Định lượng E. Coli bằng phương pháp MPN theo TCVN 7924 – 3 – 2008

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM MỤC LỤC GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Đặc điểm vi khuẩn E.coli: 1.1 Giới thiệu vi khuẩn E.coli: Escherichia coli Theodore Escherich (1857-1911), nhà vi khuẩn học người Áo, phát lần năm 1885 Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột Trong loài thuộc chi này, E.coli chọn làm điển hình có vai trò quan trọng y học E.coli thành viên hệ vi khuẩn bình thường ruột nguyên nhiều bệnh nhiễm trùng, có bệnh nguyên đứng đầu E.coli sử dụng làm mô hình nghiên cứu sinh học phân tử lĩnh vực vi sinh học nói riêng sinh học nói chung Đường tiêu hóa chúng ta, đặc biệt ruột già, chứa hàng tỉ vi khuẩn, với 500 loài khác nhau, loài gây hại chí chúng bảo vệ khỏi phát triển vi khuẩn gây bệnh khác Escherichia coli (còn gọi E coli) vi khuẩn ký sinh đường ruột thường có mặt có Theo nhà khoa học, E coli vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu hệ vi sinh vật đường ruột người động vật Vi khuẩn cần thiết trình tiêu hóa thức ăn Bình thường chúng không gây hại, bị thải môi trường đường phân, chúng trở nên gây độc tính quay trở lại thể người đường ăn uống qua thực phẩm bị ô nhiễm chúng thường gây khó chịu đau bụng, rối loạn tiêu hóa Khi bị nhiễm E.Coli gây ngộ độc cấp tính, tiêu chảy, nước dẫn đến tử vong không can thiệp kịp thời.Vi khuẩn nguy hiểm tiềm ẩn khắp nơi: đất, nước bị ô nhiễm (được sử dụng để rửa thực phẩm) chúng có móng tay, bàn tay người chế biến thực phẩm không rửa tay E.Coli trực khuẩn (hình que) có 700 loại, thường sống môi trường, nhiều ruột non, ruột già người động vật 1.2 Nguồn gốc tên gọi: GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Năm 1885, München, bác sĩ nhi khoa Theodor Escherich quan tâm đến phát quan trọng Louis Pasteur Robert kock vi khuẩn Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy,Escherich lưu ý tới vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng.Vi khuẩn Escherich phát từ tã lót trẻ em công bố với tên gọi Bacterium coli commune Chỉ năm sau vi khuẩn giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá Tuy nhiên, vi khuẩn gọi tên Bacillus coli vào năm 1895 Bacterium coli vào năm sau đó.Đến năm 1991, vi khuẩn định danh thống toàn cầu Escherichia coli.(viết tắt E Coli ) Việt Nam E coli gọi vi khuẩn đại tràng, trực khuẩn đại tràng Những chủng nguy hiểm E.coli thường nguyên nhân 80% số trường hợp nhiễm trùng đường tiết niệu, bệnh hủy hoại thận, nguyên nhân đứng hàng thứ hai gây bệnh viêm màng não nhiễm trùng máu trẻ sơ sinh E.coli đứng đằng sau nhiều bệnh truyền nhiễm liên quan đến thực phẩm người ta phát loại khuẩn có nhiều sản phẩm thịt rau củ tươi sống bón phân Đây loại 1.3 khuẩn lây nhiễm dễ dàng người với người qua đường chân-tay-miệng… Cấu tạo vi khuẩn E.coli: E.coli trực khuẩn gram âm, có hai đầu tròn, kích thước từ 0,5→3 micromet Di động tiêu mao, không tạo bào tử, loại có độc lực có capsul GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Đặc điểm hình thái: Là trực khuẩn Gram âm, di động, không sinh nha bào Phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp 1.4 37°C, phát triển nhiệt độ từ 5-40°C, pH thích hợp 7,0 - 7,2 Hiếu khí kỵ khí tuỳ tiện Có môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải Đi vào thể theo phân người nhiễm vào thực phẩm Gây nhiễm trùng đường tiết niệu, sinh dục, nhiễm trùng đường gan - mật, nhiễm khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mù trẻ sơ sinh, nhiễm khuẩn huyết Tính chất nuôi cấy: 1.5 E.coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường Một số phát triển môi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tùy ý.Có thể phát triển nhiệt độ từ 5-40 oC.Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37oC Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển nhanh, thời gian hệ khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau đến làm đục nhẹ môi trường, sau 24 làm đục đều; sau hai ngày mặt môi trường có váng mỏng Những ngày sau,dưới đáy ống thấy lắng cặn.E.coli không mọc canh thang Selenit Trên môi trường thạch thường, sau khoảng đến 10 giờ, dung kính lúp cóthể quan sát khuẩn lạc.Sau 24 khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm Hìnhthái khuẩn lạc điển hình dạng S, gặp dạng R, M Trên môi trường phân lập, tùy theo chất thị màu,E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như thạchlactose) màu đỏ (như thạch MacConkey) Không mọc môi trường SS Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị sàng lọc nhanh,như EAEC tạo thành váng đặc trường nuôi cấy canh thang Muller-Hinton Phân loại: 1.6 E.coli chia thành loại: • • • • • 1.7 Enteroaggreative Enterohemorrhagic Enteroinrasire Enteropathogenic Enterotoxigeni Tính chất hóa sinh: Lên men nhiều đường kèm theo sinh GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Thử nghiệm IMViC: Dùng để phân biệt E.coli với vi khuẩn đường ruột khác, gồm có phản ứng Phản ứng sinh indol (I): E coli có indol (+) Phản ứng đỏ metyl (M): E coli có phản ứng đỏ metyl (+) Phản ứng Voges Proskauer (V): Phản ứng dùng để kiểm tra khả sinh acetyl - metyl cacbinol E.coli có phản ứng Voges Proskauer âm tính Phản ứng tìm khả sử dụng cacbon citrat (C) E.coli phản ứng citrat âm tính Đặc điểm kháng nguyên độc tố: Gồm loại kháng nguyên: O, K, H, F nội độc tố gây tiêu chảy, ngoại độc tố gây 1.8 tan huyết phù thủng Độc tố E.coli: Loại E.coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độ mạnh loại không giáp mô Kháng nguyên K có 13 loại KA, KB, KL Ví dụ công thức kháng nguyên E.coli là: O55K5H21F5 Nội độc tố đường ruột: Gồm loại chịu nhiệt không chịu nhiệt Cả hai loại gây tiêu chảy Loại chịu nhiệt ST (Thermostable): gồm loại STa, STb Loại không chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm loại LT1, LT2 Những dòng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều loại huyết khác thường gặp loại O6H16, O8H9, O78H12, O157 Khả gây bệnh vi khuẩn E.coli: 1.9 Cơ chế gây ngộ độc: thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm theo độc tố chúng E.coli gây tiêu chảy thường gặp nhóm sau: − Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm type thường gặp O26:B6, O44, O55:B5, O112:B11, O124, O125:B5, O142 nguyên nhân gây tiêu chảy trẻ em tuổi − Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gây bệnh cho trẻ em, người lớn tiết độc tố ruột ST LT o LT hoạt hóa men adenyl cyclase tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclicadenozin 5’ monophosphat) Yếu tố kích thích ion Cl- bicarbonat tách khỏi tế bào đồng thời ức chế Na+ bên tế bào Hậu gây tiêu chảy nước o Độc tố ST: hoạt hóa men Guanyl Cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’ monophosphat) bên tế bào dẫn đến kích thích tiết muối nước gây tiêu chảy Những dòng E.coli có loại nội độc tố LT ST gây tiêu chảy trầm trọng kéo dài GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh − NHÓM Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): E.coli bám lên niêm mạc làm tróc niêm mạc gây loét niêm mạc gây tiêu chảy có đàm lẫn máu (giống Shigella) Các chủng lên men hay không lên men đường lactose có phản ứng lysin decarboxylaza âm − tính Thường gặp type O125, O157, O144… Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa gây tiêu chảy vừa nguyên nhân gây viêm đại tràng xuất huyết (hermorrhagic colilic) làm tổn thương mao mạch gây tượng sưng phù (ederma) nguy hiểm đến tính mạng (do biến chứng) Nhóm VETEC bao gồm type: O26, O11, O113, O145, O157 ; ngoại độc tố vetec gây tiêu chảy Các biến chứng vi khuẩn tiết loại ngoại độc tố VT1 (verocytoxin) VT2 gây tác động thần kinh Gần người ta phát chủng E.coli ký hiệu E.coli O157:H7 Chủng