tổng quan về các vi sinh vật chỉ thị và các biện pháp kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm

Khái niệm vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị là những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điềukiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, cũng như khảnăng

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặc vấn đề:

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề được quan tâm ngàycàng sâu sắc trên phậm vi mỗi quốc gia và quốc tế, bởi vì sự liên quan trực tiếpcủa nó ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng con người, sự duy trì nòi giống,cũng như quá trình phân phối kinh tế quốc tế

Gần đây ở trong nước và trên thế giơí càng hối thúc các nhà hoachj định thếgiới mạnh tay hơn nữa trong quá trình an toàn vệ sinh thực phẩm Để đảm bảocho người tiêu dùng an toàn về vấn đề thực phẩm, thì đầu tiên người tiêu dùngcần đảm bảo vệ sinh cá nhân cho chính bản thân mình

Để góp phần cho việc bảo đảm thực phẩm sạch tốt, việc kiểm soát vi sinhvật trong thực phẩm cũng là điều cần thiết và cấp bách Việc kiểm tra vi sinh vậtgây bệnh trong thực phẩm góp phần giúp cho người tiêu dùng an tâm với các sảnphẩm mình chon lựa hơn Để tìm hiểu vi sinh vật chỉ thị cho thực phẩm và biệnpháp kiểm soát vi sinh vật, tôi xin trình bày những nghiên cứu mà mình đã họchỏi và tìm hiểu

1.2 Mục đích khóa luận:

Đánh giá mức độ nhiễm tạp của vi sinh vật trong thực phẩm, biện phápkiểm soát mức độ an toàn của vi sinh vật chỉ thị trong thực phẩm

1.3 Nội dung khóa luận:

- Tổng quan các ci sinh vật chỉ thị trong thực phẩm

- Phương pháp kiểm tra các vi sinh vật trong thực phẩm và biện pháp kiểm

soát

Chương II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị

2.1.1 Khái niệm vi sinh vật chỉ thị

Vi sinh vật chỉ thị là những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điềukiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, cũng như khảnăng chống chịu một hàm lượng nhất định các yếu tố độc hại trong môi trườngsống và do đó sự hiện diện của chúng biểu thị một tình trạng về kiều kiện sinhthái của môi trường sống nằm trong giới hạn nhu cầu và khả năng chống chịu củađối tượng sinh vật đó

2.1.2 Các tiêu chí lựa chọn một vi sinh vật chỉ thị

- Chúng có mặt ở hiện tại và dễ phát hiện trong tất cả thực phẩm có chấtlượng (hoặc không có chất lượng) để được đánh giá

- Sự tăng trưởng và số lượng của chúng cần phải có xu hướng tiêu cựctương quan với chất lượng

- Chúng cần phải dễ dàng phát hiện, liệt kê và có sự khác biệt rõ ràng vớicác vi sinh vật khác

- Chúng cần được liệt kê trong một thời gian ngắn, thời gian lý tưởng làtrong vòng một ngày

- Sự tăng trưởng của chúng không bị gây ảnh hưởng bất lợi do các thànhphần khác của thực phẩm

Bảng 2.1: Mối quan hệ giữa vi sinh vật gây hư hỏng và thực phẩm.

Leuconostoc mesenteroides Mía đường (Trong quá trình lọc)

Zygosaccharomyces bailii Mayonnaise, salad đóng gói

Nhóm vi sinh vật là nguyên nhân của sự hư hỏng, số lượng của nó đượcnhận biết bằng cách chọn lọc nuôi cấy Các tổng thể của vi sinh vật đánh giá chấtlượng của các sản phẩm, trong bảng 2.1 nêu lên sự tăng trưởng và số lượng củacác vi sinh vật trong thực phẩm

2.1.3 Chỉ thị về an toàn thực phẩm

Vi sinh vật chỉ thị nhằm đánh giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm và các hệthống chất lượng Để đáp ứng các chỉ tiêu quan trọng nó cần các yếu tố sau:

- Dễ dàng nhận biết và nhanh chóng phát hiện

- Dễ phân biệt với các nhóm vsv khác trong thực phẩm

- Sự hiện diện của vi sinh vật là tác nhân gây nên mầm bệnh trong thựcphẩm

- Tỷ lệ nhu cầu tăng trưởng và phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm đó

- Loại trừ mầm bệnh có mặt trong thực phẩm

Hình 2.1: Mối quan giữa vi sinh vật chỉ thị và mầm bệnh.

Các tiêu chí này áp dụng cho hầu hết các vi sinh vật trong thực phẩm cótác nhân gây bệnh bất kể có nguồn gốc thực phẩm nào Tuy nhiên tác nhân gâybệnh được quan tâm có nguồn gốc từ đường ruột, để phát hiện sự ô nhiễm phâncủa nguồn nước và sự hiện diện của tác nhân gây bệnh đường ruột

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng

- Tốc độ hấp thu và bài tiết: Đây là đặc tính quan trọng trong quá trình đánhgiá ô nhiễm Đối với những chất có thể bài tiết nhanh chỉ có thể phát hiệnđược ở nồng độ cao trong cơ thể sinh vật ngay sau khi chất đó được thải ramôi trường

- Đặc điểm sinh lý: Bao gồm quá trình trao đổi chất, lượng mỡ dự trữ, khảnăng bắt mồi, khả năng sinh sản… Những sinh vật có quá trình trao đổi chấtmạnh hơn (cá) thì có khả năng tích tụ nhanh hơn ngay cả trong điều kiệnnguồn thức ăn bị hạn chế

- Tuổi và kích thước: Đây là yếu tố ảnh hưởng lớn đến kết quả đánh giá đặcbiệt đối với cá Chúng có mối quan hệ chặc chẽ với các chất tích tụ trong cơ

Chỉ thị Mầm bệnh

Số lượng

Thời gian

- Aûnh hưởng của các chất:

+ Những enzyme khử độc ảnh hưởng đến sự hấp thụ và bài tiết của cácchất

+ Sự thay đổi mật độ hấp thụ của các chất

+ Sự thay đổi đặc tính bên trong của sinh vật sẽ ảnh hưởng đến khả nănghấp thụ và bài tiết

+ Sự bài tiết của các chất tạo nên những hợp chất phứt tạp hơn

- Sự biến đổi của môi trường: Sự thay đổi nhiệt độ, độ cứng, độ mặn, độđục…

+ Nhiệt độ: Không ảnh hưởng đến độ tan của rất nhiều chất mà còn ảnhhưởng đến khả năng tích tụ của sinh vật

+ Nước cứng: Làm giảm tính độc của một số kim loại nặng trong môitrường

+ Độ mặn và độ đục: Là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ hấpthụ của các sinh vật, đặc biệt ở những vùng cửa sông

- Dinh dưỡng: Một trong số các nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến nồng độkim loại nặng tích tụ trong cơ thể sinh vật nhất là những sinh vật hấp thụ quathức ăn

2.1.5 Ý nghĩa của các vi sinh vật chỉ thị

Vi sinh vật chỉ thi vệ sinh thực phẩm có ý nghĩa rất lớn trong việc đánh giá antoàn về vi sinh và chất lượng thực phẩm

a Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình

Tổng lượng vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết lượng vi sinhvật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình mà nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm bịnhiễm Khi đó người quản lý và sản xuất thực phẩm phải kiểm tra lại điềukiện vệ sinh trong sản xuất, điều kiện bảo quản và phân phối

Thực phẩm bị phân hủy trong 1 gam chứa khoảng 106 đến 108 tế bào visinh vậthiếu khí.

b Vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình

Tổng lượng vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết khả năng thực

phẩm nhiễm Clotridium.

c Vi sinh vật ưa lạnh

Tổng lượng vi sinh vật ưa lạnh cho biết trước khoảng thời gian cần thiết đểbảo quản lạnh nhằm đảm bảo sự an toàn thực phẩm

2.1.6 Các vi sinh vật chỉ thị điển hình

2.1.6.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí

b Định nghĩa

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạctrong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2) Tổng số vi khuẩn hiếu khíhiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

c Nguyên tắc

- Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điềukiện hiếu khí ở 30oC/72h ± 6h hoặc 37oC/48h ± 6h

Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môitrường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạclà sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dướidạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vịkhối lượng thực phẩm.

2.1.4.2 Coliform tổng số

a Giới thiệu

Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: Số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trìnhchế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫumôi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnhkhác

b Nguồn gốc

Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm

thấy trong phân của con người (Geldreich 1978)

Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xuyên xét nghiệm vikhuẩn trong nước ở London Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phươngtiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchinson và Ridgway 1977)

Đầu thập niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của coliformnhư là một dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và saukhi sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham (Durham năm 1893) thì kháiniệm về vi khuẩn Coliform và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nướcAnh năm 1901

Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩncoliform.

Năm 1909 MacConkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn coliform.Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coli được đem

ra sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges –Proskauer nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978)

Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệmIMVIC (Indole, Methyl đỏ, voges – Proskauer và muối của acid Citric) Việc thửnghiệm cho thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coliform phân, các dạng vikhuẩn trong đất và trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay

c.Đặc điểm

Vi khuẩn coliform là những trực khuẩn gram âm, không hình thành bào tử,

có phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β - galactosidase Vi khuẩnnày có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tínhbề mặt khác có tính ức chế tương tự, có thể lên men lactose (với β-galactosidase)cho việc sản xuất acid và sinh hơi khi ủ ở 35 – 37oC trong vòng 24 - 48 giờ ở 36 ±

2oC

Coliforms gồm 4 chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy, 1991) Chúng thường có mặt trong đường ruột của động vật có vú (ví dụ: Escherichia coli phổ biến

trong đất, trên cơ thể người,…)

Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter freundii có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường (nước giàu

chất dinh dưỡng, đất và thực vật) cũng như trong nước uống có nồng độ có cácchất dinh dưỡng tương đối cao.

Hình 2.2

Hình 2.2: Vi khuẩn lên men lactose

Coliform chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 45oC, nó bao

gồm Escherichia và loài Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter.

Hình 2.3 Coliform chịu nhiệt lên men đường lactose

d Hiện diện

Vi khuẩn coliform hiện diện ở khắp nơi, kể cả trong đất, da, nước sông, nước

ao, rau cải,…

Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinhkhiết của nước hay rau Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy.Vì vikhuẩn coliform vẫn có khả năng sống sót trong nước ấm, Sự hiện diện củacoliform trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân

Coliform chịu nhiệt xuất hiện từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ nhưnước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất

Citrobacter freundii Escherichia cloacae

Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và

37.0002.300

160.0004.800

16%

80%

Sự có mặt của coliform trong môi trường chứng tỏ môi trường đó nhiễm bẫncó nguồn gốc từ phân

Bảng 2.3 Chỉ tiêu của coliform trong thực phẩm

TCVN5289/92 Cá fillet, tôm, mực

200/g

TCVN4381/92 Tôm vỏ đông lạnh

TCVN4380/92 Tôm thịt đông lạnh

TCVN4546/94 Tôm mũ ni đông lạnh

Thực phẩm Giới hạn cho phép CFU/g hay CFU/

ml thực phẩm

Sản phẩm từ thịt: pate, xúc xích,… 50

Sản phẩm chế biến: tôm, cá, mực,… 10

Thủy sản khô sơ chế: Cá khô 102

Sản phẩm từ ngũ cốc, xử lý nhiệt

trước khi dùng(bột, miến, mì), dùng

trực tiếp (bánh bột)

103

10

Nước giải khát không cồn 10

2.1.4.3 Escherichia Coli:

a Giới thiệu:

- Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) là một trong những vi

khuẩn sống ký sinh trong đường ruột của động vật

- Vi khuẩn E coli cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần

của khuẩn lạc Sự có mặt của vi khuẩn trong nước là một chỉ thị thường gặp cho ônhiễm phân

- Vi khuẩn này được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân, bởi vì nóthường tạo khuẩn lạc trên thành ruột và nó không gây nguy hiểm cho sức khỏe

b Nguồn gốc:

- Năm 1885 Escherichia coli được Buchner tìm ra và đến năm 1886 tại Munchen, một bác sĩ nhi khoa tên Theodor Escherich nghiên cứu đầy đủ E.coli

thường sống trong ruột già, trong tiếng LaTinh ruột già là colum Vì tôn trọng nhàkhoa học nên người ta lấy tên ông ghép vào chữ ruột già theo ngữ pháp sở hữu

cách tiếng La Tinh nên vi khuẩn này coa tên Escherichia coli.

- Vi khuẩn do Escherich phát hiện trong tả lót của trẻ em được công bố với

tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune 4 năm sau vi khuẩn này được giới

chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá

- Năm 1895 người ta lại gọi bằng tên Bacillus coli.

- Năm 1896 gọi thành Bacterium coli.

- Năm 1991 vi khuẩn được thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.

c Phân loại khoa học:

d Đặc điểm hình thái và phân bố:

- Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, được đặc trưng bởi tính chất

Hình 2.4: Escherichia coli

thước (1.1 – 1.5) x (2 - 6)μm, có độ dài 3 μm di chuyển bằng lông và roi, vi khuẩngram âm và yếm khí tùy tiện Không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp là 35 –

37oC, pH thích hợp 6.4 – 7.5 (tối ưu nhất là 7.2 – 7.4), sinh sản trong khoảng 5 –

12oC, sinh sản mạnh ở 5oC Nó phát triển ở nhiệt độ 44 – 45oC trên môi trườngtổng hợp, lên men đường lactose và mannital có sinh hơi và sinh acid, sinh endoltừ triptophan

- Escherichia coli là một trong số thành viên của nhóm vi khuẩn Coliform

được sử dụng để chỉ ra nguồn phân Chúng được xếp vào loại có tính khángnguyên, chủ yếu là kháng nguyên loại O và H Tuy nhiên, chúng không sinhoxidase hoặc thủy phân ure và một số không sinh hơi, có thể phát triển ở 37oC

- Chúng phân bố ở khắp nơi trong môi trường đặc biệt trong thực phẩm, nướcvà ruột già

e Đặc điểm sinh hóa và nuôi cấy:

- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ E.coli làm đục nhẹ môi trường, càng

để lâu càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có nổi váng mỏng trên môi trường

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạcdạng S có màu xám trắng, tròn, ướt, bề nặt bóng, kích thướt khoảng 2 – 3mm

+ Trên môi trường thạch EMB: E.coli cho khuẩn lạc tím ánh kim.

+ Trên môi trường thạch MacConkey: E.coli cho khuẩn lạc đỏ hồng + Trên môi trường thạch nghiêng TSI: E.coli tạo acid/acid (vàng/vàng) Để phân biệt E.coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử nghiệm IMViC E.coli cho kết quả IMViC là ++ - - hoặc - + - -

f Yếu tố kháng nguyên:

E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phứt tạp, hệ thống phân nhóm này dựavào việc xác định kháng nguyên bề mặt O,H,K.

 Kháng nguyên thân O: Có bản chất là lipopolysaccharide của màng ngoàitế bào, bền với nhiệt và cồn Kháng nguyên O có thể phát hiện bằng phản ứngngưng kết và giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩnvà có tính chất chuyên biệt cho từng loại vật chủ

 Kháng nguyên lông H: Có bản chất là Protein, tạo nên khả năng di độngcủa E.coli, kém chịu nhiệt Có khoảng 56 type kháng nguyên

 Kháng nguyên giáp mô K: Sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn,nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị nung nóng Dựa vàokhả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type A,L,B và người taphân loại kháng nguyên này dựa vào tính chất hóa học

Một vài E.coli tiết độc tố ruột có những lông bám, những lông bám này bảnchất là protein nên việc sắp xếp chúng vào kháng nguyên K là không phù hợp vàsau đó chúng được xếp và kháng nguyên tiêm mao F

 Kháng nguyên tiêm mao F: Tham gia vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiềuhơn flagella, dạng thẳng, xoắn, dài khoảng 4μm, đường kính 2,1 – 7,0nm Tiêmmao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mạc nên rất quan trọng trong khảnăng gây bệnh của vi khuẩn

Ví dụ: E.coli có mã số O157:H7 là vi khuẩn thường gặp nhất Chúng lànguyên nhân gây bệnh tiêu chảy có máu và gây tổn thương thận ở người Người

bị nhiễm trùng vi khuẩn STEC thường có triệu chứng đau thắt bao tử, tiêu chảythường có máu và ói mửa

 Việc sử dụng E.coli là một vi sinh vật chỉ thị được giới hạn bởi các yếu

tố:

+ E.coli không phải là một loài vi sinh vật chỉ thị duy nhất.

+ Nó là một trong số các chi của nhóm Coliform như Proteus và Aerobacter thường được tìm thấy bên ngoài đường ruột của con người.

+ Các vi sinh vật khác tìm thấy trong nước nhưng không đại diện cho

phân ô nhiễm mà chúng có một số đặc điểm giống E.coli

g Tính chất gây bệnh

Khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng lớn kèm theo độc tố của chúng

E.coli gây tiêu chảy gồm các nhóm sau:

- Nhóm EPEC (Entreropathaogenic E.coli): Gây tiêu chảy cho các em dưới 2

tuổi

- Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): Gây bệnh cho tẻ em, người lớn tiết

ra độc tố ruột ST và LT(Gây tiêu chảy trầm trọng và kéo dài)

- Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): Gây viêm loét niêm mạc gây tiêu

chảy có máu

- Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa tiêu chảy và là

nguyên nhân gây viêm đại tràng xuất huyết, làm tổn thương niêm mạc gây sưng,

h Nguyên nhân

Hình 2.5: E.coli O157:H7

- Vệ sinh không sạch sẽ của người chế biến, chủ yếu là từ thực phẩm Đâylà một nguyên nhân quan trọng gây nên bệnh viêm ruột, và các triệu chứng tiêuchảy.

- Do ô nhiễm từ phân người vào thực phẩm, sử dụng các sản phẩm khôngqua chế biến kỹ, không được thanh trùng, khử trùng,…

- Vi khuẩn E.coli với số lượng 106 – 1010 tế bào sẽ gây bệnh

i Biện pháp phòng ngừa

- Nấu nướng kỹ thực phẩm, bảo quản đảm bảo đủ nhiệt độ lạnh sẽ ngănchặn được sự lây nhiễm, đặc biệt là thao tác của người chế biến

- Tránh để thực phẩm lâu trong tủ lạnh và cần nấu kỹ lại trước khi ăn, đểtránh được sự lây nhiễm giữa thực phẩm tươi sống và thực phẩm chín

2.1.4.4 Faecal Streptococcus

a Giới thiệu

- Sự xuất hiện của Faecal Streptococcus cho thấy việc ô nhiễm xảy ra trong nước rất gần, và một số loài Streptococcus faecal có liên kết với các động vật

máu nóng khác

Ví dụ: S.bovis chủ yếu xảy ra ở gia súc và cừu; S.equinus có trong ngựa và S.avium có ở gia cầm và các loài chim.

Việc so sánh số lượng E.coli và Streptococcus faecal trong nước có thể được

dùng để xác định ô nhiễm precisesource

- Trong phòng thí nghiệm chúng được định nghĩa là tất cả các vi sinh vật sảnxuất màu đỏ hoặc màu hồng trong vòng 48 giờ ở 35 ± 1.0oC (Phương pháp

hành thường xuyên, và chúng rất dễ chết khi có sự thay đổi nhiệt độ.

- Một số loài có phân bố rộng hơn hiện diện trong đường ruột người và động

vật như: S.faecalis và S faecium hoặc có 2 biotype (S faecalis var liquefaciens và loại S faecalis có khả năng thủy phân tinh bột).

- Trong thực tế, S.faecalis tồn tại trong môi trường nước tốt hơn E.coli.

2.1.4.5 Enterococcus:

a Giới thiệu:

Hình 2.6: Streptococcus

- Enterococcus là vi khuẩn aicd lactic của Firmicutes phylum Cầu khuẩn

gram dương thường xảy ra trong cặp hoặc chuỗi ngắn và rất khó để phân biệt với

Streptococcus về đặc tính.

- Năm 1984 khi phân tích di truyền DNA người ta đã tìm ra được sự khác

biệt của chi Enterococcus được phân loại như Streptococcus.

- Nó là vi sinh vật kỵ khí tùy nghi, không cần oxi cho quá trình chuyển hóanhưng nó có thể sống trong môi trường giàu oxi Chúng không có khả năng hìnhthành bào tử, chịu được nhiệt độ 10 – 45oC, pH = 4.5 – 10.0, và nồng độ NaCl

- Enterococci được xem là vi khuẩn chỉ thị chất lượng nước, đặc biệt là chỉ

thị cho chất lượng nước biển (Theo tiêu chuẩn phương pháp nawm; EPA, 1986)

- Chiếm ưu thế trong đường ruột như E faecalis enterococci, E.faecium, E.durans và E.hirae… Ngoài ra cũng có một số loài được tìm thấy trong đường ruột như S.bovis và S equinus.

d Tăng trưởng

- Enterococci gram dương có nhiều khó tính trong nhu cầu dinh dưỡng hơn

gram âm Gram dương yêu cầu cung cấp yếu tố tăng trưởng nhiều hơn đặc biệt làvitaminB và acid amin nhất định

- Chúng phát triển ở phạm vi rộng Mặc dù là vi sinh vật ưa khí nhưng chúngkhông sản xuất catalase (trừ pseudonolase bởi một số chủng trưởng thành trongsự hiện diện của oxi), và được phát triển tốt ở điều kiện của quá trình oxy hóathấp

e Triệu chứng

- Gây nhiễm trùng đường tiết niệu và nhiễm trùng vết thương, các bệnhnhiễm trùng khác ảnh hưởng đến van tim, viêm nội tâm mạc và bộ não

f Biện pháp phòng bệnh

- Nấu nướng kỹ thực phẩm, bảo quản đảm bảo đủ nhiệt độ lạnh sẽ ngăn

chặn được sự lây nhiễm, đặc biệt là thao tác của người chế biến

- Tránh để thực phẩm lâu trong tủ lạnh và cần nấu kỹ lại trước khi ăn, đểtránh được sự lây nhiễm giữa thực phẩm tươi sống và thực phẩm chín

