

ốn

g D uh arm

đư

ợc hơ

i

sin

h r

a đ ẩy

lê

n t rê

n

III QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

- Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng một thể tích chính xác ở dung dịch mẫu ở

3 nồng độ bậc 10 liên tiếp, mỗi mức 3 hoặc 5 ống nghiệm ; ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

- Kết quả nhìn thấy chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm

định ( sinh hơi, đổi màu, đục, …)

- Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng Tra bảng Mac Crady rồi suy ra mật độ vi sinh vật

MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu

Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng

MÔI TRƯỜNG

HÓA CHẤT

CỒN 90 ĐỘ VÀ 70 ĐỘ

HCL 10%

NAOH 10%

QUY TRÌNH THỰC HIỆN

- Bước 1 : Chuẩn bị mẫu

Cân 10g mẫu cho vào túi dập mẫu ( nếu là mẫu rắn) hoặc 10ml mẫu ( mẫu lỏng ) cho vào bình tam giác chứa 90ml dd SPW

đã vô trùng , và đồng nhất mẫu trong 1 phút

Bước 2 : Chuyển 1ml dung dịch mẫu pha loãng ở mỗi nồng độ 10-1 , 10-2, 10-3 vào ống nghiệm có chứa 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, mỗi ống nghiệm cho 1 ống Durham

Bước 3 :

+ Sau 48 giờ - các ống nghiệm được ủ ở 37o C - Ghi nhận các ống LSB sinh hơi và canh trường đục

+ Kết luận các ống LSB dương tính (+)

Bước 5 :

+ Ghi nhận số ống sinh hơi và canh trường đục ở mỗi độ pha loãng

+ Kết luận các ống BGLB ( + )

- Tra bảng Mac Crady :

Tra bảng MPN/100ml ta có kết quả : 43 coliform tổng /

100 ml mẫu

IV.Phân tích coliforms trong mẫu nước

 giới thiệu về vsv trong mẫu nước

 Nước, dung môi phổ biến, là điều cần thiết cho cuộc sống: nước sạch để tắm, uống và nấu

ăn Thật không may, nhiều tác nhân gây bệnh lây truyền qua nguồn nước Một số các loài gây bệnh như bại liệt, thương hàn, tả, viêm gan, Bệnh vi khuẩn Shigella, Salmonella

 Coliforms có đầy đủ các tiêu chuẩn và là những sinh vật chỉ thị chuẩn được sử dụng để kiểm tra tình trạng ô nhiễm sinh học của nước.

 Theo tiêu chuẩn của EPA thì nước uống và nước trong hồ bơi phải có độ tinh khiết cao nhất

Không thể có nhiều hơn một mẫu dương tính (> 1 coliform/100 ml) trong 40 mẫu được kiểm tra trong một tháng và nồng độ coliform phân phải bằng không.

 THỦ TỤC PHÂN TÍCH NƯỚC

Giai đoạn 1:

Chuẩn bị:

• 1 mẫu nước

• 8 đĩa petri vô trùng

• 2 chai thạch Agar tan chảy (PCA, 100 ml / chai) - trong nước tắm 50 ° C

• 15 ống Lactose Lauryl Tryptose Broth(LLTB, với ống Durham)

• Pipett vô trùng

Đổ dd PCA từ nước tắm (mỗi 1 chai 4 đĩa) vào 8 đĩa petri đã được đánh dấu Sau khi đổ, nhẹ nhàng xoay mỗi đĩa (đảo chiều một vài lần) để pha trộn các chất mẫu hoàn toàn với

môi trường

Khi các đĩa đã đông cứng, đảo ngược các đĩa và ủ chúng ở 30 ° C

Dán nhãn 15 ống LLTB cho năm

độ pha loãng (mỗi độ pha loãng

3 ống).

Cấy 1ml hoặc 0,1 ml từ chai pha loãng thích hợp vào mỗi ống.

Ủ tất cả các ống ở 37 ° C trong 1-2 ngày (Nhiệt độ tiêu chuẩn là 35 độ C, nhưng 37 ° C cũng được ) Các ống sẽ được làm lạnh 2 ngày trước khi tiến hành

giai đoạn tiếp theo.

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

Giai đoạn 2:

• 15 ống nghiệm cho mỗi môi trường Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) Broth và EC Broth (với ống Durham cho mỗi ống

Tính toán số lượng có thể xảy

ra nhất của vi khuẩn/ ml mẫu bằng cách sử dụng bảng MPN

Kết quả trong BGLB

Kết quả tăng trưởng điển hình quan sát cho canh EC

 Ghi lại số lượng tích cực (tăng trưởng và khí) như trong giai đoạn

trước.

 Ghi kết quả trên bảng dữ liệu Đối với các ống canh BGLB, tính toán

xác nhận, số lượng có thể xảy ra nhất của vi khuẩn / ml mẫu Đối với các ống canh EC, tính toán xác nhận, số lượng có thể xảy ra nhất của vi khuẩn phân / ml mẫu Ghi lại các giá trị trên bảng dữ liệu.

 Từ một ống canh BGLB pha loãng cho thấy sự tăng trưởng và sinh khí,

các đường sọc trên đĩa thạch EMB cho thấy sự phân lập của các khuẩn lạc Làm tương tự cho các canh EC Ủ các đĩa ở 37 ° C trong 1-2 ngày.

quan sát trên mỗi thiết bị như trong thí nghiệm trước đây Mỗi cô lập phải lên men lactose thành acid và khí đốt có thể nhìn thấy để được coi là một coliform.

The end