I. NGUYÊN TẮCNhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.1. MỤC ĐÍCH•Giúp việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc tế bào của vi sinh vật được dễ dàng.•Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc ăn màu khác nhau đối với các loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dạng vi sinh vật ( nhuộm màu Gram ).2. PHÂN LOẠIỞ bài này sẽ tìm hiểu quá trình nhuộm không cố định và phương pháp nhuộm Gram thuộc phương pháp nhuộm cố định.II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤTCác dung dịch nhuộm:•Dung dịch xanh methylen•Dung dịch tím kết tinh ( Crystal violet )•Dung dịch lugol•Dung dịch tẩy màu•Dung dịch nhuộm bổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin )III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM1. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH•Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính.•Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật vào giọt thuốc nhuộm.•Đậy lá kính lên giọt kính•Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40).2. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ( sử dụng phương pháp NHUỘM GRAM ).
Trang 1BÁO CÁO TH C HÀNH ỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
I NGUYÊN T C ẮC
Nhu m màu là quá trình làm cho t bào ho c các thành ph n c a t bào vi sinh ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ặc các thành phần của tế bào vi sinh ần của tế bào vi sinh ủa tế bào vi sinh ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
v t có màu dật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.i tác d ng c a các lo i thu c nhu m.ụng của các loại thuốc nhuộm ủa tế bào vi sinh ại thuốc nhuộm ốc nhuộm
1 M C ĐÍCH ỤC ĐÍCH
Giúp vi c quan sát hình d ng t bào, các thành ph n c u trúc t bào c a ại thuốc nhuộm ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ần của tế bào vi sinh ấu trúc tế bào của ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ủa tế bào vi sinh
vi sinh v t đật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ược dễ dàng.c d dàng.ễ dàng
Giúp phân bi t các ch ng vi sinh v t v i nhau do vi c ăn màu khác nhau ủa tế bào vi sinh ật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm
đ i v i các lo i thu c nhu m t o đi u ki n cho vi c phân lo i, đ nh d ng ốc nhuộm ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ại thuốc nhuộm ốc nhuộm ại thuốc nhuộm ều kiện cho việc phân loại, định dạng ại thuốc nhuộm ịnh dạng ại thuốc nhuộm
vi sinh v t ( nhu m màu Gram ).ật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm
sinh vật
Nhuộm không cố định Nhuộm cố định
Nhuộm đơn Nhuộm kép
Nhuộm tiên mao Nhuộm bào tử
Nhuộm Ziehl
- Neelsen Nhuộm Gram
Trang 2bài này sẽ tìm hi u quá trình nhu m không c đ nh và ph ểu quá trình nhuộm không cố định và phương pháp ộm không cố định và phương pháp ố định và phương pháp ịnh và phương pháp ương pháp ng pháp nhu m Gram thu c ph ộm không cố định và phương pháp ộm không cố định và phương pháp ương pháp ng pháp nhu m c đ nh ộm không cố định và phương pháp ố định và phương pháp ịnh và phương pháp
II D NG C , MÔI TR ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT ỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT ƯỜNG VÀ HÓA CHẤT NG VÀ HÓA CH T ẤT
Các dung d ch nhu m:ịnh dạng
Dung d ch xanh methylenịnh dạng
Dung d ch tím k t tinh ( Crystal violet )ịnh dạng ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
Dung d ch lugolịnh dạng
Dung d ch t y màuịnh dạng ẩy màu
Dung d ch nhu m b sung ( Safranin O ho c Fuchsin )ịnh dạng ổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin ) ặc các thành phần của tế bào vi sinh
III TI N HÀNH THÍ NGHI M ẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ỆM
1 NHU M MÀU VI SINH V T KHÔNG C Đ NH ỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH ẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH Ố ĐỊNH ỊNH
Nh 1 gi t thu c nhu m xanh methylen 0.001% lên phi n kính.ỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ốc nhuộm ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
Nh 1 gi t canh trỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ng vi sinh v t ho c hòa m t ít sinh kh i vi sinh v t ật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ặc các thành phần của tế bào vi sinh ốc nhuộm ật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm vào gi t thu c nhu m.ọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ốc nhuộm
Đ y lá kính lên gi t kínhật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính
Quan sát tiêu b n v t kính (x10) r i (x40).ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ở vật kính (x10) rồi (x40) ật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ồi (x40)
2 NHU M MÀU VI SINH V T C Đ NH ( s d ng ph ỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH ẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH Ố ĐỊNH ỊNH ử dụng phương pháp NHUỘM ụng phương pháp NHUỘM ương pháp ng pháp NHU M ỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH GRAM ).
