e. Cách tính kết quả
3.2.4.Phương pháp PCR:
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuơn là một trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis mà cộng sự phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đốn bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật cĩ trong thực phẩm,……
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mơi chuyên nghiệp để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuơn. Mạch khuơn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho lồi vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của đoạn mạch khuơn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên dặc tính này của DNA polymerase. Khi cĩ sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo
hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức cĩ thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và cĩ thể thu nhận được đoạn DNA nàycho các mục đích thao tác trên gen. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải cĩ những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Bước 1: biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm
của phân tử, thường là 94 -950C trong 30 – 60 giây. Mạch đơi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
- Bước 2: bước lai: nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuơn, nhiệt độ này khoảng 40 – 700C , trong khoảng 30 – 60 giây.
- Bước 3: tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bước như trên sẽ lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại la,f tăng gấp đơi lượng mẫu của lần trước, đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo tính tốn sau 30 đến 40 chu kỳ sự khuếch đại sẽ tạo ra 106
bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA đưựoc nhuộm bởi ethidium bromide và cĩ thể quan sát thấy thơng qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sĩng 320nm).
Quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR như sau:
- Bước 1: tăng sinh trên mơi trường khơng hoặc ít chọn lọc trong thời gian từ 10 -20 giờ.
- Bước 2: thu dịch nuơi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích bằng 1/10 thể tích nuơi cấy ban đầu, xử lý nhiệt ở 1000C trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất khơng tan ức chế phản ứng PCR. - Bước 3: thực hiện phản ứng PCR
- Bước 4: điện di trên gen agarose 1,5% xem kết quả trên đèn UV Ngồi ra cịn cĩ một số phương pháp thử nhan khác như: - Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ
- Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp - Kỹ thuật màng petri
- Kỹ thuật Redigel
- Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng - Kỹ thuật đo vi lượng calorie - Kỹ thuật đo mức phĩng xạ