Xác định staphylococcus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và MPN 1 2.1.1. Nguyên tắc: S.aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. 2.1.2. Môi trường và thuốc thử: - Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng để định tính S.aureus hay cũng có thể dùng trong định lượng bằng phương pháp Most Probable Number (MPN). - Môi trường thạch Mannitol muối – Mannitol Salt Agar (M35): Nếu không sử dụng môi trường thạch Baird – Parker, ta có thể sử dụng môi trường thạch Mannitol muối. Thành phần chính của môi trường này gồm có peptone, chất chiết từ thịt bò, Mannitol, NaCl và Phenol đỏ. Nồng độ muối trong môi trường khá cao (7,5%) sẽ ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật. - Mannitol là nguồn Carbonhydrate duy nhất để vi khuẩn lên men. Trên môi trường thạch Mannitol muối, S. aureus cho khuẩn lạc màu vàng, còn S. epidermidis (không lên men Mannitol) sẽ cho khuẩn lạc màu đỏ. - Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay máu bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate. Môi trường cần được pha trước 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. - Môi trường thạch Braid Parker Agar (BPA): là môi trường chọn lọc thường sử dụng để phát hiện S.aureus. Môi trường có chứa pepton và chất chiết thịt bò là những thành phần dinh dưỡng cơ bản. Glycine và sodium pyruvate có chức năng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn. Lithium chloride và potassium tellurite được sử dụng để ức chế vi khuẩn Gram âm và làm chậm sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương khác. Lòng đỏ trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng sinh tổng hợp lycithinase của S.aureus. - Lưu ý: lòng đỏ trứng và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi đã khử trùng và làm nguội đến khoảng 60 o C. Tụ cầu sinh tổng hợp coagulase trên môi trường này sẽ có màu đen. Sự sinh tổng hợp lecithinase của vi khuẩn sẽ tạo nên vòng sáng xung quanh các khuẩn lạc. - Môi trường dịch thể tim óc-Braid heart infusion broth (M36): thành phần cơ bản của môi trường gồm óc bê, tim bò, peptone, glucose và muối NaCl. Đây là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để thúc đẩy sự sinh trưởng của nhóm vi sinh vật có nhu cầu về dinh dưỡng. - Huyết thanh thỏ có bổ sung ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA): được sử dụng để kiểm tra hoạt tính coagulase của vi khuẩn. Huyết thanh thường được cung cấp ở dạng đông khô. EDTA có chức năng như một tác nhân chống đông tụ. Quá trình hoàn nguyên huyết thanh được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất. 2.1.3. Phương pháp: 2.1.3.1. Phân tích định tính S.aureus: - Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MBS, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ. - Dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu từ ống dương tính (môi trường chuyển từ đỏ sang vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Perker, ủ ở 37 o C trong 24 giờ. - Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường phân lập tròn, lồi, có tâm đen, trong suốt, đường kính 1-1.5mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc. - Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ 37 o C 24 giờ. - Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0.3ml huyết tương và ủ ở 37 o C trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết. - Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được kết luận là có S.aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tính (nghĩa là có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng thì không có). 2 2.1.3.2. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: a./ Đồng nhất mẫu pha loãng: Cân chính xác 10 ± 0.1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa. b./ Phân lập trên môi trường chọn lọc: - Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1 0 C trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu. - Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh. - Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc. - Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S. Aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này. c./ Khẳng định: - Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 1 0 C trong 24 giờ. - Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 ± 1 0 C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2,4,6,8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. d./ Cách tính kết quả: - Mật độ S.Aureus trong mẫu được tính như sau : Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(N t H t + N a H a )/( F 1 +F 2 ) - Trong đó: + F: là độ pha loãng + N t : tổng số khuẩn lạc đặc trưng + N a : tổng số khuẩn lạc không đặc trưng + H t : tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng + H a : tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng. ***Phân loại Staphylococcus bằng kháng nguyên: - Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn. Các kháng nguyên trên bề mặt tế bào được quan tâm. - Acid teichoic : là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác dụng hoạt hóa bổ thể. Đây là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này gắn polysaccharid vách tụ cầu vàng. Đây là kháng nguyên O. 3 - Protein A : là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu chuẩn để xác định tụ cầu vàng. 