I. NGUYÊN TẮCNhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.1. MỤC ĐÍCH•Giúp việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc tế bào của vi sinh vật được dễ dàng.•Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc ăn màu khác nhau đối với các loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dạng vi sinh vật ( nhuộm màu Gram ).2. PHÂN LOẠIỞ bài này sẽ tìm hiểu quá trình nhuộm không cố định và phương pháp nhuộm Gram thuộc phương pháp nhuộm cố định.II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤTCác dung dịch nhuộm:•Dung dịch xanh methylen•Dung dịch tím kết tinh ( Crystal violet )•Dung dịch lugol•Dung dịch tẩy màu•Dung dịch nhuộm bổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin )III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM1. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH•Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính.•Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật vào giọt thuốc nhuộm.•Đậy lá kính lên giọt kính•Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40).2. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ( sử dụng phương pháp NHUỘM GRAM ).
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP NHUÔM MÀU VI SINH VẬT I. NGUYÊN TẮC Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm. 1. MỤC ĐÍCH • Giúp việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc tế bào của vi sinh vật được dễ dàng. • Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc ăn màu khác nhau đối với các loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dạng vi sinh vật ( nhuộm màu Gram ). 2. PHÂN LOẠI Trần Thanh Tùng | MSSV: 10243221 Nhuộm màu vi sinh vật Nhuộm không cố địnhNhuộm cố định Nhuộm đơn Nhuộm kép Nhuộm tiên mao Nhuộm bào tử Nhuộm Ziehl - Neelsen Nhuộm Gram THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG Ở bài này sẽ tìm hiểu quá trình nhuộm không cố định và phương pháp nhuộm Gram thuộc phương pháp nhuộm cố định. II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT Các dung dịch nhuộm: • Dung dịch xanh methylen • Dung dịch tím kết tinh ( Crystal violet ) • Dung dịch lugol • Dung dịch tẩy màu • Dung dịch nhuộm bổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin ) III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH • Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính. • Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật vào giọt thuốc nhuộm. • Đậy lá kính lên giọt kính • Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40). 2. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ( sử dụng phương pháp NHUỘM GRAM ). • Quy trình nhuộm Gram: Trần Thanh Tùng | MSSV: 10243221 Vết đồ THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG • Kết Quả: Trần Thanh Tùng | MSSV: 10243221 15s Đã nhuộm Rửa nước Phủ safranin hoặc Fuchsin Rửa nước Tẩy cồn Rửa nước Phủ lugol Rửa nước Phủ tím kết tinh ( Crystal violet ) 1phút 1phút 15s 15s 15s 1phút 15s THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG Thứ tự Thuốc thử Gram ( + ) Gram ( - ) 1 Crystal Violet 1’ Tím Tím Rửa nước 15’’ 2 Lugol 1’ Tím Tím Rửa nước 15’’ 3 Tẩy màu 5 - 15’’ Tím Không màu Rửa nước 15’’ 4 Saranin 1’ Tím Hồng Rửa nước 15’’ Kết quả Tím Hồng • Xem tiêu bản ở vật kính x100 IV. BÁO CÁO THỰC TẬP Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thích nguyên nhân? Quá trình nhuộm trải qua các loại thuốc nhuộm sau: • Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh để vi khuẩn bắt màu tím. • Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol để màu tím của dung dịch tím kết tinh gắm chặt hơn trên vi khuẩn. • Khi phủ lên dung môi hữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, lipit của lớp màng ngoài bị tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - Iot và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm (màu đỏ vàng với Safranin, đỏ tía với Fuchsin). Đối với nhóm gram dương, dung môi hữu cơ Etanol, Axetol làm cho các lỗ trong Peptidoglican co lại do đó phức chất tím tinh thể - Iot bị giữ lại trong tế bào. Nếu không nhuộm bổ sung thuốc nhuộm Safranin hoặc Fuchsin, vi khuẩn Gram âm có màu gì? Tại sao? Nếu không nhuộm bổ sung thuốc nhuộm Safranin hoặc Fuchsin, vi khuẩn Gram âm sẽ không có màu, đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất làm tan màng ngoài của thành tế bào, có bản chất là lipide. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu. Trần Thanh Tùng | MSSV: 10243221 THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG Vẽ hình thị trường kính hiển vi có vi sinh vật trong trường hợp nhuộm vi sinh vật không cố định và nhuộm vi sinh vật cố định. Nhuộm vi sinh vật cố định Nhuộm vi sinh vật không cố định ( Nhuộm Gram – Gram âm) Nêu ít nhất 5 nguyên nhân khi nhuộm vi khuẩn Gram ( + ) cho kết quả vi khuẩn Gram ( - ) và ngược lại. 5 nguyên nhân khi nhuộm vi khuẩn Gram dương cho kết quả vi khuẩn Gram âm ( vi khuẩn Gram dương có màu hồng ): • Thời gian tẩy màu quá lâu làm cho phức chất tím kết tinh – iot bị rửa trôi. • Lứa cấy quá già, vì tế bào già thường mất khả năng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh khi tẩy bằng ethanol. • Dung dịch lugol bị hỏng nên không tạo được phức với dung dịch tím kết tinh, kết quả sẽ bị tẩy màu khi dùng dung dịch tẩy mảu. • Thời gian bắt màu thuốc nhuộm tím kết tinh chưa đủ lâu. • Thời gian để dung dịch lugol tạo phức với dung dịch tím kết tinh chưa đủ. 5 nguyên nhân khi nhuộm vi khuẩn Gram âm cho kết quả vi khuẩn Gram dương ( vi khuẩn Gram âm có màu tím ): • Cố định tiêu bản khi còn ướt , các hợp chất protein có trong môi trường hoặc trong mẫu thử làm tiêu bản khó tẩy màu. • Thời gian tẩy màu quá nhanh khiến màu tím của dung dịch tím kết tinh chưa thoát ra hết. Trần Thanh Tùng | MSSV: 10243221 THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG • Thời gian bắt màu thuốc nhuộm tím kết tinh quá lâu. • Thời gian để dung dịch lugol tao phức với dung dịch tím kết tinh quá lâu. • Quá trình cố định mẫu chưa đủ thời gian cộng với quá trình rửa bằng nước quá lâu hoặc rửa trực tiếp vào mẫu khiến cho vi khuẫn gram âm bị rửa trôi. Trần Thanh Tùng | MSSV: 10243221