e. Cách tính kết quả
3.2.3. Phương thức lai phân tử:
Hiện nay nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố. Tuy nhiên, chỉ cĩ phương pháp lai phân tử (hay cịn gọi là phương pháp mẫu dị, probes) và phương pháp PCR là được thương mại hĩa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dị để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dị là phương pháp lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời 2 mạch đơi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nĩng chảy(Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ mơi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố nồng độ DNA, trong mơi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của mơi trường.
Ví dụ: Ở hệ thống dị gen – trak, hệ thống này xử dụng que thử với mẫu dồ để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu mơi trường. Mẫu dị là những
đoạn oligomer AND đánh dấu bằng hĩa chất phát quang. Quy trình phân tích chia làm 6 bước:
- Bước 1: Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA.
- Bước 2: Mẫu dị phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate ở đầu 5’ và 3’ của phân tử được đặt vào phản ứng.
- Bước 3: Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dị.
- Bước 4: Que thử được đặt trong ống đo chứa mẫu dị phát hiện được đánh dấu bằng enzyme.
- Bước 5: Sau khi rử loại phần enzyme thừa, qur thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu.
- Bước 6: Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sĩng 450nm.