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này. - Vỏ polysaccharid: một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát được bằng phương pháp nhuộm vỏ. - Lớp vỏ bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên và có thể chứng minh được bằng phương pháp huyết thanh học. Vỏ của tụ cầu cũng có tác dụng chống thực bào bởi vỏ đã che phủ peptidoglycan của vách, làm cho bổ thể này không có chỗ bám để hoạt hóa theo con đường tắt. Đặc điểm sinh hoá: - Phát triển tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh. Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu. - Phản ứng indol, NH 3 , thủy phân gelatine, đông huyết tương. - Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn trơn bóng, đục mờ. - Trên môi trường lỏng tế bào ở dạng cặn, vòng nhãn mờ trong ống nghiệm ở bề mặt môi trường. - Tính chất nuôi cấy: + Vi khuẩn phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S. aureus là 18 – 40 0 C, pH=7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 0 C, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao. + Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 0 C, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35-37 0 C. + Những chủng khác nhau làm tan máu ở những mức độ khác nhau, ở thạch máu, typ tan máu β thường được quan sát xung quanh khuẩn lạc. S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến nên thhường có mặt trong nhóm thực phẩm đã được qua chế biến và nấu chín. - Tính chất sinh hoá và đề kháng: + Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác, chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác. + S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine. + Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase ( beta – lactamase). Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. + Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như vi khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn. - Cấu trúc kháng nguyên: + Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở vách tế bào. + Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề mặt. Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chuẩn đoán vi khuẩn. 4 - Độc tố - Enzym: + Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm + Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15 o C hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S. aureus là một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 0 C và có thể tồn tại nhiệt ở 100 °C trong vòng 30 – 700 phút. + Các enzyme ngoại bào: Protease phân giải protein của tế bào chủ. Lipase phân giải lipid. Deoxyribonuclease ( DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME). Cơ chế gây bệnh: - Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao gồm: + Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu. + Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. - S.aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. - Tác nhân gây bệnh như S.aureus mới có khả năng khởi động các quá trình sinh hóa đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật chủ. - S.aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase, hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ. - Hầu hết các chủng S. aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiên tượng gắn độc này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa, chúng là các receptor cho các đại thực bào. Qúa trình gắn trên giúp S. aureus tránh không bị đại thực bào. Ngoài ra, phần lớn các chủng S. aureus một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. - Ước tính khoảng 0,1µg S.aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người. Bệnh và các triệu chứng bệnh: - S.aureus có mặt ở khắp nơi trong thiên nhiên như: không khí, nước, da, họng, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng…và chỉ gây độc khi hình thành độc tố ruột (Enterotoxin). Những trường hợp nhiễm độc đầu tiên do ăn bánh kẹo gây ra bởi tụ cầu vàng đã được nói đến từ những năm 1901-1914. Ở Việt Nam cũng như trên khắp thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên. - Khả năng gây độc chỉ xảy ra khi ăn thức ăn cùng độc tố của vi khuẩn. Còn nếu chỉ ăn vi khuẩn thì không gây ra ngộ độc. Điều đó chứng tỏ, ngộ độc là do độc tố của vi khuẩn được sản xuất ra trong môi trường thức ăn với sự hoạt động của vi khuẩn, độc tố ruột là một loại độc tố mạnh. - S.aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: mụn nhọt, chốc lở, viêm da, viêm phổi, viêm não, viêm tủy sương, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng ngoài tim, viêm màng não, áp-xe trong cơ, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẩu. 5 . Xác định staphylococcus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và MPN 1 2.1.1. Nguyên tắc: S.aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng huyết tương. số khuẩn lạc đặc trưng + N a : tổng số khuẩn lạc không đặc trưng + H t : tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng + H a : tỷ số giữa số khuẩn lạc. rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc. - Trên môi trường thạch