gây vụ ngộ độc lớn giới năm gần (theo CDC, Center for Disease Control and prevention Mỹ) : Năm 1982, lần người ta ghi nhận nguồn bệnh E.coli O157:H7 Năm 1985, người ta nhận thấy triệu chứng hoại huyết có liên quan đến chủng O157:H7 Năm 1990, bùng nổ trận dịch từ nguồn nước nhiễm chủng E.coli O157:H7 Năm 1996, xảy trận dịch phức tạp Nhật Bản uống nước táo chưa diệt khuẩn Tình hình ngộ độc E.coli nay: − Theo thống kê ngộ độc thực phẩm Việt Nam: Mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân 100 – 200 ca tử vong − Bộ Y tế 30/6/2014: Toàn quốc ghi nhận có 90 vụ ngộ độc thực phẩm với 2636 người mắc, − 2035 người viện 28 trường hợp tử vong Nguyên nhân ngộ độc vi sinh vật, độc tố tự nhiên 27 vụ (30%) hóa chất Trong đó: Một loại ngộc độc thực phẩm gây vi sinh vật thường gặp ngộ độc thực phẩm vi khuẩn E.coli  Một số vụ tiêu biểu năm 2014: • 1/06/2014: 170 công nhân Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nienhsing có biều đau bụng, buồn nôn, phải nhập viên sau bữa trưa công ty Kết điều tra, xử lý chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm tỉnh Thái Bình xác định nguyên nhân khiến số công nhân phải nhập viện ăn phải suất cơm nhiễm vi khuẩn E.coli Coliforms • 24/09/2014: Vụ 114 người bị ngộ độc thực phẩm Gia Lai: Thịt bò nhiễm E.coli vượt giới hạn Kết xét nghiệm phát mẫu nước nhiễm E.coli 100 coliforms/100ml cao GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM gấp 100 lần giới hạn cho phép Bộ Y tế Mẫu thịt bò có số E.coli/g 6,68.10 cao giới hạn cho phép 5.103 Hình Hình minh họa ngộ độc thực phẩm GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Các phương pháp phát E Coli: Phương pháp truyền thống: • Đinh lương E Coli phương pháp MPN 3.1 Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất) gọi phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Hai hệ thống MPN - Hệ thống ống - Hệ thống 15 ống • Định lượng E.coli phương pháp đếm khuẩn lạc Dùng để xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống diện mẫu  Ưu điểm: Xác định tế bào sống Định lượng chọn lọc số VSV Có thể xác định VSV mật độ thấp  Nhược điểm: Quy trình phức tạp, sử dụng nhiều dụng cụ, tốn thởi gian • Phương pháp màng lọc: Thường dùng để định lượng vi sinh vật thị mẫu nước thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh vật tương đối thấp  Ưu điểm: Xác định mật độ VSV cụ thể thể tích mẫu lớn  Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích mẫu thực phẩm rắn GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 3.2 NHÓM Phương pháp đại: Phương pháp PCR Là phương pháp để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hang triệu bảng nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA  Ưu điểm Thời gian cho kết nhanh Nhận diện VSV khó nuôi cấy Hóa chất có sẵn, dễ tồn trữ Ít tốn mặt nhân  Nhược điểm Thực phẩm chứa chất ức chế, mật độ VSV thấp Không phân biệt tế bào sống chết Phương pháp ELISA Là kĩ thuật sinh hóa để phát kháng thể kháng nguyên mẫu xét nghiệm  Ưu điểm Độ nhạy cao Cho kết nhanh  Nhược điểm 3.3 Không phân biệt tế bào sống chết Phương pháp khác: • Kỹ thuật màng Petrifilm Đây phương pháp thử nhanh VSV thực phẩm  Nguyên tắc Phương pháp sử dụng đĩa cấy vi sinh môi trường khan gel ẩm nước hòa tan Mẫu kiểm tra pha loãng thêm vào đĩa với tỉ lệ 1ml/đĩa Ấn miếng trải nhựa đặt lên film, trải mẫu khắp diện tích 20cm2 Chất làm đông làm đĩa đông lại, đĩa ủ sau đếm khuẩn lạc Môi trường dinh dưỡng hỗ trợ tang trưởng vi sinh vật thời gian ủ số khuẩn lạc đếm trực tiếp  Ưu điểm: Dễ thao tác, cho kết nhanh chóng 24h Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản Thời hạn dùng lâu, không cần phương pháp khử trùng môi trường GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Định lượng E Coli phương pháp MPN theo TCVN 7924 – – 2008 Phạm vi áp dụng: 4.1 Tiêu chuẩn qui định phương pháp định lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza kỹ thuật cấy môi trường lỏng tính số có xác suất lớn (MPN) sau ủ 37ºC ủ tiếp 44ºC Tiêu chuẩn áp dụng cho: − − Các sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi Các mẫu môi trường khu vực chế biến thực phẩm vận chuyển thực phẩm Phương pháp thích hợp để định lượng tế bào Escherichia coli mà trải giai đoạn làm nước, đông lạnh, tiếp xúc với môi trường mặn (như nước biển) bị hư hại chất tẩy rửa sản phẩm chứa clo CẢNH BÁO: Một số chủng Escherichia coli không phát triển 44ºC cụ thể Escherichia coli âm tính β-glucuronidaza Escherichia coli O157 số chủng E.coli gây bệnh khác phương pháp quy định tiêu chuẩn không phát 4.2 Nguyên tắc: Cấy lượng xác định mẫu thử sản phẩm ban đầu dạng lỏng, với lượng xác định huyền phù ban đầu trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống nghiệm1) chứa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép Cấy lượng xác định mẫu thử sản phẩm ban đầu dạng lỏng, với lượng xác định huyền phù ban đầu trường hợp sản phẩm dạng khác vào ba ống nghiệm1) chưa môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ đơn Sau đó, cấy lượng xác định dung dịch mẫu thử pha loãng thập phân huyền phù ban đầu vào môi trường tăng sinh lỏng nồng độ đơn điều kiện Nuôi ấm ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép nồng độ đơn 37ºC 24 Kiểm tra ống sinh axit cho thấy lên men lactoza Từ ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc cho thấy có tạo thành axit cấy truyền vào môi trường thạch trypton-mật-glucuronid 10 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Thạch trypton-mật-glucuronid ủ 44ºC khoảng từ 20 đến 24 Xác định môi trường thạch trypton-mật-glucuronid có mặt khuẩn lạc màu xanh màu xanh da trời, chứng tỏ có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza Số có xác xuất lớn Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] xác định theo số ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc cấy truyền có sinh khuẩn lạc màu xanh màu xanh da trời thạch mật glucuronid 4.3 Bảng chuẩn bị thí nghiệm: stt 4.4 Dụng cụ, thiết bị Ghi Thiết bị khử trùng khô (tủ) khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Tủ ấm Tủ sấy buồng sấy thông gió, tủ thổi không khí Tủ lạnh Máy đo pH Đĩa Petri Đường kính khoảng 90 mm Ống nghiệm Có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm 18 mm x 180 mm 20 mm x 200 mm Pipet xả hết Có dung tích danh định ml 10 ml, chia vạch 0,1 ml Vòng lấy mẫu Bằng platin/iridi niken/crom, đường kính khoảng mm, vòng lấy mẫu vô trùng sử dụng lần dung tích 10 µl Có thể trì nhiệt độ 37ºC ± 1ºC 44ºC ± 1ºC Có thể trì nhiệt độ từ 25ºC ± 1ºC đến 50ºC ± 1ºC Dùng để bảo quản môi trường chuẩn bị, trì nhiệt độ 5ºC ± 3ºC Có độ phân giải 0,01 đơn vị pH, có độ xác đến ± 0,1 đơn vị pH 25ºC Máy đo pH gắn với hệ thống cân nhiệt tự động tay Môi trường nuôi cấy: • Môi trường glutamate khoáng cải biến (môi trường tăng sinh chọn lọc) Thành phần: a) Môi trường b) Môi trường nồng độ kép nồng độ đơn 11 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Natri glutamat 12,7 g 6,35 g Lactoza 20,0 g 10,0 g Natri focmat 0,5 g 0,25 g L-xystin 0,04 g 0,02 g L-(-)-axit aspactic 0,048 g 0,024 g L(+)-arginin 0,04 g 0,02 g Thiamin 0,002 g 0,001 g Axit nicotinic 0,002 g 0,001 g Axit pantothenic 0,002 g 0,001 g Magie sunfat ngậm bảy phân tử nước 0,2 g 0,1 g (MgSO4.7H2O) 0,02 g 0,01 g Sắt (III) amoni xytrat 0,02 g 0,01 g Canxi clorua ngậm hai phân tử nước (CaCl2.2H2O) 1,8 g 0,9 g Dikali hydro phosphat (K2HPO4) 0,02 g 0,01 g Bromocresol tía 5,0 g 2,5 g 1000 ml 1000 ml Amoni clorua Nước Mục đích thành phần môi trường: − − − − − − Natri Glutamat , natri focmat: chất dinh dưỡng Lactoza: nguồn đường để E Coli lên men Ion Mg2+ , vitamin (như acid nicotinic, acid pantothenic), axit amin (như L-xystin, L-(-)-axit aspactic, L(+)-arginin, Thiamin : giúp tăng tỳ lệ lên men Phosphate: kiểm soát pH trình lên men lactoza Amoni clorua: hỗ trợ trính sinh Chuẩn bị môi trường: Hòa tan amoni clorua nước Bổ sung thành phần, môi trường hoàn chỉnh khô lại, đun nóng cần Để tăng thời gian bảo quản môi trường khô, thêm natri glutamat cách riêng rẽ Nếu cần, chỉnh pH để sau khử trùng pH phải 6,7 ± 0,1 25ºC 12 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Phân phối môi trường theo lượng 10 ml vào ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (6.6) trường hợp môi trường nồng độ đơn phân phối vào ống nghiệm có kích thước 18 mm x 180 mm 20 mm x 200 mm (6.6) trường hợp môi trường nồng độ kép Khử trùng 10 nhiệt độ 116ºC nồi hấp áp lực (6.1) Cách khác đun nóng 100ºC 30 ba ngày liên tiếp • Môi trường thạch trypton-mật-glucuronid (môi trường chọn lọc thứ hai) Thành phần: Sản phẩm thủy phân casein enzym Muối mật No.3 Axit-5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG) Dimetyl sulfoxit (DMSO)b Thạch 20,0 g 1,5 g 114 µmola ml g tới 18 g c 1000 ml Nước a Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni b Dimetyl sulfoxit độc hít tiếp xúc phải Cần sử dụng tủ hút khói Vì độc tính nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng c Tùy thuộc vào sức đông thạch Mục đích thành phần môi trường: − − Sản phẩm thủy phân casein enzyme: cung cấp chất dinh dưỡng Muối mật No.3: tinh thể màu tím ức chế VSV gram (+) cho phép trực khuẩn − gram (-) phát triển Dimetyl sulfoxit (DMSO): ức chế VSV gram (+) cho phép trực khuẩn gram (-) phát triển − Axit-5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG): chất tạo nên hình thành sắc tố Hầu hết E Coli dương tính -glucuronidaza phân cắt BCIG tạo khuẩn lạc màu xanh theo chế: 13 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh − − NHÓM Thạch: chất làm rắn môi trường Nước: thành phần cần thiết cho phát triển VSV, dung m6oi hòa tan chất môi trường Chuẩn bị môi trường: Hòa tan BCIG dimetyl sulfoxit Hòa tan tất thành phần nước đun đến sôi Chỉnh pH để sau khử trùng pH phải 7,2 ± 0,2 25ºC, cần Khử trùng môi trường 15 nhiệt độ 121ºC nồi hấp áp lực 14 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 4.5 NHÓM Quy trình phân tích: Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng nôi trường Chuẩn bị mẫu thử: • Đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu điều kiện vô trùng cân xác 10g/25g • Đối với mẫu lỏng hút 10ml/25ml  Đối với sản phẩm đặc hoàn toàn: bánh, kẹo … Cân 10g (hoặc 25g) mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, sau cho vào túi nylon (PE) vô trùng bình erlen dung tích 200ml có sẵn bi thủy tinh 90ml (hoặc 225ml) dung dịch pha loãng tiệt trùng Lắc đều, để lắng cặn Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng  Đối với sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: đồ hộp thịt… Cân 10g (hoặc 25g) mẫu (cả lẫn nước) cho vào túi dập để dập mẫu Thêm 90ml (hoặc 225ml) dung dịch pha loãng vô trùng vào túi dập mẫu chứa mẫu, lắc đều, để lắng cặn Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng  Đối với sản phẩm lỏng hoàn toàn: nước chấm, nước giải khát… hút trực tiếp mẫu pha loãng tùy theo mức độ nhiễm bẩn Lắc kỹ Hút 10ml mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 90ml dung dịch pha loãng vô trùng vào túi dập mẫu chứa mẫu, lắc đều, ta có độ pha loãng  Đối với sản phẩm lạnh đông: Mẫu lau cồn phía bao PE, đặt vào khay tráng men vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để đông tự nhiên nhiệt độ phòng, giải đông - 5oC 18 giờ; 45oC 15 phút cần (liên tục lắc bình chứa mẫu để tăng tốc độ giải đông)  Có thể dung máy dập mẫu (Stomacher) để xử lý mẫu rắn  Dung dịch pha loãng: tốt nên dùng nước peptone 0.1% nước đệm photphat, nước muối sinh lý (0.85%) buffer cần  Đối với mẫu đổ hộp: phải kiểm tra dạng bên xem hộp có bị phồng không, biến dạng, bị hở mối