CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, nhân giống, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật… Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng và vi lượng … và có các điều kiện lý hóa thích hợp Theo nguồn gốc - Tự nhiên - Tổng hợp - Bán tổng hợp * Theo trạng thái vật lý - Lỏng (Brothe) - Rắn - Bán lỏng (bán rắn)

CHƯƠNG 1

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

CHƯƠNG 1

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC

ĐỊNH

VI SINH VẬT

I 1 HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG

PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

-Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, nhân giống, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật…

- Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng và vi lượng … và có các điều kiện lý hóa thích hợp

PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV

* Theo mục đích

- Môi trường tiền tăng sinh

- Môi trường tăng sinh

- Môi trường chọn lọc

- Môi trường phân biệt

- Môi trường thử nghiệm sinh hóa

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

• Môi trường tự pha chế

– Chẩn bị nguyên liệu: Cân, đong thành phần – Pha chế: Hòa tan, bổ sung agar (môi trường rắn)

– Lọc

– Điều chỉnh pH

– Phân phối vào dụng cụ

– Hấp khử trùng (121 0 C/30p)

• Môi trường đông khô:

Được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm

nghiệm vi sinh

– Cân lượng môi trường

– Bổ sung nước (theo tỷ lệ), hòa tan

– Phân phối vào dụng cụ chứa

Note: Thông thường môi trường được pha chế có giá trị pH thích hợp, không cần phải hiệu chỉnh pH sau khi được pha chế

Vi khuẩn gram dương trên môi trường chọn lọc

CAN (Colistan Nalidixic Acid Agar )

S epidermidis và S aureus trên môi trường chọn lọc –

phân biệt Mannitol Salt Agar (MSA)

Môi trường kiểm tra khả năng sinh Indol

Môi trường kiểm tra khả năng lên men

Dextrose (Glucose)

I.2 KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN

CHUYỂN MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU

THỰC PHẨM

Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m, M

Ví dụ: Tiêu chuẩn về tổng số vsv trong sp trứng được thanh trùng Pasteur: n=5, c=2, m= 5.104, M= 106 CFU/25g

- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong

n mẫu thử nằm trong khoảng >m và M: Chấp

nhận lô hàng

- Nếu >c mẫu trong n mẫu thử nằm trong khoảng >m và M Hoặc có một mẫu >M: Từ chối

lô hàng

- Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu

- Kế hoạch 2 thuộc tính: Đối tượng vsv quan tâm không được phép có trong thực phẩm;

- Kế hoạch 3 thuộc tính: Nếu cho thực phẩm một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể tích

- Tránh sự tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai

(chứa mẫu trong các bình bằng nhựa có nắp

vô trùng)

- Ghi chú mẫu: thời gian, nhiệt độ, nơi lấy

mẫu, phương tiện vận chuyển, …

KẾ HOẠCH THU MẪU THỰC PHẨM

Nơi lấy

mẫu Thời điểm lấy mẫu

Số lượng mẫu cần lấy 1

Chỉ tiêu VSV kiểm tra

Qui mô nhỏ

Qui

mô vừa

Qui

mô lớn

CSGM

trâu bò

Sau khi khám thịt, trước khi đưa thân thịt đi tiêu thụ/sơ chế hoặc trước khi làm lạnh, mẫu được thu thập trong vòng 30 phút

1 - 3

4 - 6

7 - 12

- VKHK TS

- Enterobacteriacea e

1 - 3

4 - 6

7 - 12

- VKHK TS

- Enterobacteriacea e

- Salmonella CSGM

1- 3 4 - 6 7 - 12

- VKHK TS

- Enterobacteriacea e

- Salmonella

Phương pháp lấy mẫu thịt

Nơi lấy

mẫu Thời điểm lấy mẫu

Số lượng mẫu cần lấy 1

Chỉ tiêu VSV kiểm tra

Qui mô nhỏ

Qui

mô vừa

Qui

mô lớn

CSGM

gia cầm 2

Sau khi đưa thân thịt đi làm lạnh ít nhất 1,5 giờ (cả trong kho làm lạnh chúng hoặc sau khi treo thân thịt lại trên dây) hoặc trước khi đưa đi tiêu

thụ/sơ chế.

1 - 3

4 -

6 7 - 12

- VKHK TS

- Enterobacteriacea e

1 - 3

1 giữa Gộp lại là 1 mẫu.

Cho 1 kho lạnh lấy 5 đơn vị mẫu tại 5 vị trí.

- VKHK ưa lạnh

- Enterobacteriacea e

- Salmonella

Các sản phẩm lạnh đông:

- Lau cồn phía ngoài PE

- Đặt vào khay tráng men đã vô trùng

- Đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự

phút)

Mẫu đồ hộp:

- Kiểm tra hộp có bị phồng, biến dạng, hở

…

- Lau chùi bằng cồn bên ngoài

- Đưa vào phòng vô trùng để kiểm

Các sp bao bì, nylon, thủy tinh …

- Kiểm tra độ kín của bao bì

- Lau cồn phía ngoài

- Đưa vào phòng vô trùng để kiểm

Trong quá trình vận chuyển:

- Mẫu phải được bảo quản ở -200C cho đến khi phân tích (0-40C)

- Mẫu phải xét nghiệm trong vòng 36h (6h)

- Vi sinh vật có thể bị tổn thương nên trong

nhiều trường hợp cần giai đoạn tăng sinh

VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẨU

THỰC PHẨM

- Giải đông mẫu trước khi phân tích

Đk vô trùng (2-50C trong 18h, 450C trong 15 phút kết hợp lắc bình chứa mẫu để tăng tốc độ giải đông và đồng nhất nhiệt độ trong

Stomacher

SP đặc hoàn toàn:

10g(25g) mẫu → nghiền nát trong cối sứ

vô trùng → Erlen có chứa sẵn bi thủy tinh và 90ml (225ml) nước cất vô trùng hoặc nước

muối sinh lý → lắc đều, lắng cặn → hút phần

- Dung dịch pha loãng: Tốt hơn nên dùng nước pepton 0,1%; nước muối sinh lý (0,85%), trong buffer nếu cần.

I 3 THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật

- Định danh vi sinh vật : dựa vào

TRUYỀN THỐNG

•Xác định khả năng sử dụng một nguồn

carbon nhất định bởi vsv để tăng trưởng

theo con đường lên men

giảm pH môi trường → thay đổi màu môi

Thử nghiệm khả năng lên men

Thử nghiệm khả năng oxy hóa – lên men

(TN Hugh –Leifson)

•Xác định vi sinh vật dị dưỡng cần cung cấp

nguồn carbon dưới dạng chất hữu cơ, thường là carbonhydrate Vsv sử dụng CBH này làm nguồn năng lượng theo con đường lên men hay hô hấp

• Quá trình lên men thường tạo môi trường có

tính acid cao hơn quá trình hô hấp

• Môi trường Hugh- Leifson có chỉ thị pH là

bromothymol blue (pH = 6.0: vàng; pH= 7,6:

xanh dương)

•Thử nghiệm Hugh – Leifson

- 2 ống nghiệm chứa mt hugh-Leifson; 1 ống

được phủ paraffin lỏng vô trùng trên bề mặt môi trường

- Cấy đâm sâu vsv, ủ 24-48h trong cùng đk

•Sau p/ư:

- Lên men: cả 2 ống bị oxh đều từ trên bề mặt

và phần sâu của mt

- Hô hấp: ống kị khí bị oxh đều từ trên bề mặt

xuống phần sâu của mt; ống hiếu khí chỉ bị acid hóa ở phần đáy

Thử nghiệm

Hugh-Leifson

• Phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculin thành

esculentin và glucose

• Esculentin p/ư với muối sắt tạo phức hợp màu nâu hay đen

• MT: Aesculin Medium hay Edwards

• Sau p/ứ: hóa nâu hay đen (+); ko đổi màu (-)

Thử nghiệm Bile Esculin

Th nghi m Bile Escusinử ệ

-Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

• Citrate được sử dụng làm nguồn carbon duy nhất của vsv

• Sp biến dưỡng citrate thay đổi tuỳ vào pH môi trường

pH kiềm: acetate và formate

pH acid: acetoin và lactate

•Mt Simmons citrate chứa chất chỉ thị màu

Bromothymol blue ở pH trung tính có màu xanh lục, pH kiềm có màu xanh dương (pH>7,6)

• Sau p/ư: mt có màu xanh lục (-); xanh dương (+)

+

Môi trường manolate broth có chứa

bromothymol bue

Sau p/ư: Xanh lục (-); xanh dương (+)

Thử nghiệm khả năng biến dưỡng

malonate

Thử nghiệm catalase

• Phân biệt vi sinh vật hiếu khí và vi sinh vật

kị khí

• VSV hiếu khí có enzyme catalase có khả

Staphylococcus

Streptococcus

Th nghi m catalase ử ệ

-+

• Có 3 loại enzyme: ODC, LDC và ADC (ADH)

• Môi trường Decarboxylase basal medium chứa chỉ thị bromocrezol purple và 1 loại a.a (ornithin, lysin, arginin)

• Sau p/ư: Vàng (-), tím (+)

Th nghi m decarboxylase ử ệ

+

-Thử nghiệm coagulase

•Định danh Staphylococcus, loài này có khả năng tiết enzyme coagulase làm kết tụ các thành phần huyết tương tạo khối đông huyết tương

•Thử nghiệm được thực hiện với huyết tương thỏ hay người dạng đông khô

• Tiến hành trên phiến kính/ống nghiệm

•Sau p/ư (khoảng 4 phút)

Xuất hiện đám ngưng kết: +

Ko có p/ư ngưng kết:

-Th nghi m Coagulase ử ệ

-Thử nghiệm urease

•Xác định khả năng tạo enzyme urease của 1 số

vsv, đặc biệt là nhóm Proteus

•Enzyme này xúc tác p/ư phân giải ure thành

•Môi trường lỏng Rustigian Stuart’s Urea broth hay mt đặc Christensen Urea chứa chỉ thị đỏ

phenol

• Sau p/ư: không đổi màu (màu vàng cam): -; đỏ tím:+

Th nghi m urease ử ệ

- ++++ ++

Thử nghiệm genlatinase

• Đánh giá khả năng tiết enzyme genlatinase

phân giải genlatine thành polypeptide và a.a

• Môi trường nuôi cấy vsv được bổ sung

gelnatine hoặc nuôi cấy vsv trên mt gelatine có

bổ sung 5-10ml trichloacetic acid TCA là kết tủa gelatine

Thử nghiệm gelatinase

-Thử nghiệm khả năng sinh H 2 S

•Xác định khả năng phân giải các a.a chứa lưu

enzyme desulfuahydrase

Fe III, amonium sulfate sắt …) chứa trong môi

trườn

• Môi trường thử nghiệm: KIA, TSI, SIM, PIA, BSA

• Sau nuôi cấy: Xuất hiện màu đen (+), ko xuất

hiện màu (-)

(-)

Thử nghiệm khả năng sinh H 2 S

Thử nghiệm khả năng sinh indol

•Xác định khả năng chuyển hóa các sp trung gian của quá trình oxy hóa thành indol

• Indol được xác định nhờ p/ứ với thuốc p-

dimethylaminobanzaldehide tạo phức quinon co màu đỏ

• MT thử nghiệm: nước trypton, MIU, SIM; thuốc thử là Kovacs và Erlich

• Sau p/ư: xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt mt (+), màu vàng (-)

marcescen (-), Proteus rettgeri (+)

Th nghi m kh năng sinh idol ử ệ ả

Th nghi m kh năng sinh idol ử ệ ả

Thử nghiệm KIA, TSI

•Môi trường KIA, TSI sử dụng đồng thời để thử

nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác

•KIA chứa 1%lactose, 0,1% glucose, chất chỉ thị Phenol red; TSI có thêm 1% succrose

Th nghi m KIA, TSI ử ệ

Thử nghiệm nitrase (khử nitrate)

• Đánh giá khả năng sử dụng enzyme nitratase

để khử nitrate thành nitrite và các sp khác

• Nitrit tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản

ứng với sulphanilamide và N-napthylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu

hồng

• Mt nitrate broth, sodium nitrate

• Sau p/ư: khi thêm thuốc thử vào và acid hóa môi trường

Màu hồng: +Không xuất hiện màu hồng: -

Thử nghiệm nitratase

Thử nghiệm oxidase

•Nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme

oxidase ở vsv

• Hoạt tính oxidase được phát hiện nhờ thuốc

thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện diện của enzyme, thuốc thử bị oxy hóa → indolphenol có màu xanh dương

• Môi trường thử nghiệm: nutrient aga; lấy 1 ít sinh khối đặt trên 1 tấm giấy lọc có tẩm thuốc thử p-phenylenediamin

• Sau thử nghiệm: Xanh dương (+); không đổi màu (-)

Thử nghiệm oxidase

rettgeri (-)

• Sau p/ư: màu vàng (+); ko đổi màu (-)

Thử nghiệm ONPG

-Thử nghiệm MR (Methyl Red)

• Phân biệt vsv dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sp có tính acid từ sự lên men glucose VSV lên men glucose tạo và duy trì các sp có tính acid làm đổi màu thuốc thử Nếu sp acid tiếp tục → các sp trung tính: không đổi màu thuốc thử

• Chất chỉ thị màu pH mt là methyl red

• Sau thử nghiệm: mt chuyển màu đỏ (+), mt không đổi màu (-)

marcescens (-)

Thử nghiệm MR (Methyl Red)

_ + + +

Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)

Thử nghiệm VP (Vosges- Proskauer)

• Phân biệt các loài vk trong họ đường ruột

Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxh acetoin được tạo ra từ 2,3 butadiol thành diacetyl

• Diacetyl được xác định dựa vào p/ư kết hợp với guanidine của pepton tạo phức màu đỏ

• MTTN: MR-VP

•Thuốc thử: Barritt, Koblentz chứa α-naphton và KOH

• Sau p/ư: màu đỏ (+), ko thay đổi màu (-)

Phân biệt các nhóm Streptococcus

- P/ư CAMP thực hiện giữa nhân tố CAMP của

Streptococcus nhóm B tiết ra và β-hemolysin do Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của

β-hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết)

• Thử nghiệm đồng thời chủng staphylococcus

aureus và chủng thử nghiệm, 2 đường cấy

vuông góc cách nhau 2mm

Cyclic adenosine monophosphate (cAMP, cyclic AMP or 3'-5'-cyclic adenosine monophosphate )

Thử nghiệm cAMP

Thử nghiệm CAMP

+ -

- Mttn: Tryptose Blood Agar Base

• Sau p/ư: có vùng tan huyết (+), không có vùng tan huyết (-)

Thử nghiệm tính di động

KHÔNG TRUYỀN THỐNG

1.Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh

2 Phương pháp Elisa (Enzyme-linked

ImmunoSorbent Assay)

3 Phương pháp lai phân tử (Hybridization)

4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain

Reaction)

5 Một số phương pháp thử nhanh khác

- Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ

- Kỹ thuật màng petri (petrifilm)

1.Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh

- Phân tử ATP có mặt trong tất cả các tế bào sống, sự phát hiện ATP → nhận biết các chất

sống tồn tại

- ATP được phát hiện nhờ lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với 1 enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng

- Nhược điểm: đắt tiền, hóa chất ổn định sự phát

sáng, cồng kềnh (đã có sự cải tiến để mang đi

được)

Cơ chế phản ứng

Luciferase + Luciferin + ATP  Luciferase-Luciferin AMP + PPi

Luciferase-Luciferin AMP + O2  Oxyluciferin + AMP + CO2 +

hv

(phát quang)

Dụng cụ quẹt bề

mặt

Máy đo sáng

Dụng cụ quẹt bề mặt Clean - Trace

2 Phương pháp Elisa (Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay)

PP elisa

- Nguyên tắc: Sử dụng kháng thể đơn dòng

phủ lên ngoài những đĩa giếng Nếu có kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng Nếu bổ sung kháng thể thứ cấp có gắn enzyme như horseradish peroxidase…

3 Lai phân tử (Hybridization)

Nguyên tắc: dựa vào sự biến tính tách

mạch của phân tử DNA tại nhiệt độ nóng chảy Tm thành 2 mạch đơn (pp đo độ

- Đặc điểm của lai phân tử

Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy

ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung

Các trình tự bổ sung có thể là DNA, RNA dẫn đến hình thành các phân tử lai DNA- DNA, DNA-RNA, RNA-RNA

Ứng dụng lai phân tử để phát hiện vi sinh

vật trong thực phẩm?

- Định lượng vi sinh vật và độc tố

- Sử dụng mẫu dò (probes), trên thị

trường đã có các bộ kit (clostridium

botulinum – Gene-trak; Escherichia coli – Gene-trak; staphylococcus aureus –

AccuProbe; …)

Southern blot method

Southern blot method

Dot & slot bot method

Dot & slot bot method

4 PHƯƠNG PHÁP PCR

(Polymerase chain reaction)

- Phương pháp PCR dùng để tổng hợp DNA dựa trên khuôn DNA ban đầu, khuyếch đại, nhân

số lượng bản sao của khuôn này thành hàng

triệu bản sao nhờ enzyme polymerase và một cặp mồi (prime) đặc hiệu cho đoạn DNA này

- Hiện nay pp PCR được sử dụng để phát hiện, tạo đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện mầm bệnh có trong thực phẩm …

- Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

• Biến tính: Mạch DNA tách thành mạch đơn (94-950C, 30s)

• Lai: Các mồi bắt cặp với mạch khuôn

Sau phản ứng PCR, DNA được nhuộm bởi ethidium bromide, quan sát qua điện di sản phẩm PCR

trong gel agarose và quan sat dưới tia UV

Bản điện di

Máy điện di đứng

Máy điện

di ngang

Máy luân nhiệt (Máy PCR

realtime)

- DNA polymerase: cần thiết để tổng hợp DNA

- DNA mạch khuộn: trình tự DNA mục tiêu đặc trưng cho vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc

tố của vi sinh vật này

- Mồi: là những đoạn DNA ngắn có khả

năng bắt cặp bổ sung với một đầu của

mạch khuôn

- Các loại nucleotid A, T, X, G; nước, dung dịch đệm, ion Mg2+

Các thành phần của phản ứng PCR

LOCAD-PTS reader [left] and swabbing unit [right]

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

Điện di đứng

Điện di ngang

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)