Trang 3 Quy trình nhu m Gram: ộm Gram:
Vết đồ
Rửa nước
Rửa nước
Phủ tím kết tinh ( Crystal violet )
Tẩy cồn
Đã nhuộm
Phủ safranin hoặc Fuchsin
Rửa nước
Phủ lugol
Rửa nước
1phú
15
1phú
15
15
15
15 1phú
Trang 4 K t Qu : ết Quả: ả:
1 Crystal Violet 1’R a nử ưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.c 15’’ Tím Tím
ử ưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm
3 T y màu 5 - 15’’R a nẩy màuử ưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.c 15’’ Tím Không màu
4 Saranin 1’R a nử ưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.c 15’’ Tím H ngồi (x40)
K t quế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ản ở vật kính (x10) rồi (x40) Tím H ngồi (x40).
Xem tiêu b n v t kính x100 ả: ở vật kính x100 ật kính x100
IV BÁO CÁO TH C T P ỰC TẬP ẬT
Sau khi nhu m, vi khu n Gram d ộm không cố định và phương pháp ẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có ương pháp ng có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu đ vàng hay đ tía Gi i thích nguyên nhân? ỏ vàng hay đỏ tía Giải thích nguyên nhân? ỏ vàng hay đỏ tía Giải thích nguyên nhân? ải thích nguyên nhân?
Quá trình nhu m tr i qua các lo i thu c nhu m sau:ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ại thuốc nhuộm ốc nhuộm
Nhu m b ng dung d ch tím k t tinh đ vi khu n b t màu tím.ằng dung dịch tím kết tinh để vi khuẩn bắt màu tím ịnh dạng ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ể vi khuẩn bắt màu tím ẩy màu ắt màu tím
Nhu m ti p b ng dung d ch lugol đ màu tím c a dung d ch tím k t tinh ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ằng dung dịch tím kết tinh để vi khuẩn bắt màu tím ịnh dạng ể vi khuẩn bắt màu tím ủa tế bào vi sinh ịnh dạng ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
g m ch t h n trên vi khu n.ắt màu tím ặc các thành phần của tế bào vi sinh ơn trên vi khuẩn ẩy màu
Khi ph lên dung môi h u c Etanol, Axetol thì vi khu n Gram âm b t y, ủa tế bào vi sinh ữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, ơn trên vi khuẩn ẩy màu ịnh dạng ẩy màu lipit c a l p màng ngoài b tan làm tăng tính th m c a màng d n đ n s ủa tế bào vi sinh ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ịnh dạng ấu trúc tế bào của ủa tế bào vi sinh ẫn đến sự ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ự
r a trôi ph c ch t tím tinh th - Iot và làm cho vi khu n m t màu Khi ử ứ tự ấu trúc tế bào của ể vi khuẩn bắt màu tím ẩy màu ấu trúc tế bào của nhu m b sung chúng sẽ b t màu v i thu c nhu m (màu đ vàng v i ổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin ) ắt màu tím ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ốc nhuộm ỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm Safranin, đ tía v i Fuchsin) Đ i v i nhóm gram dỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ốc nhuộm ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ươn trên vi khuẩn.ng, dung môi h u c ữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, ơn trên vi khuẩn Etanol, Axetol làm cho các l trong Peptidoglican co l i do đó ph c ch t ỗ trong Peptidoglican co lại do đó phức chất ại thuốc nhuộm ứ tự ấu trúc tế bào của tím tinh th - Iot b gi l i trong t bào.ể vi khuẩn bắt màu tím ịnh dạng ữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, ại thuốc nhuộm ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
N u không nhu m b sung thu c nhu m Safranin ho c Fuchsin, vi khu n ộm không cố định và phương pháp ổ sung thuốc nhuộm Safranin hoặc Fuchsin, vi khuẩn ố định và phương pháp ộm không cố định và phương pháp ặc Fuchsin, vi khuẩn ẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có Gram âm có màu gì? T i sao? ại sao?