ghép không? Ghi lại nhận xét Lau chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm tra Chú ý kiểm cha hộp hồng có yêu cầu Đối với sản phẩm bao bì thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm nghiệm Dung dịch pha loãng ban đầu: 15 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Huyền phù, dung dịch nhũ tương thu sau cân đong lượng sản phẩm cần kiểm tra (hoặc mẫu thử chuẩn bị từ sản phẩm) trộn với lượng dung dịch pha loãng lớn gấp chín lần, cần, sử dụng máy trộn ý hạt to lắng xuống, có Các huyền phù, dung dịch nhũ tương thu cách trộn thể tích xác định dung dịch pha loãng ban đầu với thể tích dung dịch pha loãng lớn gấp chín lần cách lặp lại thao tác với độ pha loãng chuẩn bị thu dãy dung dịch pha loãng thập phân thích hợp để cấy vào môi trường Dung dịch pha loãng: Trong trình phân tích sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước khử ion vô trùng, trừ có quy định khác Có thể tham khảo thêm phần tương ứng TCVN 6507 (ISO 6887) tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định Pha đủ số lượng độ pha loãng để đảm bảo tất ống nghiệm ứng với độ pha loãng cuối cho kết âm tính Bước 2: Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc Về nguyên tắc chung, theo quy trình cần ba ống cho độ pha loãng Đối với động vật nhuyễn thể có vỏ tươi sống sản phẩm đặc biệt khác và/hoặc yêu cầu độ xác cao kết cần cấy năm ống cho độ pha loãng Nếu ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép Dùng pipet vô trùng cho vào ống 10 ml mẫu thử dạng lỏng, 10 ml huyền phù ban đầu trường hợp mẫu thử dạng khác Nếu ống nghiệm đựng môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ Dùng pipet vô trùng cho vào ống ml mẫu thử dạng lỏng, ml huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) mẫu thử dạng khác 16 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Bước 3: Ủ ấm Ủ ống nghiệm chứa môi trường chọn lọc nồng độ kép cấy ống chứa môi trường chọn lọc nồng độ đơn cấy tủ ấm 37ºC 24 ± 17 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Bước 4: Cấy truyền Từ ống ủ theo cho thấy có axit, có màu vàng, cấy truyền vào đĩa thạch trypton mật glucuronid ria cấy để thu khuẩn lạc tách biệt rõ 18 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Bước 5: Ủ lần hai Ủ đĩa cấy theo từ 20 đến 24 tủ ấm 44ºC Không chồng cao ba đĩa Bước 6: Kiểm tra đĩa Sau thời gian ủ quy định, kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc có màu tối màu xanh nhạt màu xanh da trời, điều chứng tỏ có mặt Escherichia coli dương tính βglucuronidaza 19 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM 20 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM Bước 7: Kết Các ống chứa môi trường tăng sinh nồng độ đơn nồng độ kép ủ, sau cấy truyền ủ lần hai cho thấy có khuẩn lạc màu xanh màu xanh da trời môi trường thạch chọn lọc coi ống dương tính Đếm số ống dương tính độ pha loãng Tra bảng MPN 21 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 7924-3 : 2008 (ISO/TS 16649-3 : 2005) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – phương pháp định lượng escherichia coli dương tính β-glucuronidaza – phần 3: kỹ thuật tính số có xác suất lớn sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl β-d-glucuronid [2] Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm ,Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM, 2014 22 [...]