2.1.4.6 Bifidobacterium

Được nghiên cứu trên phân của trẻ sơ sinh khoảng năm 1900 do Tisser đặt

tên nó là Bacillus bifidus; sau này nó được đặc tên là Lactobacilius bifidus và hiện tại Bifidobacterium bifidum Bifidobacteria được dùng để chỉ thị sự ô nhiễm phân.

a Đặc điểm hình thái và yêu cầu tăng trưởng

- Những vi khuẩn gram dương, kỵ khí có nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu và tối

đa phạm vi là 25 – 28oC và 43o – 45oC, tương ứng

- Chúng phát triển tốt trong khoảng pH 5 – 8 và sản xuất acid lactic vàacetic là chính sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa carbohydrate củachúng

Chúng được tìm thấy trong phân người ở cấp bậc cao hơn mỗi gam (108

-109) hơn E.coil (106 - 107), và điều này đã làm cho chúng trở nên các chỉ số ô

nhiễm phân con người

- Phương pháp phân biệt giữa giống trong phân người và phân động vật được

đưa ra bởi Gavinietal và chia Bifidobacteria với những nguồn gốc từ người thuộc

nhóm I, III, VII

Hình 2.8: Bifidobacterium

- Gần đây chúng được đề xuất như chỉ thị ô nhiễm phân trong nước ngọt

nhiệt đới khi chúng chết giảm nhanh hơn coliform hoặc Enterococci Bifidobacteria thường gặp trong ngũ cốc rau quả, động vật.

2.1.4.7 Staphylococcus aureus:

a Giới thiệu:

- S.aureus do Robert Koch (1843 - 1910) phát hiện

năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và Louis Pasteur

(1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của

lịch sử ngành vi sinh vật học

- Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotlsnd Alexander Ogston đã trìnhbày tại hội nghị lần thứ 9 Hội Phẩu Thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó

ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày tương đối đầy

đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng Đến năm

1884 được Rosenbach nghiên cứu tỉ mĩ, nó thuộc họ Microccaeae.

- Sự hiện diện của Staphylococcus aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện

vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến

b Phân loại khoa học:

- Giới: Eubacteria

Hình 2.9: Bifidobacterium

Hình 2.10: Staphylococcus aureus

c Phân bố và hình dạng tế bào:

- Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong sản phẩm động vậtnhư thịt, sữa,… Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi

- Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh, được xếp vàonhóm vi khuẩn cơ hội, vì sự có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợiđiều kiện thuận lợi để xâm nhập

- Vi khuẩn Staphylococcus aureus hình cầu, đường kính 0.8 – 1.5μm, gram

dương, có khả năng sinh nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm Các tế bào thườngliên kết thành các chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả năng sinhcoagulase

- S.aureus hiếu khí hay kỵ khí ý có khả năng lên men và sinh axit từ manitol,

trehalose, saccarose Có khả năng tăng trưởng trên môi trường có đến 15% NaCl.Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu Đường kínhvòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính củakhuẩn lạc

Hình 2.11: Staphylococcus

- Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ởnhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất làkhi tăng trưởng ở 35 – 370C.

d Đặc điểm sinh hóa và điều kiện sinh trưởng:

- S.aureus còn được gọi là tụ cầu khuẩn gây bệnh, do đó cần xác định để

biết mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích có mang mối nguy hiểm cho người tiêudùng hay không

- Staphylococcus aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng

và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trênmôi trường phân lập

- Phát triển tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặchuyết thanh Nhiệt độ tối thích 37oC, pH tối ưu = 7.2

- Lên men đường glucose, lactose, maltose, sacharose, glycerol, manitol.Không lên men salicin,raffinose, inulin

- Có khả năng chịu măn cao, chúng làm đông tụ sữa Sinh beta hemolysistrong môi trường thạch máu

- Phản ứng indol - , NH3 - , thủy phân gelantine, đông huyết tương

- Trên môi trường thạch khuẩn lạc có dạng hình tròn trơn bóng, đục mờ

- Trên môi trường lỏng, tế bào ở dạng cặn, vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm

ở bề mặt môi trường

e Các yếu tố độc lực:

- Hyaluronidase: Men này có khả năng phá hủy chất cơ bản trong cơ thể vàgiúp vi khuẩn phát tán trong tổ chức.

- Hemolysine và Leukocidine: Phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết cáctế bào hạt cũng như đại thực bào

- exfoliatine: Là men phá hủy lớp thượng bì, men này gây tổn thương da tạobọng nước Ví dụ: hội chứng Lyell do tụ cầu

- Sáu độc tố ruột: (Enteroxine A,B,C,D,E,F) bền với nhiệt Các độc tố ruột

đóng vai trò trong ngộ độc thực phẩm

- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc: Là nguyên nhân gây nên hội chứngsốc nhiễm độc, một hội chứng sốt trầm trọng

- Hầu hết các chủng tụ cầu khuẩn đều sản xuất được men penicillinase (beta

- lactamase) Men này phá hủy vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của cáckháng sinh như penicillineG, Ampicilline và Uredopenicilline làm cho kháng sinhnày mất tác dụng

f Khả năng gây bệnh:

f.1 Gây ngộ độc thực phẩm:

- Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm đósẽ bị ngộ độc Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống trong thực phẩmmà chỉ cần có độc tố của chúng, và ít có khả năng truyền nhiễm

- Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột Type A và D gây ngộ độc thực phẩmcho người

f.2 triệu chứng:

- Sau 30’ – 6h đau thắt bụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức,đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.

