- Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường canh Laury Sulphate và canh B
Trang 1GVHD: Hoàng Xuân Thế
1.Nguyễn Thị Thảo Trang 2205112096 2.Trương Thị My 2205112043 3.Nguyễn Thị Loan 2205112028 4.Nguyễn Ngọc Mai Trâm 2205112097
MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
Đề tài: Định lượng Coliforms – E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Trang 2NỘI DUNG
Trang 4 Coliform
- Coliforms là những trực khuẩn gram
âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24- 48 giờ
- Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường canh Laury Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt.
gram âm
Trang 5Nhuộm gram
Năm 1884 H.Christian Gram đã khám phá
ra một phương pháp nhuộm VSV bằng phẩm nhuộm pararosaniline Thông qua việc sử dụng theo trình tự 2 loại phẩm nhuộm có 2 màu khác nhau, ông đã nhận thấy vi khuẩn được chia thành
2 nhóm: nhóm vi khuẩn Gram dương (giữ màu phẩm nhuộm đầu tiên: crystal violet) và nhóm vi khuẩn Gram âm (bị mất màu phẩm nhuộm đầu tiên sau khi được rửa bằng một dd tẩy màu rồi được tiếp tục nhuộm bằng phẩm nhuộm thứ 2 là safranin hay carbon fuchsin)
Trang 6Nhuộm gram
Đó là do có sự khác biệt về thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn Phương pháp nhuộm Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi định loại vi sinh vật Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác nhau chủ yếu như sau :
Gram dương Gram âm
Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượngkhô của thành tế bào
Lipid Hầu như không có 20
Protein Không có hoặc có ít Cao
Trang 7Nhuộm gram
Trang 9GRAM + GRAM Không màu
-Không màu
Không màu Màu tím
Màu tím
Màu tím
Màu tím
Màu tím Màu tím
Màu hồng
Fixation Crystal Violet Iodine treatment Decolorization
Counter stain (safranin)
Sự bắt màu của tế bào vi khuẩn khi nhuộm Gram
Trang 10Gram (+)
Bacillus cereus,
Gram (+)
Trang 11- Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
+Escherichia (E.coli) +Citrobacter.
+Klebsiella.
+Enterobacter
Trang 12Escherichia coli
Citrobacter freundii
Trang 13Klebsiella pneumoniae
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakazakii
Trang 14- Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges- Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung
là IMViC.
Coliform
Trang 15Coliforms chịu nhiệt:
- Là những Coliforms có khả năng
lên men lactose sinh hơi trong
khoảng 24h khi được ủ ở 44 o C
trong môi trường EC.
Coliforms phân (E.coli giả
định):
- Là Coliforms chịu nhiệt có khả
năng sinh indole khi được ủ
khoảng 24h ở 44.5 o C trong môi
trường Trypton.
Feacal Coliform
Trang 16 E.coli
Là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges Proskauer -, Citrate -).
E.coli
Trang 17– Coliforms là trực khuẩn Gram âm,
không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị
khí tùy ý, lên mem lactose sinh acid
và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48
giờ
– Coliforms chịu nhiệt = coliforms +
lên men lactose và sinh hơi trên môi
trường canh EC ở 44oC trong 24
giờ
– Coliforms phân = coliforms chịu
nhiệt + sinh indol trong canh
Trypton ở 44,5oC trong 24 giờ
– E.coli = coliforms phân + IMViC
(++ )
Sa lm
on el la
Tóm lại
Trang 19 Định lượng Coliforms, Coliform phân
bằng pp đếm khuẩn lạc:
Nguyên tắc:
-Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1 o C trong 24-48h Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị như neutral red, crystal violet.
-Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm Xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật
Trang 20 Định lượng Coliforms, Coliform phân
bằng pp đếm khuẩn lạc:
Nguyên tắc:
-Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 440C
-Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lệ khẳng định và
độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa.
Trang 21đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC.
