e. Cách tính kết quả
3.2.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh:
Adenosin triphotphat (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP cĩ thể được phát hiện một cách nhanh chĩng bởi lượng ánh sáng phát ra thơng qua sự kết hợp với enzume luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này cĩ thể phát hiện được 1pg(10-15g) tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10- 15gATP/tế bào). Độ nhạy này cĩ được khi sử dụng các hĩa chất thương mại đắt
tiền, sự phân tích thường chỉ diễn ra vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc.
Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này địi hỏi nhiều sự cải tiến trong việc thiết kế máy đo lượng ánh sáng phát ra ( giảm giá thánh và cĩ thể mang đi được ) và những hĩa chất ổn định sự phát sang. Phương pháp này ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra những chất lỏng như nước rửa là sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm. Để đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm bằng ATP thì ATP của vi sinh vật cần phải được tách chiết ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng giữa cường độ ánh sáng phát ra.
Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đĩm trải qua hai giai đoạn: E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1)
E – LH2 AMP + O2↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2) Phản ứng cĩ thể được viết lại như sau:
E + LH2 + ATP + O2↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν + PPi
(E: Luciferase; LH2: Luciferin)
Phản ứng phát sáng của đom đĩm là cĩ hiệu quả nhất, được biết đến như phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP. Phản ứng này địi hỏi D-Luciferin và ion Mg2+ để hoạt động, đây là thành phần cơ bản trong bộ kit thương mại. Chất dioxetanone thì được hình thành bởi sự tạo phức hợp của luciferase với oxy và phức hợp Mg – ATP. Sau đĩ, ánh sáng vàng – xanh ( bước sĩng cao nhất là 562nm) được phát ra. Để kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị trong sản xuất, chế biến thực phẩm, tổng vi khuẩn hiếu khí trong thành phẩm,
người ta xác định tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của eukaryote và của tế bào vi sinh vật. Thơng thường ATP khơng cĩ nguồn gốc là của tế bào vi sinh vật sẽ được tách chiết bởi những chất tẩy khơng ion ví dụ như Triton X-100. ATP nỳa sau khi tách chiết khỏi tế bào sẽ được thủy phân bằng cách xử lý với enzyme ATPase trong vịng 5 phút. Tiếp theo, ATP của tế bào vi sinh vật sẽ được ly trích bằng chất tricloaxetic 5%. Aùnh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng đo được cường độ ánh sáng thấp.
Ngày nay sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đáng giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm, mĩ phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, nhanh chĩng chỉ trong vài phút và cĩ thể dễ dàng tự động hĩa.
Nguyên tắc chung của quy trình phát quang sinh học này như sau: Mẫu đưựoc thu bằng cách dùng que bơng vơ trùng một diện tích nhỏ nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị, sau đĩ que bơng được cho vào dung dịch trích ly ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng.
Gần đây, nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hĩa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu, sau đĩ dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát ra.
Để biết mật độ vi sinh vât, so sánh trị số ánh sáng đo được với 1 đường chuẩn tuơng quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã biết trước.