- Là độc tố bền nhiệt Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từnhà bếp, quá trình chế biến

f.3 Điều trị:

- Sử dụng thuốc kháng sinh: Tùy vào từng trường hợp người ta sử dụng thuốckháng sinh khác nhau cho bệnh nhân, tuy nhiên người ta cần làm kháng sinh đồcho từng bệnh nhân và dùng gamma- globuline chống tụ cầu

- Quá trình thích ứng và thời gian điều trị

f.4 Phòng ngừa:

- Thực hiện tốt vệ sinh cá nhân và sinh hoạt hằng ngày, ăn uống hợp vệsinh, nấu kỹ trước khi dùng Không lấy sữa từ động vật viêm vú, trử lạnh thựcphẩm < 8oC, ngăn ngừa khả năng sinh độc tố

- Tăng cường uống vitamin, năng cao sức khỏe, rửa tay bằng nước nóng vàxà phòng, hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển…

2.1.4.8 Clostridium:

a Giới thiệu:

- Vi khuẩn Clostridium được Emile van Ermengem phân lập vào năm 1895.

- Năm 1896, Emile Van Ermengem tìm ra mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn

Clostridium botulinum).Kê ûtừ năm 1953 tất cả các loài neurotoxins botulinum sinh (loại A - G) đã được cho rằng C.botulinum, nhưng sau đó kiểu hình và kiểu gen

đáng kể tồn tại để chứng minh tính không đồng nhất trong các loài Điều này đã

dẫn đến việc phân loại lại của C.botulinum loại G giống như một loài.

- Năm 2003 bộ gen của C.botulinum được công bố (công trình của viện

Sanger với tiến sĩ Roger Huston và tiến sĩ M.Peck)

b Phân loại khoa học:

- Clotridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần

lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng

lượng Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt

và một số loài thuộc nhóm ưa lạnh Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng

là C.botulinum và C.perfringens.

- C.botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng đưựoc trong môi

trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác Các dòng trongloài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và có 6 kiểu kháng nguyên được ký

Hình 2.12: Clostridium

một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willin và Hobbs, còncác kiểu C,D và E không có khả năng này Kiểu A thường thấy trên các mẫu thịttrong khi kiểu E chỉ được phân lập trên các mẫu cá.

- C.perfringens làloài kỵ khí không bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trong các

môi trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử trên môi trườngnuôi cấy Ellner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline.Loài này có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F Kiểu kháng nguyên Athường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm

- Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường

có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 370C trong 1 -2 ngày.Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 500C Trên môi trường này các khuẩn lạc

Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) cótrong môi trường

d Cấu trúc tế bào và phân tử của C.botulinum:

d.1 Cấu trúc tế bào: Kích thước 0.3 – 0.7μm x 3.5 – 7.0μm, có hình que, không

có roi, là vi khuẩn gram dương, sinh bào tử Tuy nhiên bào tử thường to hơn chiềungang của tế bào

d.2 Cấu trúc phân tử:

Toxin được tổng hợp từ một chuỗi polypeptid có

trọng lượng phân tử gần 150.000 dalton Ở cấu

trúc này, phân tử độc tố có hoạt lực tương đối

thấp, nhưng khi bị một số enzyme của vi khuẩn

và trypsin tách ra thành hai chuỗi nặng (100.000

dalton) và nhẹ (50.000 dalton) nối với nhau bằng cầu nối sulfur có gắn với mộtphân tử Zn.

e Cơ chế gây bệnh:

e.1 Yếu tố độc lực:

Các loại độc

tố

-Độc tố gen Nhiễm sắc

thể

Nhiễm sắcthể

Bacteriophage Plasmid

Close

relatives

C.Sporogens C.putrificum

C.butyricum C.beijerinickii

C.haemolyticu m

C.novyi type A

C.subterminale C.haemolyticu m

Bảng 2.5: Các độc tố gây hại cho người và động vật

e.2 Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum:

- Clostridium botulinum sẽ tiết ra một độc tố sinh học mạnh ức chế sự

phóng thích hoạt động của các bó cơ, tác động đến nơi tiếp hợp cholinergic qua trung gian Calcium vào khe sinap làm mất khả năng chi phối hóa học tại chổ và mất hoạt động thần kinh của sợi nơron vận động trong thoi cơ Hoạt chất này tác động tại nơi tiếp hợp thần kinh cơ nên ngăn cản sự phóng thích Acetylcholine và gây ra liệt

- Độc tố của Clostridium botulinum tác dụng qua 3 giai đoạn: Kết nối,

truyền thần kinh Độc tố này không ảnh hưởng vào sự tổng hợp hay dự trữ

Acetylcholine nhưng ảnh hưởng vào sự phóng thích chất này ở sợi tận cùng tiền tiếp hợp

Hình2.14: Cơ chế gây bệnh của độc tố Toxin

f Thực phẩm truyềnnhiễm:

- Phát hiện trong đồ hộp (thịt, cá, pate, xúc xich, rau quả,…)lạp xưởng, cáướp muối hoặc phơi khô… thức ăn chế biến sẵn, mật ong

- Thực phẩm nhiễm Clotridium botulinum rất khó nhận biết bằng cảm quan.

Chỉ nhân biết được sau khi sử dụng qua những dấu hiệu lâm sàng

g Triệu chứng và biện pháp điều trị phòng ngừa:

- Thời gian ủ bệnh 6 – 24h, biểu hiện sau 12 – 36h, bệnh kéo dài 4 – 8 ngày,tỷ lệ tử vong tới 60% - 70% Nôn mửa, mệt mỏi, nhức đầu, mắt mờ không nhìn rõ,đau họng, khô mũi, khó nuốt, sụp mí mắt

- Không dùng đồ hộp mà nắp bị phồng hoặc chảy nước

- Cẩn thận với món rau cải, tỏi ngâm dầu, không dùng thực phẩm hư, nổibọt, thúi, bót mùi lạ lúc nấu

- Giữ vệ sinh sạch sẽ, rữa tay bằng xà phòng và giữ thực phẩm ở nhiệt độthích hợp

2.1.4.9 Bacillus cereus:

a Giới thiệu:

- B.cereus được phát hiện lần đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm

vào năm 1955 Nó là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình oval, có khả năngsinh nha bào Là trực khuẩn gram dương

c Đặc điểm và phân bố:

- Trực khuẩn gram dương, tạo nội bào tử, kích thước (0.5 – 1.5) x (2 – 4)μm,không tạo giáp mô, không có khả năng di động Nhiệt độ thích hợp 35 – 40oC, pH

= 4.5 – 9.3

Hình 2.15: Bacillus cereus

- Trên môi trường TSA sau 24h tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì, Đối với môitrường MYP ()Mannitol Egg Yolk Polymixin: khóm hồng xung quanh có màuhồng sáng, trên môi trường Mosel (thạch cereus selective agar): Khóm to hồngxung quanh có vòng sáng.

- Phân bố nhiều trong tự nhiên, chúng nhiễm vào các loại thức ăn qua đêmhay trữ lạnh lâu thường gây ngộ độc thực phẩm

d Tính chất sinh hóa:

- Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí, khônglên men mantose, khử nitrat thành nitrit, có khả năng phân giải Tyroxin,Catalase(+), Citrate(+)

e Cơ chế gây bênh:

e.1 Độc tố:

- Độc tố gây tiêu chảy (Diarrhoed toxin): Vi khuẩn sản sinh độc tố trong thịt,rau quả, gia vị Là một loại protein gây hủy hoại biểu bì mạc ruột, gây tiêu chảy

- Độc tố gây nôn mửa emetic toxin: có mặt trong gạo, cơm nguội, đậu cácloại Bản chất là phospholipit có tính ổn định và không bị phân hủy ở nhiệt độ caovà dịch dạ dày

Hình 2.16: Cấu trúc sinh hóa của Bacillus cereus

- Ngoài ra chúng còn gây chết người bởi enzyme hemolyzin, gây nhiễmtrùng, viêm màng não,…

e.2 Cơ chế:

Bào tử của B.cereus bám vào các tế bào Caco – 2 (trên các tế bào biểu mô

của người) Sau khi bám vào các bào tử nảy mầm một cách nhanh chóng trong

vòng 1h, hình thành tế bào B.cereus dinh dưỡng trên đỉnh của các biểu mô, tiếp

đó sẽ sản sinh ra độc tố Độc tố xuất hiện trong đường ruột sẽ tập trung ở vùngngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen gây ra bệnh một cách trầmtrọng

f Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa:

- Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn 105/g thực phẩm sẽ gây độc Dẫn đến đaubụng, buồn nôn sau 1 – 5h bệnh kéo dài 24h

- Phòng: Không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn được hâm nóngtrên 80oC trước khi ăn

2.1.4.10 Streptococcus faecalis:

a Giới thiệu:

- Trước năm 1984, enterococci là thành viên của

Streptococcus như vậy E.faecalis được gọi là

Streptococcus faecalis.

- Streptoccus là liên cầu khuẩn, có dạng hình cầu hoặc hình ovan kéo dài.

Là vi khuẩn gram dương, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạovỏ nhày

Hình 2.17: Streptococcus

- Là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện nhưng phát triển tốt trong điều kiện kị khí.Khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đậm, khi nuôi cấy trong môi trường azidetetrazolium chứa TTC Có phản ứng catalase và oxidase âm tính, chúng chịu đượcnồng độ muối 6.4%, pH= 4.5 – 10, nhiệt độ 10 – 45oC.

b Đặc điểm và phân bố:

- Là chỉ tiêu để xác định mức độ ô nhiễm phân của thực phẩm

- Thuộc nhóm liên cầu khuẩn phân, đường kính < 2μm Nhiệt độ thích hợp

cho sinh trưởng và phát triển là 30 – 35oC Enterococcus faecalis có thể sống sót

trên các bề mặt môi trường

- Không chịu được nhiệt độ thanh trùng, pH<6.3, chất kháng sinh và chất sáttrùng Không tạo độc tố, lên men glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường.Chúng thủy phân esculine khi có mặt của 40% các muối mật tạo 6,7-hydroxycoumarin (chất này kết hợp với Fe3+ tạo hợp chất màu nâu đen) Nócũng có thể sản xuất một phản ứng pseudocatalase nếu trồng trên thạch máu

- Là cầu khuẩn gram dương nó có khả năng tăng sinh mạnh mẽ được sửdụng làm acid lactic điều trị rối loạn đường ruột, là thành phần chính của một sốProbiotic Tuy nhiên, nó phát triển mạnh trên vết thương và vết bỏng

c Cấu trúc tế bào:

Có bốn phân tử DNA và ba plasmid tròn được xác định:

Plasmid – 1 chứa 66.320bp

Plasmid – 2 chứa 17.963bp

Plasmid – 3 chứa 57.660bp

- Các plasmid mã hóa một sộ gen bao gồm: transposases, protein kháng đa

thuốc và sự phát triển của một chất ức chế ppGpp E.faecalis nhiễm sắc thể là

d Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa:

- Viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm cácvan tim Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng

- Triệu chứng: Đau họng, sốt, mẩn đỏ da, tiêu chảy và nôn mửa Xuất hiệnsau 12 – 14h kéo dài 2 – 3 ngày

- Nấu chín kỹ và làm lạnh sâu, vệ sinh sạch sẽ, vệ sinh cá nhân sạch sẽ

CHƯƠNG III CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG

THỰC PHẨM 3.1 Các phương pháp truyền thống phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật:

3.1.1 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp:

a Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu trên kính hiển vi:

Số lượng vi sinh vật được xác định bằng buồng đếm trên kính hiển vi.Thường áp dụng để xác định mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn nhưnấm men, nấm mốc, tảo và protozoa

 Ưu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật

cứa trong mẫu

 Nhược điểm:

- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

- Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu

- Khó đạt được độ chính xác cao

- Không thích hợp với huyên phù vi sinh vật có mật độ thấp

Đơn vị tính: tế bào/ml tế bào/g

CFU/ml CFU/g

MPN/ml MPN/g

Hình 3.1 : Cách đếm tế bào trong buồng đếm hồng cầu

 Cách tiến hành:

- Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm cókhoảng 5 – 10 tế bào vsv Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãngchứa 0.1% pepton và 0.1% laurylsulphat và 0.01% methyl blue, tất cả các dungdịch pha loãng đều phải lọc trước khi sử dụng.

- Đặt một giọt mẫu đã được pha loãng vào buồng đếm, dùng nắp kính đậylại và lau thật sạch vật kính và buồng đếm Thể tích mẫu chứa trong buồng đếmlà khoảng không gian giữa đĩa đếm và vật kính, sau đó để ổn định trong 5 phút.Đếm ngẫu nhiên 50 – 100 ô nhỏ Tính trung bình số lượng vi khuẩn trong các ônhân với 20.000 và dộ pha loãng mẫu trước đó ta được số lượng tế bào trong 1ml

b Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang:

Các chất nhuộm phát huỳnh quang:

- Acridin cam (AODC)

- 4’,6-dianodino-2-phenyl-indol (DAPI)

- Fluorescein isothiocyanate (FTTC)

 Ưu điểm:

- Loại bỏ sai số do các chất vẩn

- Kết quả phản ánh đúng với sinh khối

- Không sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để pha loãng mẫu thựcphẩm

- Các dung dịch pha loãng mẫu:

+ Saline peptone water (SPW)

NaCl:1g

Peptone: 8.5g

Nước cất vừa đủ:1 lít

+ Buffered peptone water (BPW)

NaCl: 5g

Peptone: 10g

Nước cất vừa đủ: 1 lít

Hình 3.2: Pha loãng mẫu

Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng: 10g + 90ml dung dịch pha loãng = độ phaloãng 101 , làm tương tự cho các bước tiếp theo

Sau đó cấy vào môi trường

Hình 3.3: Cấy vào môi trường

3.1.2 Định lượng Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

3.1.2.1 Nguyên tắc

Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạchchọn lọc thích hợp chứa lactose Sau khi ủ 370C + 10C trong 24 – 48 giờ, đếm sốlượng khuẩn lạc Coliforms điển hình Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng.Môi trường chọn lọc Coliforms là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbonduy nhất, đồng thời môi trường còn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và

các tác nhận chỉ thị như neutral red, crystal violet Khẳng định các dòng khuẩn lạcđặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL.

Để tránh các trường hợp không phát hiện được Coliforms do bị tổn thương haysuy yếu do trong quá trình chế biến, bảo quản hay tiếp xúc với môi trường chọnlọc làm chúng không phát triển thành khuẩn lạc, chúng ta phải phục hồi khả nănghoạt động của Coliforms bằng một môi trường chứa nguồn carbon khác như môitrường tryptone soya agar

Số lượng Coliforms được xác định bằng số lượng khuẩn lạc điển hình đếmđược, hệ số khẳng định và nồng độ pha loãng trước khi cấy mẫu vào đĩa

3.1.2.2 Môi trường và hóa chất

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

- Violet Red Bile Agar (VRB)

- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

b Cấy mẫu và đổ môi trường

Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ítnhất vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗiđĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc.

Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làmnguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petrixuôi và ngược chiều kim đồng hồ Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ đểphục hồi khả năng của Coliforms Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB Chờ môitrường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 + 10C trong 24 – 48 giờ

c Đọc kết quả

Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính Khuẩn lạcColiforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính >0,5mm, xung quanh khuẩn lạccó vùng tủa muối mật

Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB

d Khẳng định

Trong trường hợp mẫu có chưa các nguồn carbon khác không phải lactose, đểtránh các trường VSV sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và tạokhuẩn lạc tương tự như Coliforms, giai đoạn khẳng định là cần thiết Quy trìnhkhẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm đượcvới các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ ở 370C

trong 24 – 48 giờ Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ốngDurnham Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với sốkhẩn lạc khẳng định

Hình 3.5: Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL

e Cách tính kết quả

Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ củaColiforms theo công thức:

N

n1vf1 + … + nivfi

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãngv: thể tích cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm