Định lượng E. Coli bằng phương pháp MPN theo TCVN 7924 – 3 – 2008

Khi bị nhiễm E.Coli sẽ gây ngộ độc cấp tính, tiêu chảy, mất nước có thể dẫnđến tử vong nếu không can thiệp kịp thời.Vi khuẩn nguy hiểm này cũng tiềm ẩn khắp nơi:đất, nước bị ô nhiễm được

MỤC LỤC

1. Đặc điểm của vi khuẩn E.coli:

1.1. Giới thiệu về vi khuẩn E.coli:

Escherichia coli do Theodore Escherich(1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, pháthiện lần đầu tiên năm 1885 Chi Escherichia thuộc họ

vi khuẩn đường ruột Trong các loài thuộc chi này,E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quantrọng nhất trong y học

E.coli là một trong những thành viên chínhcủa hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng làcăn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó cónhững bệnh nó là căn nguyên đứng đầu

E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực visinh học nói riêng và sinh học nói chung

Đường tiêu hóa của chúng ta, đặc biệt là ruột già, chứa hàng tỉ vi khuẩn, với hơn 500loài khác nhau, nhưng không phải loài nào cũng gây hại và thậm chí chúng đang bảo vệchúng ta khỏi sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác Escherichia coli (còn gọi là E.coli) là một trong những vi khuẩn ký sinh trong đường ruột và chúng ta thường không biết

sự có mặt của nó có ở đó Theo các nhà khoa học, E coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm

ưu thế nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật Vi khuẩn này cần thiếttrong quá trình tiêu hóa thức ăn Bình thường chúng không gây hại, chỉ khi bị thải ra môitrường bằng đường phân, chúng trở nên gây độc tính và khi quay trở lại cơ thể con ngườibằng đường ăn uống qua thực phẩm bị ô nhiễm chúng thường gây khó chịu và đau bụng, rốiloạn tiêu hóa Khi bị nhiễm E.Coli sẽ gây ngộ độc cấp tính, tiêu chảy, mất nước có thể dẫnđến tử vong nếu không can thiệp kịp thời.Vi khuẩn nguy hiểm này cũng tiềm ẩn khắp nơi:đất, nước bị ô nhiễm (được sử dụng để rửa thực phẩm) và chúng có trong móng tay, bàn taycủa những người chế biến thực phẩm không rửa sạch tay E.Coli là trực khuẩn (hình que) có

700 loại, thường sống ở mọi môi trường, nhiều trong ruột non, ruột già của con người vàđộng vật

1.2. Nguồn gốc và tên gọi:

Năm 1885, tại München, một bác sĩ nhi khoa là Theodor Escherich rất quan tâm đếnphát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert kock về vi khuẩn Cùng với việc nghiêncứu bệnh tiêu chảy,Escherich lưu ý tới một vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thínghiệm lâm sàng.Vi khuẩn do Escherich phát hiện từ trong tã lót của trẻ em được công bốvới tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giớichuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá Tuy nhiên, vikhuẩn được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sauđó.Đến năm 1991, vi khuẩn được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.(viết tắt

là E Coli ) Việt Nam E coli còn được gọi là vi khuẩn đại tràng, hoặc trực khuẩn đại tràng.Những chủng nguy hiểm của E.coli thường là nguyên nhân của 80% số trường hợp nhiễmtrùng đường tiết niệu, bệnh có thể hủy hoại thận, và là nguyên nhân đứng hàng thứ hai vềgây bệnh viêm màng não và nhiễm trùng máu ở trẻ sơ sinh E.coli cũng đứng đằng sau nhiềubệnh truyền nhiễm liên quan đến thực phẩm khi người ta phát hiện loại khuẩn này cũng cótrong nhiều sản phẩm thịt và rau củ quả tươi sống từng được bón phân Đây cũng là loạikhuẩn lây nhiễm rất dễ dàng giữa người với người qua đường chân-tay-miệng…

1.3. Cấu tạo của vi khuẩn E.coli:

E.coli là trực khuẩn gram âm, có hai đầu tròn, kích thước từ 0,5→3 micromet Diđộng bằng tiêu mao, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul

1.4. Đặc điểm hình thái:

Là trực khuẩn Gram âm, di động, không sinh nha bào

Phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp37°C, phát triển được ở nhiệt độ từ 5-40°C, pH thích hợp là 7,0 - 7,2 Hiếu khí và kỵ khí tuỳtiện

Có trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải

Đi vào cơ thể theo phân người hoặc nhiễm vào thực phẩm

Gây nhiễm trùng đường tiết niệu, sinh dục, nhiễm trùng đường gan - mật, nhiễmkhuẩn vết thương, vết bỏng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêmmàng não mù ở trẻ sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết

1.5. Tính chất nuôi cấy:

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Một số có thểphát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tùy ý.Có thểphát triển ở nhiệt độ từ 5-40 oC.Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37oC Trong điều kiện thíchhợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môitrường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làmđục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có váng mỏng Những ngày sau,dưới đáy ống cóthể thấy lắng cặn.E.coli không mọc trên canh thang Selenit Trên môi trường thạch thường,sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã cóthể quan sát được khuẩn lạc.Sau 24 giờ khuẩnlạc có kích thước khoảng 1,5mm Hìnhthái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặpdạng R, hoặc M Trên môi trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu,E.coli có khuẩn lạcmàu vàng (như trên thạchlactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey) Không mọcđược trên môi trường SS Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sànglọc nhanh,như EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton.1.6. Phân loại:

E.coli được chia thành 5 loại:

Thử nghiệm IMViC: Dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác,gồm có các phản ứng.

Phản ứng sinh indol (I): E coli có indol (+)

Phản ứng đỏ metyl (M): E coli có phản ứng đỏ metyl (+)

Phản ứng Voges Proskauer (V): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả năng sinh ra

acetyl - metyl cacbinol E.coli có phản ứng Voges Proskauer âm tính.

Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (C) E.coli phản ứng citrat âm tính.

1.8. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố:

Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tố gâytan huyết và phù thủng

Độc tố của E.coli: Loại E.coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh hơn

loại không giáp mô Kháng nguyên K có 13 loại KA, KB, KL Ví dụ công thức kháng

nguyên của một E.coli là: O55K5H21F5.

Nội độc tố đường ruột: Gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt Cả hai loại này

đều gây tiêu chảy Loại chịu nhiệt ST (Thermostable): gồm các loại STa, STb Loại không

chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1, LT2.

Những dòng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều loại huyết thanh khác nhau

nhưng thường gặp nhất là các loại O6H16, O8H9, O78H12, O157

1.9. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn E.coli:

Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm theo độc tốcủa chúng E.coli gây tiêu chảy thường gặp các nhóm sau:

− Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các type thường gặp O26:B6, O44, O55:B5,

O112:B11, O124, O125:B5, O142 là nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi

− Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gây bệnh cho trẻ em, người lớn do tiết ra 2 độc tố

ruột ST và LT

o LT hoạt hóa men adenyl cyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP(cyclicadenozin 5’ monophosphat) Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl- và bicarbonat tách rakhỏi tế bào đồng thời ức chế Na+ bên trong tế bào Hậu quả là gây tiêu chảy mất nước

o Độc tố ST: hoạt hóa men Guanyl Cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’monophosphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước gây ra tiêu chảy

Những dòng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảy trầm trọng và

kéo dài

− Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những E.coli này bám lên niêm mạc và làm tróc niêm

mạc gây loét niêm mạc do đó gây tiêu chảy có đàm lẫn máu (giống Shigella) Các chủng này

có thể lên men hay không lên men đường lactose và có phản ứng lysin decarboxylaza âmtính Thường gặp các type O125, O157, O144…

− Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa gây tiêu chảy vừa là nguyên nhân gây

viêm đại tràng xuất huyết (hermorrhagic colilic) và làm tổn thương mao mạch gây hiệntượng sưng phù (ederma) rất nguy hiểm đến tính mạng (do biến chứng) Nhóm VETEC baogồm các type: O26, O11, O113, O145, O157 ; đây là ngoại độc tố vetec gây tiêu chảy Các biếnchứng trên do vi khuẩn tiết ra một trong 2 loại ngoại độc tố VT1 (verocytoxin) và VT2 gâytác động thần kinh

Gần đây người ta phát hiện chủng E.coli mới ký hiệu là E.coli O157:H7 Chủng này

đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gần đây (theo CDC, Centerfor Disease Control and prevention của Mỹ) :

Năm 1982, lần đầu tiên người ta ghi nhận được nguồn bệnh do E.coli O157:H7 Năm

1985, người ta nhận thấy triệu chứng hoại huyết có liên quan đến chủng O157:H7 Năm

1990, bùng nổ trận dịch từ nguồn nước nhiễm chủng E.coli O157:H7 Năm 1996, xảy ra trận

dịch khá phức tạp ở Nhật Bản do uống nước táo chưa diệt khuẩn

2. Tình hình ngộ độc E.coli hiện nay:

− Theo thống kê ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam: Mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500

vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 – 200 ca tử vong

− Bộ Y tế 30/6/2014: Toàn quốc ghi nhận có 90 vụ ngộ độc thực phẩm với 2636 người mắc,

2035 người đi viện và 28 trường hợp tử vong

− Nguyên nhân ngộ độc là do vi sinh vật, độc tố tự nhiên là 27 vụ (30%) và hóa chất

Trong đó: Một trong những loại ngộc độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường

gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli.

 Một số vụ tiêu biểu trong năm 2014:

• 1/06/2014: 170 công nhân Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nienhsing có biều hiện đau bụng,buồn nôn, phải nhập viên sau bữa trưa tại công ty Kết quả điều tra, xử lý chi cục An toàn vệsinh thực phẩm tỉnh Thái Bình xác định nguyên nhân khiến số công nhân trên phải nhập viện

là do ăn phải những suất cơm nhiễm vi khuẩn E.coli và Coliforms

• 24/09/2014: Vụ 114 người bị ngộ độc thực phẩm ở Gia Lai: Thịt bò nhiễm E.coli vượt quágiới hạn Kết quả xét nghiệm phát hiện mẫu nước nhiễm E.coli là 100 coliforms/100ml cao

gấp 100 lần giới hạn cho phép của Bộ Y tế Mẫu thịt bò có chỉ số E.coli/g là 6,68.105 caohơn giới hạn cho phép là 5.103.

phẩm

3. Các phương pháp phát hiện E Coli:

3.1. Phương pháp truyền thống:

• Đinh lương E Coli bằng phương pháp MPN

Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ

Hai hệ thống MPN

- Hệ thống 9 ống

- Hệ thống 15 ống

• Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Dùng để xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu

 Ưu điểm: Xác định được những tế bào sống

 Ưu điểm: Xác định được mật độ VSV cụ thể trong một thể tích mẫu lớn

 Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn

3.2. Phương pháp hiện đại:

Phương pháp PCR

Là một phương pháp để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hang triệu bảng sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

 Ưu điểm Thời gian cho kết quả nhanh

Nhận diện những VSV khó nuôi cấy Hóa chất có sẵn, dễ tồn trữ

Ít tốn kém về mặt nhân sự

 Nhược điểm Thực phẩm chứa chất ức chế, mật độ VSV thấp

Không phân biệt được tế bào sống và chếtPhương pháp ELISA

Là một kĩ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

 Ưu điểm Độ nhạy cao

Cho kết quả nhanh

 Nhược điểm Không phân biệt được tế bào sống và chết

 Ưu điểm: Dễ thao tác, cho kết quả nhanh chóng trong 24h

Tiết kiệm không gian ủ, bảo quảnThời hạn dùng lâu, không cần phương pháp khử trùng môi trường

4. Định lượng E Coli bằng phương pháp MPN theo TCVN 7924 – 3 – 2008

4.1. Phạm vi áp dụng:

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza bằng kỹ thuật cấy trong môi trường lỏng và tính số có xác suất lớn nhất (MPN) sau khi được ủ ở 37ºC rồi ủ tiếp ở 44ºC

Tiêu chuẩn có thể áp dụng cho:

− Các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi

− Các mẫu môi trường trong khu vực chế biến thực phẩm và vận chuyển thực phẩm.Phương pháp này thích hợp để định lượng các tế bào Escherichia coli mà có thể đã trải giai đoạn làm mất nước, đông lạnh, tiếp xúc với môi trường mặn (như nước biển) hoặc

bị hư hại do các chất tẩy rửa như các sản phẩm chứa clo

CẢNH BÁO: Một số chủng Escherichia coli không phát triển được ở 44ºC và cụ thể là các Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza như Escherichia coli O157 và một

số chủng E.coli gây bệnh khác bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này sẽ không phát hiện được.

4.2. Nguyên tắc:

Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một lượng xác định của huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống nghiệm1) chứa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép

Cấy một lượng xác định của mẫu thử nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc với một lượng xác định của huyền phù ban đầu trong trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống nghiệm1) chưa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ đơn

Sau đó, cấy các lượng xác định của các dung dịch mẫu thử pha loãng thập phân hoặc huyền phù ban đầu vào môi trường tăng sinh lỏng nồng độ đơn trong cùng điều kiện trên

Nuôi ấm các ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép và nồng độ đơn ở 37ºC trong

24 giờ Kiểm tra các ống này về sự sinh axit và cho thấy lên men lactoza

Từ mỗi ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc cho thấy có tạo thành axit sẽ được cấy truyền vào môi trường thạch trypton-mật-glucuronid

Thạch trypton-mật-glucuronid được ủ ở 44ºC trong khoảng từ 20 giờ đến 24 giờ Xác định trên môi trường thạch trypton-mật-glucuronid sự có mặt các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời, chứng tỏ có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza.

Số có xác xuất lớn nhất Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza [xem TCVN

6404 (ISO 7218)] được xác định theo số ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc được cấy truyền có sinh các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời trên thạch mật glucuronid.4.3. Bảng chuẩn bị thí nghiệm:

1 Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

2 Tủ ấm Có thể duy trì nhiệt độ ở 37ºC ± 1ºC và 44ºC ± 1ºC

3 Tủ sấy hoặc buồng sấy thông gió, hoặc tủ thổi không khí. Có thể duy trì được nhiệt độ từ 25ºC ± 1ºC đến 50ºC ± 1ºC

4 Tủ lạnh Dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị, có thể duy trì nhiệt độ ở 5ºC ± 3ºC.

7 Ống nghiệm Có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và

4.4. Môi trường nuôi cấy:

• Môi trường glutamate khoáng cải biến (môi trường tăng sinh chọn lọc)

Thành phần:

Sắt (III) amoni xytrat

Canxi clorua ngậm hai phân tử nước (CaCl2.2H2O)

Dikali hydro phosphat (K2HPO4)

Bromocresol tía

Amoni clorua

Nước

12,7 g20,0 g0,5 g0,04 g0,048 g0,04 g0,002 g0,002 g0,002 g0,2 g0,02 g0,02 g1,8 g0,02 g5,0 g

1000 ml

6,35 g10,0 g0,25 g0,02 g0,024 g0,02 g0,001 g0,001 g0,001 g0,1 g0,01 g0,01 g0,9 g0,01 g2,5 g

1000 ml

Mục đích của từng thành phần trong môi trường:

− Natri Glutamat , natri focmat: các chất dinh dưỡng cơ bản

− Lactoza: nguồn đường để E Coli lên men

− Ion Mg2+ , các vitamin (như acid nicotinic, acid pantothenic), axit amin (như L-xystin,

− L-(-)-axit aspactic, L(+)-arginin, Thiamin : giúp tăng tỳ lệ lên men

− Phosphate: kiểm soát pH trong quá trình lên men của lactoza

− Amoni clorua: hỗ trợ quá trính sinh hơi

Chuẩn bị môi trường:

Hòa tan amoni clorua trong nước Bổ sung các thành phần, hoặc môi trường hoàn chỉnh khô còn lại, đun nóng nếu cần

Để tăng thời gian bảo quản của môi trường khô, có thể thêm natri glutamat một cách riêng rẽ

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,7 ± 0,1 ở 25ºC