Các chất nhuộm phát huỳnh quang: - Acridin cam (AODC)
- 4’,6-dianodino-2-phenyl-indol (DAPI) - Fluorescein isothiocyanate (FTTC)
Ưu điểm:
- Kết quả phản ánh đúng với sinh khối
- Khơng sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để pha lỗng mẫu thực phẩm.
- Các dung dịch pha lỗng mẫu: + Saline peptone water (SPW) NaCl:1g
Peptone: 8.5g
Nước cất vừa đủ:1 lít
+ Buffered peptone water (BPW) NaCl: 5g
Peptone: 10g
Nước cất vừa đủ: 1 lít
Hình 3.2: Pha lỗng mẫu
Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng: 10g + 90ml dung dịch pha lỗng = độ pha lỗng 101 , làm tương tự cho các bước tiếp theo.
Sau đĩ cấy vào mơi trường
Hình 3.3: Cấy vào mơi trường
3.1.2. Định lượng Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc3.1.2.1. Nguyên tắc 3.1.2.1. Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên mơi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Sau khi ủ 370C + 10C trong 24 – 48 giờ, đếm số
lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Mơi trường chọn lọc Coliforms là mơi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời mơi trường cịn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các tác nhận chỉ thị như neutral red, crystal violet. Khẳng định các dịng khuẩn lạc đặc trưng bằng mơi trường canh chọn lọc như canh BGBL.
Để tránh các trường hợp khơng phát hiện được Coliforms do bị tổn thương hay suy yếu do trong quá trình chế biến, bảo quản hay tiếp xúc với mơi trường chọn lọc làm chúng khơng phát triển thành khuẩn lạc, chúng ta phải phục hồi khả năng hoạt động của Coliforms bằng một mơi trường chứa nguồn carbon khác như mơi trường tryptone soya agar.
Số lượng Coliforms được xác định bằng số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, hệ số khẳng định và nồng độ pha lỗng trước khi cấy mẫu vào đĩa.
3.1.2.2. Mơi trường và hĩa chất
- Mơi trường Tryptone Soya Agar (TSA)
- Violet Red Bile Agar (VRB)
- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
- EC broth
3.1.2.3. Quy trình phân tícha. Chuẩn bị mẫu a. Chuẩn bị mẫu
Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nhưng quá trình pha lỗng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha lỗng mẫu chứa khoảng <100 khuẩn lạc
b. Cấy mẫu và đổ mơi trường
Cấy chuyển 1ml dịch pha lỗng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha lỗng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc.
Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml mơi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với mơi trường bằng cách xoay trịn đĩa petri xuơi và ngược chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phịng trong 1 – 2 giờ để phục hồi khả năng của Coliforms. Đổ thêm 10 – 15ml mơi trường VRB. Chờ mơi trường đơng đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 + 10C trong 24 – 48 giờ.