N u không nhu m b sung thu c nhu m Safranin ho c Fuchsin, vi khu n Gram ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin ) ốc nhuộm ặc các thành phần của tế bào vi sinh ẩy màu
âm sẽ không có màu, đ i v i vi khu n Gram âm, h n h p kh màu đóng vai trò làốc nhuộm ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ẩy màu ỗ trong Peptidoglican co lại do đó phức chất ợc dễ dàng ử
ch t làm tan màng ngoài c a thành t bào, có b n ch t là lipide L p ấu trúc tế bào của ủa tế bào vi sinh ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ấu trúc tế bào của ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm
peptidoglycan m ng không th gi l i ph c h p tím tinh th -iot và t bào Gram ỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ể vi khuẩn bắt màu tím ữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, ại thuốc nhuộm ứ tự ợc dễ dàng ể vi khuẩn bắt màu tím ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
âm b kh màu ịnh dạng ử
Trang 5Vẽ hình th tr ịnh và phương pháp ường kính hiển vi có vi sinh vật trong trường hợp nhuộm vi ng kính hi n vi có vi sinh v t trong tr ểu quá trình nhuộm không cố định và phương pháp ật trong trường hợp nhuộm vi ường kính hiển vi có vi sinh vật trong trường hợp nhuộm vi ng h p nhu m vi ợp nhuộm vi ộm không cố định và phương pháp sinh v t không c đ nh và nhu m vi sinh v t c đ nh ật trong trường hợp nhuộm vi ố định và phương pháp ịnh và phương pháp ộm không cố định và phương pháp ật trong trường hợp nhuộm vi ố định và phương pháp ịnh và phương pháp
Nhu m vi sinh v t c đ nh Nhu m vi sinh v t không c đ nh ộm Gram: ật kính x100 ộm Gram: ật kính x100 ( Nhu m Gram – Gram âm) ộm Gram:
Nêu ít nh t 5 nguyên nhân khi nhu m vi khu n Gram ( + ) cho k t qu vi ất 5 nguyên nhân khi nhuộm vi khuẩn Gram ( + ) cho kết quả vi ộm không cố định và phương pháp ẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có ải thích nguyên nhân? khu n Gram ( - ) và ng ẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có ượp nhuộm vi ại sao? c l i.
5 nguyên nhân khi nhu m vi khu n Gram dẩy màu ươn trên vi khuẩn.ng cho k t qu vi khu n Gram âm ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ẩy màu ( vi khu n Gram dẩy màu ươn trên vi khuẩn.ng có màu h ng ):ồi (x40)
Th i gian t y màu quá lâu làm cho ph c ch t tím k t tinh – iot b r a trôi.ờng vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ẩy màu ứ tự ấu trúc tế bào của ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ịnh dạng ử
L a c y quá già, vì t bào già thứ tự ấu trúc tế bào của ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ng m t kh năng gi màu thu c nhu mấu trúc tế bào của ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, ốc nhuộm tím k t tinh khi t y b ng ethanol.ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ẩy màu ằng dung dịch tím kết tinh để vi khuẩn bắt màu tím
Dung d ch lugol b h ng nên không t o định dạng ịnh dạng ỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính ại thuốc nhuộm ược dễ dàng.c ph c v i dung d ch tím k t ứ tự ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ịnh dạng ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh tinh, k t qu sẽ b t y màu khi dùng dung d ch t y m u.ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ịnh dạng ẩy màu ịnh dạng ẩy màu ản ở vật kính (x10) rồi (x40)
Th i gian b t màu thu c nhu m tím k t tinh ch a đ lâu.ờng vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ắt màu tím ốc nhuộm ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ư ủa tế bào vi sinh
Th i gian đ dung d ch lugol t o ph c v i dung d ch tím k t tinh ch a đ ờng vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ể vi khuẩn bắt màu tím ịnh dạng ại thuốc nhuộm ứ tự ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ịnh dạng ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ư ủa tế bào vi sinh
5 nguyên nhân khi nhu m vi khu n Gram âm cho k t qu vi khu n Gram dẩy màu ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ẩy màu ươn trên vi khuẩn.ng ( vi khu n Gram âm có màu tím ):ẩy màu
C đ nh tiêu b n khi còn ốc nhuộm ịnh dạng ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.t , các h p ch t protein có trong môi trợc dễ dàng ấu trúc tế bào của ường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ng
ho c trong m u th làm tiêu b n khó t y màu.ặc các thành phần của tế bào vi sinh ẫn đến sự ử ản ở vật kính (x10) rồi (x40) ẩy màu
Trang 6 Th i gian t y màu quá nhanh khi n màu tím c a dung d ch tím k t tinh ờng vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ẩy màu ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ủa tế bào vi sinh ịnh dạng ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
ch a thoát ra h t.ư ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
Th i gian b t màu thu c nhu m tím k t tinh quá lâu.ờng vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ắt màu tím ốc nhuộm ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
Th i gian đ dung d ch lugol tao ph c v i dung d ch tím k t tinh quá lâu.ờng vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ể vi khuẩn bắt màu tím ịnh dạng ứ tự ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ịnh dạng ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh
Quá trình c đ nh m u ch a đ th i gian c ng v i quá trình r a b ng ốc nhuộm ịnh dạng ẫn đến sự ư ủa tế bào vi sinh ờng vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật ới tác dụng của các loại thuốc nhuộm ử ằng dung dịch tím kết tinh để vi khuẩn bắt màu tím
nưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.c quá lâu ho c r a tr c ti p vào m u khi n cho vi khu n gram âm b ặc các thành phần của tế bào vi sinh ử ự ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ẫn đến sự ế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh ẫn đến sự ịnh dạng
r a trôi.ử