Trang 23 Định lượng Coliforms, Coliform phân và
Trang 24Đếm số ống canh EC(+)& Indol(+),
Trang 2510 5 Độ pha loãng cuối
Mẫu được đồng nhất hóa và pha loãng, sao cho
chứa < 100 tế bào Coliforms trong 1ml dd pha loãng.
Pha loãng mẫu
Quy trình phân tích Coliforms và
Coliforms phân
Trang 26Chọn lọc KL coliform
Trang 27Khuẩn lạc coliforms đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ đến đỏ đậm , có vùng tủa muối
mật, đường kính ≥0,5mm
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng
Tính: N = tổng số KL đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy
Trang 28- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL Ủ các ống BGBL ở 37 1 o C trong 24 – 48 giờ.
- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham Ghi nhận số ống (+).
- Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định.
Trang 29Chọn 5 KL đặc trưng
cấy sang 5 ống BGBL
Ủ 37 o C/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và sinh hơi
Tỉ lệ khẳng định
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã
cấy)
Trang 30Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.
Trang 31 Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân:
- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ,
dùng que cấy vòng cấy chuyền sang
các ống nghiệm chứa môi trường EC.
- Ủ các ống EC ở 44oC trong 24-48 giờ.
- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn
tăng trưởng làm đục môi trường & sinh
hơi trong ống Durham Ghi nhận số
ống (+).
Trang 32Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi và làm đục môi trường với mỗi độ pha loãng.
Trang 33 Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân:
- Các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC được cấy qua môi trường canh Trypton để thực hiện thêm thử nghiệm indol ở 44oC
- Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên môi trường EC vừa là (+) trên thử nghiệm indol.
Tỉ lệ khẳng định
R = (Số KL indol (+) / (Số KL đã cấy)
Trang 34Kết quả thử nghiệm Indol
(+) (-)
(+): Sự xuất hiện của
Trang 35N : tổng số khuẩn lạc đếm được
ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi
độ pha loãng
v : dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi : độ pha loãng có khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
Trang 36 Quy trình phân tích E.coli
Mẫu được đồng nhất, pha loãng và định lượng tương tự như phần Coliforms phân với các bước khẳng định được tiến hành như sau:
- Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyền sang môi trường EC ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h chọn các ống có sinh hơi (+).
Trang 37Quy trình phân tích E.coli
- Dùng que cấy vòng cấy chuyền từ các ống (+) trên EC sang các môi trường sau: Canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h.
- Thực hiện thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate Ghi nhận
số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định
E.coli (+) (IMViC là ++ ).
Trang 38Kết quả thử nghiệm Indol
(+): Sự xuất hiện của
Trang 40Kết quả thử nghiệm VP
Klebsiella pneumonia (+)
Trang 41Kết quả thử nghiệm Citrate
Klebsiella pneumonia (+) E coli (-)
(+): Môi trường
chuyển sang màu
xanh dương.
(-): Môi trường giữ
nguyên màu xanh
lục.
Trang 42Khuẩn lạc E Coli giả định cho kết quả
thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ + - -) chính
là E coli.
Kết quả thử nghiệm IMViC:
(-) (+) (-) (+)
Trang 45Rót vào mỗi ống nghiệm có chứa ống Durham 10
ml môi trường BGBL Hấp ở 110oC trong 15 phút,
Trang 46 Môi trường EC:
Trang 47 Môi trường canh Tryptone:
Trang 48 Môi trường MR-VP Broth:
Trang 49Môi trường 2:
Môi trường MR-VP Broth:
Trang 52Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar)
Trang 53Môi trường thạch VRB (Violet Red Bile Agar)
Trang 55Thuốc thử methyl red:
Trang 57VÍ DỤ: Kiểm tra định lượng
Coliforms, Coliforms phân và E.coli có trong 1ml sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur.
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Trang 58- Dùng pipet vô trùng hút chính xác 1ml mẫu và
pha loãng thành các dãy thập phân kế tiếp nhau Cuối cùng thu được các dịch mẫu có các nồng độ
thập phân như sau: 10-1,10-2 ,10-3
Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích:
Độ pha loãng cuối
Trang 59Chọn lọc KL coliform
Cấy mẫu:
Trang 60-Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3 .Tiến hành lặp lại 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ
-Tất cả các thao tác cần phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Cũng như các dụng cụ có liên quan phải đảm bảo được
vô trùng trước đó.
-Kết quả khuẩn lạc trên môi trường VRB như sau:
Trang 61Khuẩn lạc coliforms đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ đến đỏ đậm , có vùng tủa muối
mật, đường kính ≥0,5mm
Đếm số khuẩn lạc đặc trưng
Tính: N = tổng số KL đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy
Trang 63- Từ tổng số khuẩn lạc đếm được trên 6 đĩa, chọn bất kì
5 khuẩn lạc nghi ngờ từ các đĩa (2 KL (khuẩn lạc) từ 2 đĩa của 10 -1 , 1 KL từ 1 đĩa của 10 -2 và 2 KL từ 2 đĩa của 10 -3 ), dùng que cấy vòng vô trùng cấy chuyền sang
5 ống nghiệm chứa môi trường BGBL có chứa ống Durham úp ngược Ủ ở 37 o C 1 o C trong 24 – 48h.
- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham Ghi nhận số ống (+).
Trang 64Chọn 5 KL đặc trưng
cấy sang 5 ống BGBL
Ủ 37 o C/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và sinh hơi
Tỉ lệ khẳng định
R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã
cấy)
Trang 65Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.
Trang 66N : tổng số khuẩn lạc đếm được.
ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi
độ pha loãng
v : dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi : độ pha loãng có khuẩn lạc được chọn tại
Trang 67 Kết quả thu được như sau:
Tính mật độ Coliforms theo công thức:
= 2,1.102 (CFU/ml)
Trang 68- Tương tự, chọn bất kì 5 khuẩn lạc nghi ngờ từ các đĩa (2 KL từ 2 đĩa của 10-1, 1 KL từ 1 đĩa của
10-2 và 2 KL từ 2 đĩa của 10-3), nhưng dùng que cấy vòng vô trùng cấy chuyền sang 5 ống nghiệm chứa môi trường EC có chứa ống Durham úp ngược Ủ ở 44oC trong 24 – 48h
- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham
Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân
Trang 69Chọn 5 KL đặc trưng
cấy sang 5 ống EC
Ủ 44 o C/24 – 48h
Kiểm tra khả năng lên men Lactose và sinh hơi
Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi và làm đục môi
trường ứng với mỗi độ pha loãng.
Trang 71- Từ các ống nghiệm cho kết quả (+) trên EC tiếp tục cấy chuyền sang môi trường canh Trypton để thử nghiệm Indol ở 44oC.
- Th nghi m ử nghiệm ệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi sinh hơi trên EC và có phản ứng Indol dương tính.
- Ghi nhận kết quả Indol (+).
Trang 72Các độ pha loãng cho (+) trên EC 10 -1 10 -1 10 -2
Tỷ lệ khẳng định coliforms phân (R)
5 2
Trên thử nghiệm Indol
Trên môi trường EC
Trang 73- Tính kết quả:
Tương tự Coliforms cách tính mật độ Coliforms
phân cũng được tính theo công thức sau:
= 1,4.102 (CFU/ml)
Trang 74-Từ các ống nghiệm cho kết quả (+) trên EC
đã được xác định ở bước làm thử nghiệm khẳng định Coliforms phân tiếp tục cấy chuyền sang các môi trường sau:Canh Trypton, canh MR- VP và thạch Simmon Citrate.
-Ủ các môi trường trên ở 44 0,5oC trong 24h để thực hiện các thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges- Proskauer và Citrate
Thử nghiệm khẳng định E.coli
Trang 75 Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Mục đích: Phát hiện các VSV có khả năng sinh
indol các VSV có hệ emzym tryptophanase.
Cơ sở sinh hóa:
-Tryptophan bị oxi hóa bởi một số VSV có hệ enzyme Tryptophanase tạo nên sản phẩm trung gian chính là indolpyruvic acid (IPA).
-IPA bị biến đổi theo hướng loại nhóm amin để tạo thành indol Indol được phát hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- DMABA.
-Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Trang 76 Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Chủng VSV MT canh
tryptone
Thu c th ốc thử ử Kovac’s
44,5 0,2 o C / 24h
E.Coli (+) Klebsiella (-)
Trang 77 Thử nghiệm MR (Methyl red)
• Mục đích: Phân biệt các VSV dựa trên sự khác
biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose.
• Cơ sở sinh hóa:
+ pH dưới 4.4: Màu đỏ
+ pH 5.0 - 5.8: Màu hồng cam
+ pH trên 6.0: Màu vàng
Trang 78-MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid
môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử.
nuôi cấy – các sản phẩm có tính acid bị chuyển hóa thành các sản phẩm trung tính – pH môi trường
dần trung tính môi trường có màu vàng
Trang 79 Thử nghiệm MR (Methyl red)
Trang 80 Thử nghiệm VP(Voges–Proskauer)
• Mục đích: Phát hiện các VSV dựa trên
sự khác biệt về khả năng tạo ra acetoin trong quá trình lên men glucose
• Cở sở sinh hóa:
Trang 81Phức màu đỏ
Trang 82 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)
E coli (-)
Trang 83 Thử nghiệm Citrate
• Mục đích: Phát hiện các VSV dựa trên sự khác
biệt về khả năng sử dụng citrat như là nguồn cacbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vật chất.
• Cở sở sinh hóa:
-VSV sử dụng citrate là nguồn carbon duy
-VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm
Trang 84 Thử nghiệm Citrate
Chủng
VSV
MT thạch nghiêng SCA
ĐC (-) (+)
44,5 0,2 o C / 24h
Trang 85Khuẩn lạc E Coli giả định cho kết quả
thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ + - -) chính là
E coli.
Kết quả thử nghiệm IMViC:
Indol(+) MR(+) VP(-) Citrate(-)
Trang 86-Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm
khẳng định E.coli (+) khi (IMViC là +
Trang 87 Kết quả thu được như sau:
Tương tự Coliforms, Coliforms phân cách tính mật
độ E.coli cũng được tính theo công thức sau:
Trang 88Các chỉ tiêu cho mẫu
sữa tươi tiệt trùng
theo pp Pasteur
Quy định BYT 4/1998 Kết quả kiểm tra
Coliforms (trong
Chỉ tiêu Coliforms và E.coli trong mẫu sữa tươi
không nằm trong giới hạn cho phép của BYT 4/1998 đặt ra Vì vậy phải tiến hành tiệt trùng lại hoặc loại mẫu ngay để đảm bảo VSATTP
(Theo Bảng 1.2 Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm, BYT
4/1998 , trang 23 của Trần Linh Thước)
KẾT LUẬN
Trang 89TÀI LIỆU THAM KHẢO
trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo Dục Tp.HCM, 2009.
02
http://luanvan.co/luan-van/khao-sat-tinh-hinh-nhiem-e-coli-va-coliforms-trong-nuoc-uong-nuoc-co-gas-nuoc-c o-con-tren-dia-ban-quan-thu-duc-2409/
ococcus-aureus-va-escherichia-coli-trong-thuc-pham-ta i-khu-vuc-cho-thi-nghe-2420/
guyen-nhan-nhiem-vi-sinh-vat-trong-san-pham-cha-gio -che-566.html
Trang 90Chân thành cảm ơn Thầy
& các bạn đã lắng nghe