... Đếm số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng Tra bảng MPN 21 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM 7 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 7924- 3 : 2008 (ISO/TS 16649 -3 : 2005) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp định lượng escherichia coli dương tính β-glucuronidaza – phần 3: kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất sử dụng 5-bromo-4-clo -3- indolyl β-d-glucuronid [2] Giáo trình Phân tích vi sinh... trypton-mật-glucuronid được ủ ở 44ºC trong khoảng từ 20 giờ đến 24 giờ Xác định trên môi trường thạch trypton-mật-glucuronid sự có mặt các khuẩn lạc màu xanh hoặc màu xanh da trời, chứng tỏ có mặt Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza Số có xác xuất lớn nhất Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] được xác định theo số ống đựng môi trường tăng sinh chọn lọc được cấy truyền... đã khử ion vô trùng, trừ khi có các quy định khác Có thể tham khảo thêm các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định Pha đủ số lượng các độ pha loãng để đảm bảo rằng tất cả các ống nghiệm ứng với độ pha loãng cuối cùng cho kết quả âm tính Bước 2: Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc Về nguyên tắc chung, theo quy trình cần ba ống cho mỗi độ pha... phẩm) đã được trộn với một lượng dung dịch pha loãng lớn gấp chín lần, nếu cần, sử dụng máy trộn và chú ý để cho các hạt to lắng xuống, nếu có Các huyền phù, dung dịch hoặc nhũ tương thu được bằng cách trộn một thể tích xác định của dung dịch pha loãng ban đầu với thể tích dung dịch pha loãng lớn gấp chín lần và bằng cách lặp lại các thao tác này với các độ pha loãng tiếp theo đã chuẩn bị cho đến khi... ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml 9 Vòng lấy mẫu Bằng platin/iridi hoặc niken/crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc các vòng lấy mẫu vô trùng sử dụng một lần dung tích 10 µl Có thể duy trì nhiệt độ ở 37 ºC ± 1ºC và 44ºC ± 1ºC Có thể duy trì được nhiệt độ từ 25ºC ± 1ºC đến 50ºC ± 1ºC Dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị, có thể duy trì nhiệt độ ở 5ºC ± 3 C Có độ phân giải 0,01 đơn vị pH, có độ chính xác... min trong ba ngày liên tiếp • Môi trường thạch trypton-mật-glucuronid (môi trường chọn lọc thứ hai) Thành phần: Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym Muối mật No .3 Axit-5-bromo-4-clo -3- indolyl-β-D-glucuronid (BCIG) Dimetyl sulfoxit (DMSO)b Thạch 20,0 g 1,5 g 114 µmola 3 ml 9 g tới 18 g c 1000 ml Nước a Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni b Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải Cần sử dụng... − − Sản phẩm thủy phân casein bằng enzyme: cung cấp chất dinh dưỡng Muối mật No .3: tinh thể màu tím ức chế VSV gram (+) nhưng cho phép trực khuẩn − gram (-) phát triển Dimetyl sulfoxit (DMSO): ức chế VSV gram (+) nhưng cho phép trực khuẩn gram (-) phát triển − Axit-5-bromo-4-clo -3- indolyl-β-D-glucuronid (BCIG): là một chất nền tạo nên sự hình thành sắc tố Hầu hết các E Coli dương tính -glucuronidaza... Lau chùi bằng cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm tra Chú ý chỉ kiểm cha các hộp hồng có yêu cầu Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ kín của bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm nghiệm Dung dịch pha loãng ban đầu: 15 GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh NHÓM 7 Huyền phù, dung dịch hoặc nhũ tương thu được sau khi cân hoặc đong một lượng sản... NHÓM 7 Phân phối môi trường này theo từng lượng 10 ml vào các ống nghiệm có kích thước 16 mm x 160 mm (6.6) trong trường hợp môi trường nồng độ đơn và phân phối vào các ống nghiệm có kích thước 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm (6.6) trong trường hợp môi trường nồng độ kép Khử trùng 10 min ở nhiệt độ 116ºC trong nồi hấp áp lực (6.1) Cách khác có thể đun nóng ở 100ºC trong 30 min trong ba ngày liên tiếp... mật glucuronid 4 .3 Bảng chuẩn bị thí nghiệm: stt 4.4 Dụng cụ, thiết bị Ghi chú 1 Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) 2 Tủ ấm 3 Tủ sấy hoặc buồng sấy thông gió, hoặc tủ thổi không khí 4 Tủ lạnh 5 Máy đo pH 6 Đĩa Petri Đường kính khoảng 90 mm 7 Ống nghiệm Có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và 18 mm x 180 mm hoặc 20 mm x 200 mm 8 Pipet xả hết Có dung tích danh định 1 ml và 10