ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ Nhóm 03 NỘI DUNG GiỚI THIỆU SƠ LƯỢC E.COLI  PHƯƠNG PHÁP MPN & QUI TRÌNH THỰC HIỆN www.themegallery.com LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI  E.coli trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình từ đến 3µm x 0,5µm; điều kiện khơng thích hợp (ví dụ mơi trường có kháng sinh) vi khuẩn dài sợi Rất chủng E.coli có vỏ, hầu hết có lơng có khả di động  Escherichia coli Theodore Escherich (1857-1911), nhà vi khuẩn học người Đức, phát lần năm 1885 Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột Trong loài thuộc chi này, E.coli chọn làm điển hình có vai trò quan trọng y học ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI  Tính chất hóa sinh  E.coli có khả lên men nhiều loại đường có sinh Hầu hết E.coli lên men lactose sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) khơng lên men chậm  E.coli có khả sinh indole Không sinh H2S Không sử dụng nguồn carbon citrate môi trường Simmons Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 âm tính, sau 48 dương tính ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI  Tính chất nuôi cấy  E.coli phát triển dễ dàng mơi trường ni cấy thơng thường Một số phát triển môi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng Hiếu, kỵ khí tùy ý Có thể phát 0 triển nhiệt độ từ 5-50 C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37 C  Trên mơi trường thạch thường, sau khoảng đến 10 giờ, dung kính lúp quan sát khuẩn lạc Trên môi trường phân lập, tùy theo chất thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như thạch lactose) màu đỏ (như thạch MacConkey) ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI THẠCH MACONKEY ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI  Khả gây bệnh  E.coli vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng đầu vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu nguyên gây nhiễm khuẩn huyết, nguyên thường gặp viêm màng não, viêm phổi trẻ sinh E.coli gặp nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng bỏng ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO PHƯƠNG PHÁP MPN & QUY TRÌNH THỰC HIỆN ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO PHƯƠNG PHÁP MPN  Nguyên tắc  Phương pháp MPN ( Most Probable Number) dựa vào nguyên tắc mẫu pha loãng thành dãy thập phân (hai nồng độ khác 10 lần); mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp ủ ống nghiệm chứa mơi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham  Theo dõi sinh đổi màu để định tính diện ống dương tính (+) Ghi nhận số ống nghiệm dương tính nồng độ pha loãng dựa vào bảng MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng diện 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO THỬ PHẢN ỨNG SINH HỐ Thử nghiệm khơng sinh Acetoin ( thử nghiệm Voges – Proskauer) (VP)  Nguyên tắc: - Phản ứng thử VP dùng để phân biệt vi sinh vật có khả sinh Acetoin ( mơi trường trung tính) - Cho vào ống nghiệm chứa mơi trường MRVP khoảng 0,6ml dung dịch α-napthol 0,2ml dung dịch kalihydroxyt 40%, lắc đều, để yên 2h - Thuốc thử: -Naphtho (6 giọt), NaOH 40% KOH 40% (2 giọt) - Kết quả: + dương tính dung dịch mơi trường có màu đỏ  vi sinh vật tạo Acetoin + âm tính dung dịch mơi trường khơng đổi màu đỏ  khơng có vi sinh vật tạo Acetoin ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ Phản ứng VP (Voges Proskauer) ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ Phản ứng Citrat  Nguyên tắc: Những vi sinh vật có khả sử dụng muối Citrate Amonium tạo sản phẩm biến dưỡng CO2, NH2, Na2CO3 làm kiềm hóa môi trường  chuyển thị Bromothymol Blue từ màu xanh sang xanh dương - Chất thị: Bromothymol Blue có mơi trường simmon citrate - Kết quả: + dương tính mơi trường ống chứa mẫu chuyển từ xanh sang xanh dương + âm tính mơi trường ống chứa mẫu khơng đổi màu ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ Phản ứng Citrat LOGO KẾT LUẬN Sau thử nghiệm kiểm tra E.coli: • • • Thử nghiệm khả sinh Indole : dương tính(+) Thử nghiệm khả sinh Acid : dương tính(+) Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP) : âm tính (-) • Thử nghiệm khả biến dưỡng Citrate: âm tính (-) -> Kết luận vi sinh vật kiểm tra E.coli (IMViC + + - -) www.themegallery.com LOGO THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ  Kết quả: Ống nghiệm cho kết EC (+), khuẩn lạc E Coli giả định môi trường EMB cho kết thử nghiệm IMViC (++ ) ống nghiệm có chứa E Coli (+) Từ số lượng ống có E Coli (+) độ pha lỗng mẫu tra bảng MPN để tính mật độ vi sinh vật mẫu biểu diễn dạng trị số MPN/g hay MPN/ml ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI TRONG NƯỚC GiẢI KHÁT  Lấy mẫu nước giải khát vào buổi sáng quán nước giải khát địa bàn thành phố Hồ Chí Minh, loại nước đóng chai khơng đóng chai cho vào bao nilon vơ trùng, sau mang phòng thí nghiệm  Tiến hành phân tích định lượng theo qui trình phương pháp MPN www.themegallery.com LOGO ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI TRONG NƯỚC GiẢI KHÁT Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng để có nồng độ pha loãng 10 -1 , 10-2 , 10-3 Bước 2: Chuyển 1ml dung dịch pha loãng nồng độ liên tiếp vào ống nghiệm có 10ml canh LSB, nồng độ lặp lại ống, ủ 37 ± C, 48 Mỗi ống nghiệm cho ống Durham Bước 3: Ghi nhận ống sinh canh trường đục Kết luận ống LSB (+) www.themegallery.com LOGO ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI TRONG NƯỚC Bước 4: Chuyển 1ml LSB (+) sang canh EC ủ 44,5 ± 0,2 C, 24 Bước 5: Ghi nhận ống sinh canh trường đục Kết luận ống EC (+) Bước 6: Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ ống (+) môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB/ Endo ủ đĩa 37 C, 24 Bước 7: Chọn khuẩn lạc E Coli giả định EMB/ Endo cấy vào TSA/ BHI Ủ qua đêm Bước 8: Cấy chuyền từ môi trường TSA/ BHI vào mơi trường thử nghiệm sinh hóa Trypton Broth, MR-VP , SC ủ 44,5 ± 0,2 C, 24 www.themegallery.com LOGO Kết khảo sát nước uống Lavie Mật độ nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát (MPN/100ml) 0 21 56 39 105 64 296 240 www.themegallery.com LOGO Kết khảo sát nước có gá Pepsi Mật độ nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát (MPN/100ml) 0 21 56 28 105 64 296 240 www.themegallery.com LOGO Kết khảo sát nước có cồn Mật độ nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát (MPN/100ml) 0 21 56 23 105 48 296 150 www.themegallery.com LOGO ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI TRONG NƯỚC GiẢI KHÁT  Từ kết cho thấy hầu hết mật độ cao khả phát lớn Do nguyên nhân gây nhiễm mật độ cao phân bố vi khuẩn 100ml mẫu đồng Còn gây nhiễm mật độ thấp phân bố mẫu khơng đồng đều, có nơi có, có nơi khơng, nên hút có có, có khơng  Những kết khảo sát bước đầu phản ánh tình trạng nhiễm vi sinh vật loại nước giải khát địa bàn thành phố Hồ Chí Minh đến mức báo động www.themegallery.com LOGO ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI TRONG NƯỚC GiẢI KHÁT Từ kết cần: -Khảo sát phạm vi rộng lớn không nước giải khát mà có loại thực phẩm khác -Nghiêm cứu xem nguồn xâm nhập chúng từ đâu để có biện pháp khắc phục www.themegallery.com LOGO LOGO Thank You ! ... E.coli gặp nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng bỏng ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO PHƯƠNG PHÁP MPN & QUY TRÌNH THỰC HIỆN ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO PHƯƠNG PHÁP MPN. .. chi này, E.coli chọn làm điển hình có vai trò quan trọng y học ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI. .. màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như thạch lactose) màu đỏ (như thạch MacConkey) ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN LOGO GIỚI THIỆU VỀ E.COLI THẠCH MACONKEY ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP