1. Trang chủ
  2. » Cao đẳng - Đại học

định lượng coliforms – e.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

90 13K 35

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 90
Dung lượng 5,47 MB

Nội dung

- Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường canh Laury Sulphate và canh B

Trang 1

GVHD: Hoàng Xuân Thế

1.Nguyễn Thị Thảo Trang 2205112096 2.Trương Thị My 2205112043 3.Nguyễn Thị Loan 2205112028 4.Nguyễn Ngọc Mai Trâm 2205112097

MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Đề tài: Định lượng Coliforms – E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Trang 2

NỘI DUNG

Trang 4

Coliform

- Coliforms là những trực khuẩn gram

âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24- 48 giờ

- Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37oC trong môi trường canh Laury Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt.

gram âm

Trang 5

Nhuộm gram

Năm 1884 H.Christian Gram đã khám phá

ra một phương pháp nhuộm VSV bằng phẩm nhuộm pararosaniline Thông qua việc sử dụng theo trình tự 2 loại phẩm nhuộm có 2 màu khác nhau, ông đã nhận thấy vi khuẩn được chia thành

2 nhóm: nhóm vi khuẩn Gram dương (giữ màu phẩm nhuộm đầu tiên: crystal violet) và nhóm vi khuẩn Gram âm (bị mất màu phẩm nhuộm đầu tiên sau khi được rửa bằng một dd tẩy màu rồi được tiếp tục nhuộm bằng phẩm nhuộm thứ 2 là safranin hay carbon fuchsin)

Trang 6

Nhuộm gram

Đó là do có sự khác biệt về thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn Phương pháp nhuộm Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi định loại vi sinh vật Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác nhau chủ yếu như sau :

Gram dương Gram âm

Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượngkhô của thành tế bào

Lipid Hầu như không có 20

Protein Không có hoặc có ít Cao

Trang 7

Nhuộm gram

Trang 9

GRAM + GRAM Không màu

-Không màu

Không màu Màu tím

Màu tím

Màu tím

Màu tím

Màu tím Màu tím

Màu hồng

Fixation Crystal Violet Iodine treatment Decolorization

Counter stain (safranin)

Sự bắt màu của tế bào vi khuẩn khi nhuộm Gram

Trang 10

Gram (+)

Bacillus cereus,

Gram (+)

Trang 11

- Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:

+Escherichia (E.coli) +Citrobacter.

+Klebsiella.

+Enterobacter

Trang 12

Escherichia coli

Citrobacter freundii

Trang 13

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter cloacae

Enterobacter sakazakii

Trang 14

- Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges- Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung

là IMViC.

Coliform

Trang 15

Coliforms chịu nhiệt:

- Là những Coliforms có khả năng

lên men lactose sinh hơi trong

khoảng 24h khi được ủ ở 44 o C

trong môi trường EC.

Coliforms phân (E.coli giả

định):

- Là Coliforms chịu nhiệt có khả

năng sinh indole khi được ủ

khoảng 24h ở 44.5 o C trong môi

trường Trypton.

Feacal Coliform

Trang 16

E.coli

Là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges Proskauer -, Citrate -).

E.coli

Trang 17

– Coliforms là trực khuẩn Gram âm,

không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị

khí tùy ý, lên mem lactose sinh acid

và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48

giờ

– Coliforms chịu nhiệt = coliforms +

lên men lactose và sinh hơi trên môi

trường canh EC ở 44oC trong 24

giờ

– Coliforms phân = coliforms chịu

nhiệt + sinh indol trong canh

Trypton ở 44,5oC trong 24 giờ

– E.coli = coliforms phân + IMViC

(++ )

Sa lm

on el la

Tóm lại

Trang 19

 Định lượng Coliforms, Coliform phân

bằng pp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc:

-Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Đếm số khuẩn lạc lên men lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1 o C trong 24-48h Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị như neutral red, crystal violet.

-Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm Xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật

Trang 20

 Định lượng Coliforms, Coliform phân

bằng pp đếm khuẩn lạc:

Nguyên tắc:

-Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 440C

-Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lệ khẳng định và

độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa.

Trang 21

đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC.

Trang 23

Định lượng Coliforms, Coliform phân và

Trang 24

Đếm số ống canh EC(+)& Indol(+),

Trang 25

10 5 Độ pha loãng cuối

Mẫu được đồng nhất hóa và pha loãng, sao cho

chứa < 100 tế bào Coliforms trong 1ml dd pha loãng.

Pha loãng mẫu

Quy trình phân tích Coliforms và

Coliforms phân

Trang 26

Chọn lọc KL coliform

Trang 27

Khuẩn lạc coliforms đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ đến đỏ đậm , có vùng tủa muối

mật, đường kính ≥0,5mm

Đếm số khuẩn lạc đặc trưng

Tính: N = tổng số KL đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy

Trang 28

- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL Ủ các ống BGBL ở 37  1 o C trong 24 – 48 giờ.

- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham Ghi nhận số ống (+).

- Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định.

Trang 29

Chọn 5 KL đặc trưng

cấy sang 5 ống BGBL

Ủ 37 o C/24 – 48h

Kiểm tra khả năng lên men Lactose và sinh hơi

Tỉ lệ khẳng định

R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã

cấy)

Trang 30

Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.

Trang 31

Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân:

- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ,

dùng que cấy vòng cấy chuyền sang

các ống nghiệm chứa môi trường EC.

- Ủ các ống EC ở 44oC trong 24-48 giờ.

- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn

tăng trưởng làm đục môi trường & sinh

hơi trong ống Durham Ghi nhận số

ống (+).

Trang 32

Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi và làm đục môi trường với mỗi độ pha loãng.

Trang 33

Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân:

- Các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC được cấy qua môi trường canh Trypton để thực hiện thêm thử nghiệm indol ở 44oC

- Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên môi trường EC vừa là (+) trên thử nghiệm indol.

Tỉ lệ khẳng định

R = (Số KL indol (+) / (Số KL đã cấy)

Trang 34

Kết quả thử nghiệm Indol

(+) (-)

(+): Sự xuất hiện của

Trang 35

N : tổng số khuẩn lạc đếm được

ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi

độ pha loãng

v : dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

fi : độ pha loãng có khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

Trang 36

Quy trình phân tích E.coli

Mẫu được đồng nhất, pha loãng và định lượng tương tự như phần Coliforms phân với các bước khẳng định được tiến hành như sau:

- Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyền sang môi trường EC ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h  chọn các ống có sinh hơi (+).

Trang 37

Quy trình phân tích E.coli

- Dùng que cấy vòng cấy chuyền từ các ống (+) trên EC sang các môi trường sau: Canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24h.

- Thực hiện thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate Ghi nhận

số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định

E.coli (+) (IMViC là ++ ).

Trang 38

Kết quả thử nghiệm Indol

(+): Sự xuất hiện của

Trang 40

Kết quả thử nghiệm VP

Klebsiella pneumonia (+)

Trang 41

Kết quả thử nghiệm Citrate

Klebsiella pneumonia (+) E coli (-)

(+): Môi trường

chuyển sang màu

xanh dương.

(-): Môi trường giữ

nguyên màu xanh

lục.

Trang 42

Khuẩn lạc E Coli giả định cho kết quả

thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ + - -) chính

là E coli.

Kết quả thử nghiệm IMViC:

(-) (+) (-) (+)

Trang 45

Rót vào mỗi ống nghiệm có chứa ống Durham 10

ml môi trường BGBL Hấp ở 110oC trong 15 phút,

Trang 46

Môi trường EC:

Trang 47

Môi trường canh Tryptone:

Trang 48

Môi trường MR-VP Broth:

Trang 49

Môi trường 2:

Môi trường MR-VP Broth:

Trang 52

Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar)

Trang 53

Môi trường thạch VRB (Violet Red Bile Agar)

Trang 55

Thuốc thử methyl red:

Trang 57

VÍ DỤ: Kiểm tra định lượng

Coliforms, Coliforms phân và E.coli có trong 1ml sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp Pasteur.

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Trang 58

- Dùng pipet vô trùng hút chính xác 1ml mẫu và

pha loãng thành các dãy thập phân kế tiếp nhau Cuối cùng thu được các dịch mẫu có các nồng độ

thập phân như sau: 10-1,10-2 ,10-3

Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích:

Độ pha loãng cuối

Trang 59

Chọn lọc KL coliform

Cấy mẫu:

Trang 60

-Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3 .Tiến hành lặp lại 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ

-Tất cả các thao tác cần phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Cũng như các dụng cụ có liên quan phải đảm bảo được

vô trùng trước đó.

-Kết quả khuẩn lạc trên môi trường VRB như sau:

Trang 61

Khuẩn lạc coliforms đặc trưng trên môi trường VRB có màu đỏ đến đỏ đậm , có vùng tủa muối

mật, đường kính ≥0,5mm

Đếm số khuẩn lạc đặc trưng

Tính: N = tổng số KL đặc trưng trên tất cả các đĩa cấy

Trang 63

- Từ tổng số khuẩn lạc đếm được trên 6 đĩa, chọn bất kì

5 khuẩn lạc nghi ngờ từ các đĩa (2 KL (khuẩn lạc) từ 2 đĩa của 10 -1 , 1 KL từ 1 đĩa của 10 -2 và 2 KL từ 2 đĩa của 10 -3 ), dùng que cấy vòng vô trùng cấy chuyền sang

5 ống nghiệm chứa môi trường BGBL có chứa ống Durham úp ngược Ủ ở 37 o C  1 o C trong 24 – 48h.

- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham Ghi nhận số ống (+).

Trang 64

Chọn 5 KL đặc trưng

cấy sang 5 ống BGBL

Ủ 37 o C/24 – 48h

Kiểm tra khả năng lên men Lactose và sinh hơi

Tỉ lệ khẳng định

R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Số KL đã

cấy)

Trang 65

Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi với mỗi độ pha loãng.

Trang 66

N : tổng số khuẩn lạc đếm được.

ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi

độ pha loãng

v : dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

fi : độ pha loãng có khuẩn lạc được chọn tại

Trang 67

Kết quả thu được như sau:

Tính mật độ Coliforms theo công thức:

= 2,1.102 (CFU/ml)

Trang 68

- Tương tự, chọn bất kì 5 khuẩn lạc nghi ngờ từ các đĩa (2 KL từ 2 đĩa của 10-1, 1 KL từ 1 đĩa của

10-2 và 2 KL từ 2 đĩa của 10-3), nhưng dùng que cấy vòng vô trùng cấy chuyền sang 5 ống nghiệm chứa môi trường EC có chứa ống Durham úp ngược Ủ ở 44oC trong 24 – 48h

- Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham

Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân

Trang 69

Chọn 5 KL đặc trưng

cấy sang 5 ống EC

Ủ 44 o C/24 – 48h

Kiểm tra khả năng lên men Lactose và sinh hơi

Ghi nhận số ống (+) có sinh hơi và làm đục môi

trường ứng với mỗi độ pha loãng.

Trang 71

- Từ các ống nghiệm cho kết quả (+) trên EC tiếp tục cấy chuyền sang môi trường canh Trypton để thử nghiệm Indol ở 44oC.

- Th nghi m ử nghiệm ệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi sinh hơi trên EC và có phản ứng Indol dương tính.

- Ghi nhận kết quả Indol (+).

Trang 72

Các độ pha loãng cho (+) trên EC 10 -1 10 -1 10 -2

Tỷ lệ khẳng định coliforms phân (R)

5 2

 Trên thử nghiệm Indol

 Trên môi trường EC

Trang 73

- Tính kết quả:

 Tương tự Coliforms cách tính mật độ Coliforms

phân cũng được tính theo công thức sau:

= 1,4.102 (CFU/ml)

Trang 74

-Từ các ống nghiệm cho kết quả (+) trên EC

đã được xác định ở bước làm thử nghiệm khẳng định Coliforms phân tiếp tục cấy chuyền sang các môi trường sau:Canh Trypton, canh MR- VP và thạch Simmon Citrate.

-Ủ các môi trường trên ở 44  0,5oC trong 24h để thực hiện các thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges- Proskauer và Citrate

Thử nghiệm khẳng định E.coli

Trang 75

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Mục đích: Phát hiện các VSV có khả năng sinh

indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase.

Cơ sở sinh hóa:

-Tryptophan bị oxi hóa bởi một số VSV có hệ enzyme Tryptophanase tạo nên sản phẩm trung gian chính là indolpyruvic acid (IPA).

-IPA bị biến đổi theo hướng loại nhóm amin để tạo thành indol Indol được phát hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- DMABA.

-Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.

Trang 76

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Chủng VSV MT canh

tryptone

Thu c th ốc thử ử Kovac’s

  44,5 0,2 o C / 24h

E.Coli (+) Klebsiella (-)

Trang 77

Thử nghiệm MR (Methyl red)

• Mục đích: Phân biệt các VSV dựa trên sự khác

biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose.

• Cơ sở sinh hóa:

+ pH dưới 4.4: Màu đỏ

+ pH 5.0 - 5.8: Màu hồng cam

+ pH trên 6.0: Màu vàng

Trang 78

-MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid

 môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử.

nuôi cấy – các sản phẩm có tính acid bị chuyển hóa thành các sản phẩm trung tính – pH môi trường

dần trung tính  môi trường có màu vàng

Trang 79

Thử nghiệm MR (Methyl red)

Trang 80

Thử nghiệm VP(Voges–Proskauer)

• Mục đích: Phát hiện các VSV dựa trên

sự khác biệt về khả năng tạo ra acetoin trong quá trình lên men glucose

• Cở sở sinh hóa:

Trang 81

Phức màu đỏ

Trang 82

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

E coli (-)

Trang 83

Thử nghiệm Citrate

• Mục đích: Phát hiện các VSV dựa trên sự khác

biệt về khả năng sử dụng citrat như là nguồn cacbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vật chất.

• Cở sở sinh hóa:

-VSV sử dụng citrate là nguồn carbon duy

-VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm

Trang 84

Thử nghiệm Citrate

Chủng

VSV

MT thạch nghiêng SCA

ĐC (-) (+)

 

44,5 0,2 o C / 24h

Trang 85

Khuẩn lạc E Coli giả định cho kết quả

thử nghiệm IMViC tuần tự là (+ + - -) chính là

E coli.

Kết quả thử nghiệm IMViC:

Indol(+) MR(+) VP(-) Citrate(-)

Trang 86

-Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm

khẳng định E.coli (+) khi (IMViC là +

Trang 87

Kết quả thu được như sau:

 Tương tự Coliforms, Coliforms phân cách tính mật

độ E.coli cũng được tính theo công thức sau:

Trang 88

Các chỉ tiêu cho mẫu

sữa tươi tiệt trùng

theo pp Pasteur

Quy định BYT 4/1998 Kết quả kiểm tra

Coliforms (trong

Chỉ tiêu Coliforms và E.coli trong mẫu sữa tươi

không nằm trong giới hạn cho phép của BYT 4/1998 đặt ra Vì vậy phải tiến hành tiệt trùng lại hoặc loại mẫu ngay để đảm bảo VSATTP

(Theo Bảng 1.2 Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm, BYT

4/1998 , trang 23 của Trần Linh Thước)

KẾT LUẬN

Trang 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO

trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo Dục Tp.HCM, 2009.

02

http://luanvan.co/luan-van/khao-sat-tinh-hinh-nhiem-e-coli-va-coliforms-trong-nuoc-uong-nuoc-co-gas-nuoc-c o-con-tren-dia-ban-quan-thu-duc-2409/

ococcus-aureus-va-escherichia-coli-trong-thuc-pham-ta i-khu-vuc-cho-thi-nghe-2420/

guyen-nhan-nhiem-vi-sinh-vat-trong-san-pham-cha-gio -che-566.html

Trang 90

Chân thành cảm ơn Thầy

& các bạn đã lắng nghe

Ngày đăng: 13/07/2014, 20:34

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w