I. NGUYÊN TẮC Tổng số vi khuẩn hiếu khí là tổng số những vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong môi trường. Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm có thể xác định bằng phương pháp nuôi cấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ. Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri cho phép xác định được lượng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môi trường trong mẫu ban đầu. Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25250 khuẩn lạc. Nếu vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha loãng lớn hơn. Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá tr ìn h c h ế b iế n , b ả o q u ả n sả n p h ẩ m . II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT Môi trường sử dụng: Plate count agar (PCA), pH = 7.0 ± 0.2 • Casein peptone: 5.0g • Cao nấm men: 2.5g • Dextrose: 1.0g • Agar: 15.0g • Nước cất đủ 1000ml Môi trường được nấu sôi cho tan agar, phân phối vào bình tam giác, hấp tiệt trùng ở 121oC20 phút, để ấm (45 – 50oC) phân phối vào các đĩa petri. • Nước muối sinh lý 0.9%. • Nước cất vô trùng. • Cồn 96o. • Nước mía. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. LẤY MẪU Quy trình lấy mẫu có những yêu cầu sau: • Lấy các mẫu có tính chất đại diện, lượng mẫu vừa đủ. • Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng. • Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, không được để quá 24h. • Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu. 2. PHA LOÃNG MẪU
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 14 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC I. NGUYÊN TẮC Tổng số vi khuẩn hiếu khí là tổng số những vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong môi trường. Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm có thể xác định bằng phương pháp nuôi cấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ. Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri cho phép xác định được lượng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môi trường trong mẫu ban đầu. Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250 khuẩn lạc. Nếu vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha loãng lớn hơn. Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá tr ìn h c h ế b iế n , b ả o q u ả n sả n p h ẩ m . II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT Môi trường sử dụng: Plate count agar (PCA), pH = 7.0 ± 0.2 • Casein peptone: 5.0g • Cao nấm men: 2.5g • Dextrose: 1.0g • Agar: 15.0g • Nước cất đủ 1000ml Môi trường được nấu sôi cho tan agar, phân phối vào bình tam giác, hấp tiệt trùng ở 121 o C/20 phút, để ấm (45 – 50 o C) phân phối vào các đĩa petri. • Nước muối sinh lý 0.9%. 1 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG • Nước cất vô trùng. • Cồn 96 o . • Nước mía. III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. LẤY MẪU Quy trình lấy mẫu có những yêu cầu sau: • Lấy các mẫu có tính chất đại diện, lượng mẫu vừa đủ. • Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng. • Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, không được để quá 24h. • Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu. 2. PHA LOÃNG MẪU Hình 14.1 Pha loãng mẫu 2 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG 3. QUY TRÌNH Hình 14.2 Quy trình tạo hộp đổ 4. CÁCH ĐẾM – CÔNG THỨC TÍNH 3 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG Mẫu Đồng nhất Pha loãng Hộp trảiHộp đổ Ủ 37 o C (24 – 72h) Tính kết quả Đếm khuẩn lạc ( 25 ≤ n ≤ 250 ) THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG 4.1. Cách đếm Hình 14.3 Các thiết bị đếm khuẩn lạc Cách đếm thủ công: • Lấy bút chì kẻ hai đường vuông góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng I, II, III, IV. • Đếm số lượng khuẩn lạc từng vùng. Nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm. 4.2. Công thức tính: N(CFU / g hay CFU / ml) = )11 ( ii vdnvdn C ++ ∑ Trong đó: • N: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu (CFU: colony forming units); • C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoãng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa); • n i : số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ I; • d i : hệ số pha loãng tương ứng; • v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý • Khi tiến hành pha loãng mẫu, các dung dịch phải được hút đúng thể tích yêu cầu. • Đối với phương pháp tạo hộp đổ, môi trường nuôi cấy sau khi hấp tiệt trùng phải được làm nguội đến 15 – 50 o C trước khi đổ vào đĩa petri chứa dung dịch vi sinh vật. • Các đĩa petri nuôi cấy vi sinh vật phải được lật úp trước khi nuôi ủ để tránh các khuẩn lạc ở bề mặt mọc loang. • Trong quá trình đếm khuẩn lạc, không được mở hộp petri. • Que trải thủy tinh dủng để trải dung dịch vi sinh vật được khử trùng bằng cách nhúng vào cồn 96 o rồi đốt, không được hơ trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn. V. BÁO CÁO THỰC TẬP Trình bày phương pháp định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. 4 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG CẤY THEO PHƯƠNG PHÁP TẠO HỘP ĐỔ: • Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 để cấy mẫu. • Ghi vào nắp đỉa petri có môi trường thạch các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy. • Dùng pipette đã vô trùng lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đỉa petri (đã vô trùng). • Cho khoảng 15ml môi trường PCA ở nhiệt độ khoảng 45 o C vào hộp đĩa petri. Xoay chậm cho hỗn hợp trộn đều. Để yên cho nguội. Lật ngược cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30 o C trong 72h. • Mỗi mẫu cấy ba nồng độ. Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri. • Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả. PHƯƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT • Dịch huyền phù được chuẩn bị tương tự như phương pháp tạo hộp đổ. • Môi trường PCA sau khi được hấp tiệt trùng, được làm nguội đến khoảng 50 – 60 o C sau đó đổ vào đĩa petri vô trùng. • Đĩa petri chứa môi trường được làm khô bề mặt bằng cách sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 35 o C hoặc chuẩn bị trước 2 ngày. • Dùng pipette vô trùng hút chính xác 0.1ml hoặc 0.3 ml nhỏ lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. • Trải đều dung dịch vi sinh vật lê bề mặt môi trường bằng que trải tam giác thủy tinh. • Các đĩa petri được để để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô bề mặt. Lật ngược cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30 o C trong 72h. • Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ. Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri. • Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả. So sánh ưu và nhược điểm của phương pháp tạo hộp đổ và phương pháp cấy trải bề mặt. Phương pháp cấy trải: • Ưu điểm: độ đồng đều cao (khuẩn lạc mọc đều) nên dễ nhận dạng các khuẩn lạc đặc trưng • Nhược điểm: o Thời gian trải lâu o Thể tích mẫu cấy nhỏ o Dễ nhiễm Phương pháp tạo hộp đổ: 5 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG • Ưu điểm: thể tích mẫu cấy lớn, mật độ vi sinh vật cao, thao tác nhanh, dễ dàng. • Nhược điểm: o Dễ làm vi sinh vật chết nếu môi trường chưa hạ xuống nhiệt độ 45 0 C. o Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định. o Khó đếm do khuẩn lạc chồng lặp. 6 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG