tổng quan về các vi sinh vật chỉ thị và các biện pháp kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm

Khái niệm vi sinh vật chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị là những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điều kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, cũng như khả nă

KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGỆ SINH HỌC

-

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGHÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến KS Phạm Minh Nhựt và những người

đã trực tiếp chỉ dạy, góp ý để có thể hoàn thành Khóa luận này

Con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người thân đã tận tình giúp

đỡ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có điều kiện học tập, trang bị kiến thức hành trang vào đời cũng như góp một phần nhỏ bé của mình cho công cuộc xây dựng và phát triển đất nước

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè tôi, những người đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp này

Vì thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong quý Thầy Cô thông cảm và chỉ dạy, góp ý thêm để sau này

ra trường em có thể đảm nhiệm công việc chuyên môn tốt hơn

Một lần nữa Em xin chân thành cảm ơn !

TP Hồ Chí Minh tháng 07 năm 2010

LÊ NGỌC BÍCH VƯƠNG

MỤC LỤC TRANG BÌA

NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC BẢNG

DANH SÁCH CÁC HÌNH

CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU -

1.1 Đặt vấn đề -1

1.2 Mục đích -1

1.3 Nội dung nghiên cứu -1

CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN -

2.1 Giới thiệu vi sinh vật chỉ thị -2

2.1.1 Khái niệm vi sinh vật chỉ thị -2

2.1.2 Các tiêu chí lựa chọn một vi sinh vật chỉ thị -2

2.1.3 Chỉ thị an toàn thực phẩm -3

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng -4

2.1.5 Ý nghĩa của vi sinh vật chỉ thị -5

a Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình -5

b Vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình -6

c Vi sinh vật ưa lạnh -6

2.1.6 Các vi sinh vật chỉ thị điển hình -6

2.1.6.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí -6

a Giới thiệu -6

b Định nghĩa -6

c Nguyên tắc -6

2.1.4.2 Coliform tổng số -7

a Giới thiệu -7

b Nguồn gốc -7

c Đặc điểm -8

d Hiện diện -9

2.1.4.3 Escherichia Coli -11

a Giói thiệu -11

b Nguồn gốc -12

c Phân loại -12

d.Đặc điểm và phân bố -13

e Đặc điểm sinh hóa và nuôi cấy -13

f Yếu tố kháng nguyên -14

g Tính chất gây bệnh -15

h Nguyên nhân -16

i Biện pháp phòng ngừa -16

2.1.4.4 Faecal Streptococcus -16

a Giới thiệu -16

b.Phân loại -17

c.Đặc điểm -17

2.1.4.5 Enterococcus -18

a Giới thiệu -18

b Phân loại -18

c Đặc điểm -19

d Tăng trưởng -19

e Triệu chứng -19

f Biên pháp -19

2.1.4.6 Bifidobacterium -20

a.Đặc diểm hình thái và yaau cầu tăng trưởng -20

b Phân loại -20

c Phân bố -20

2.1.4.7 Staphylocococcus aureus -21

a Giới thiệu -21

b Phân loại khoa học -22

c Phân bố và hình dạng tế bào -22

d.Đặc điểm sinh hóa và điều kiện sinh trưởng -23

e Các yếu tố độc lực -24

f Khả năng gây bệnh -24

f.1 Gây ngộ độc thực phẩm -24

f.2 Triệu chứng -25

f.3 Điều trị -25

f.4 Phòng bệnh -25

2.1.4.8 Clostridium -26

a Giới thiệu -26

b Phân loại -26

c Đặc điểm -26

d Cấu trúc tế bào phân tử -27

d.1 cấu trúc tế bào -27

d.2 Cấu trúc phân tử -28

e Cơ chế gây bệnh -28

e.1 Yếu tố độc lực -28

e.2 Cơ chế gây bệnh -28

f Thực phẩm truyền nhiễm -29

g Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa -29

2.1.4.9 Bacillus cereus -30

a Giới thiệu -30

b Phân loại -30

c Đặc tính và phân bố -31

d Tính chất sinh hóa -31

e Có chế gây bệnh -31

e.1 Độc tố -31

e.2 Cơ chế -32

f Triệu chúng và biện pháp phòng ngừa -32

2.1.4.10 Streptocococcus faecalis -32

a Giới thiệu -32

b Đặc điểm và phân bố -33

c Cấu trúc tế bào -33

d Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa -34

CHƯƠNG III CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM -35 3.1 Các phương pháp truyền thống -35

3.1.1 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp -35

a Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu -35

b Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang -36

3.1.2 Định lượng coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc -38

3.1.2.1 Nguyên tắc -38

3.1.2.2 Môi trường và hóa chất -38

3.1.2.3 Quy trình phân tích -39

a Chuẩn bị mẫu -39

b Cấy mẫu và đổ môi trường -39

c Đọc kết quả -39

d Khẳng định -40

e Cách tính kết quả -40

3.1.3 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa -41

3.1.3.1 Nguyên tắc -41

3.1.3.2 Môi trường và thiết bị nuôi cấy -41

a Môi trường -41

b Thiết bị -42

3.1.3.3 Quy trình phân tích -42

a Chuẩn bị mẫu -42

b Đỗ đĩa -42

c Nuôi ủ -42

d Đọc kết quả -42

3.1.4 Phương pháp màng lọc sinh học -44

3.1.5 Phương pháp MPN (phương pháp tối khả) -44

3.1.5.1 Nguyên tắc -44

3.1.5.2 Sơ đồ quy trình kiểm nghiệm -45

3.2 Các phương pháp hiện đại -47

3.2.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh -47

3.2.2 Phương pháp ELISA (Enzyme – linked ImmunoSorbent Assay) 50

3.2.3 Phương thức lai phân tử -50

3.2.4 Phương pháp PCR -51

CHƯƠNG IV KIỂM SOÁT VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM 4.1 Kiểm soát vệ sinh nhà xưởng - 54

4.1.1 Mục đích - 54

4.1.2 Phương pháp vật lý và hóa học được sử dụng cho việc kiểm soát vi sinh vật bằng vệ sinh thiết bị chế biến thực - 55

4.1.2.1 Clo – Thuốc tẩy rửa - 55

4.1.2.2 Iodophore - 56

4.1.2.3 Hợp nhất Amoni - 56

4.1.2.4 H2O2 - 57

4.2 Kiểm soát bằng phương pháp vật lý - 57

4.2.1 Phương pháp ly tâm - 57

4.2.2 Phương pháp lọc - 57

4.2.3 Phương pháp cắt - 58

4.2.4 Phương pháp rửa - 59

4.3 Kiểm soát bằng phương pháp nhiệt (đốt nóng) - 59

4.3.1 Mục đích - 59

4.3.2 Các nhân tố ảnh hưởng - 60

4.3.3 Chế biến thực phẩm ở nhiệt độ thấp - 60

4.3.4 Chế biến thực phẩm ở nhiệt độ cao (tăng nhiệt) - 61

4.3.5 Chế biến thực phẩm bằng lò vi sóng - 61

4.4 Kiểm soát bằng phương pháp giảm độ ẩm - 61

4.4.1 Mục đích - 61

4.4.1.1 Giảm nước - 61

4.4.1.2 Đông khô - 62

4.4.1.3 Sấy khô - 62

4.4.1.4 Hun khói - 62

4.5 Kiểm soát vi sinh vật bằng phương pháp acid hữu cơ và pH thấp - 62

4.5.1 Mục đích - 62

4.5.1.1 Acid axetic - 63

4.5.1.2 Acid propionic - 63

4.5.1.3 Acid lactic - 63

4.5.1.4 Acid citric - 63

4.5.1.5 Acid Sorbic - 64

4.5.1.6 Acid benzoic - 64

4.6 Kiểm soát bằng chất bảo quản kháng sinh - 65

4.6.1 Mục đích - 65

4.6.1.1 Nitrite (NaNO2 và KNO2) - 65

4.6.1.2 Lưu huỳnh dioxide (SO2) và Sulfite (SO3) - 65

4.6.1.3 H2O2 - 66

4.6.1.4 Epoxit (Ethylene oxide, propylene oxide) - 66

4.6.1.5 Butylated hydroxyanisol (BHA), hydroxytolunene butylated (BHT) và t-butyl - 66

4.6.1.6 Chitosan - 67

4.6.1.7 Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) - 67

4.6.1.8 Lysozyme - 67

4.6.1.9 Monolaurin (Glycerol Monolaurate) - 68

4.6.1.10 Kháng sinh (tetracycline, natamycin và tylosin) - 68

4.6.1.11 Hun khói - 68

4.6.1.12 Gia vị - 69

4.7 Kiểm soát bằng cách chiếu xa - 69

4.7.1 Mục đích - 69

4.7.1.1 Liều chiếu xạ - 69

4.7.1.2 Một số loại chiếu xạ - 70

4.7.1.3 Bức xạ tia cực tím - 71

4.7.1.4 Bức xạ ion hóa - 71

CHƯƠNG V VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5.1 Thời gian và địa điểm thực hiện - 72

5.2 Vật liệu nghiên cứu - 72

5.3 Dụng cụ và hóa chất - 72

5.3.1 Dụng cụ và thiết bị - 72

5.3.1.1 Dụng cu - 72

5.3.1.2 Thiết bị - 73

5.3.2 Hóa chất - 73

5.4 Bố trí thí nghiệm - 74

5.4.1 Nội dung thực hiện - 74

5.4.2 Quy trình phân tích - 75

5.4.3 Thuyết minh quy trình - 76

5.4.4 Kết quả thí nghiệm - 77

5.4.4.1 Kết quả cảm quan - 77

5.4.4.2 Kết quả đánh giá mức độ ô nhiễm Coliform - 77

CHƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 79

6.1 Kết luận - 79

6.2 Kiến nghị - 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO -80

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Mối quan hệ giữa vi sinh vật gây hư hỏng và thực phẩm -3

Bảng 2.2 Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá mơ - 10

Bảng 2.3 Chỉ tiêu của coliform trong thực phẩm - 10

Bảng 2.4 Giới hạn cho phép coliform trong thực phẩm - 11

Bảng 2.5 Các độc tố gây hại cho người và động vật - 28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 2.1 Mối quan giữa vi sinh vật chỉ thị và mầm bệnh -4

Hình 2.2 Vi khuẩn lên men lactose -9

Hình 2.3 Coliform chịu nhiệt lên men đường lactose -9

Hình 2.4 Escherichia coli - 12

Hình 2.5 E.coli O157:H7 - 15

Hình 2.6 Streptococcus - 17

Hình 2.7 Enterococcus - 18

Hình 2.8 Bifidobacterium - 20

Hình 2.9 Bifidobacterium - 21

Hình 2.10 Staphylococcus aureus - 21

Hình 2.11 Staphylococcus - 22

Hình 2.12 Clostridium - 26

Hình 2.13 Cấu trúc phân tử - 28

Hình 2.14 Cơ chế gây bệnh của độc tố Toxin - 29

Hình 2.15 Bacillus cereus - 30

Hình 2.16 Cấu trúc sinh hóa của Bacillus cereus - 31

Hình 2.17 Streptococcus - 32

Hình 3.1 Cách đếm tế bào trong buồng đếm hồng cầu - 36

Hình 3.2 Pha loãng mẫu - 37

Hình 3.3 Cấy vào môi trường - 37

Hình 3.4 Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB - 39

Hình 3.5 Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL - 40

Hình 3.6 Tổng số vi sinh vật hiếu khí - 42

Hình 3.7 Màng lọc - 44

Hình 3.8 Các bộ phận của thiết bị lọc vi sinh vật - 44

Hình 3.9 Sơ đồ quy trình kiểm nghiệm - 45

Hình 5.1 Nội dung tiến hành - 74

Hình5.2 Khuẩn lạc đặc trưng của Coliform - 76

Hình5.3 Sinh hơi trong môi trường BGBL - 77

Hình 5.4 Kết quả thực nghiệm - 77

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

Để góp phần cho việc bảo đảm thực phẩm sạch tốt, việc kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm cũng là điều cần thiết và cấp bách Việc kiểm tra vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm góp phần giúp cho người tiêu dùng an tâm với các sản phẩm mình chon lựa hơn Để tìm hiểu vi sinh vật chỉ thị cho thực phẩm và biện pháp kiểm soát vi sinh vật, tôi xin trình bày những nghiên cứu mà mình đã học hỏi và tìm hiểu

1.2 Mục đích khóa luận:

Đánh giá mức độ nhiễm tạp của vi sinh vật trong thực phẩm, biện pháp kiểm soát mức độ an toàn của vi sinh vật chỉ thị trong thực phẩm

1.3 Nội dung khóa luận:

- Tổng quan các ci sinh vật chỉ thị trong thực phẩm

- Phương pháp kiểm tra các vi sinh vật trong thực phẩm và biện pháp kiểm soát

Chương II TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị

2.1.1 Khái niệm vi sinh vật chỉ thị

Vi sinh vật chỉ thị là những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điều kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, cũng như khả năng chống chịu một hàm lượng nhất định các yếu tố độc hại trong môi trường sống và do đó sự hiện diện của chúng biểu thị một tình trạng về kiều kiện sinh thái của môi trường sống nằm trong giới hạn nhu cầu và khả năng chống chịu của đối tượng sinh vật đó

2.1.2 Các tiêu chí lựa chọn một vi sinh vật chỉ thị

- Chúng có mặt ở hiện tại và dễ phát hiện trong tất cả thực phẩm có chất lượng (hoặc không có chất lượng) để được đánh giá

- Sự tăng trưởng và số lượng của chúng cần phải có xu hướng tiêu cực tương quan với chất lượng

- Chúng cần phải dễ dàng phát hiện, liệt kê và có sự khác biệt rõ ràng với các

Vi sinh vật Sản phẩm

Leuconostoc mesenteroides Mía đường (Trong quá trình lọc)

Pectinatus cerevisiiphilus Bia

Zygosaccharomyces bailii Mayonnaise, salad đóng gói

Nhóm vi sinh vật là nguyên nhân của sự hư hỏng, số lượng của nó được nhận biết bằng cách chọn lọc nuôi cấy Các tổng thể của vi sinh vật đánh giá chất lượng của các sản phẩm, trong bảng 2.1 nêu lên sự tăng trưởng và số lượng của các vi sinh vật trong thực phẩm

2.1.3 Chỉ thị về an toàn thực phẩm

Vi sinh vật chỉ thị nhằm đánh giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm và các hệ thống chất lượng Để đáp ứng các chỉ tiêu quan trọng nó cần các yếu tố sau:

- Dễ dàng nhận biết và nhanh chóng phát hiện

- Dễ phân biệt với các nhóm vsv khác trong thực phẩm

- Sự hiện diện của vi sinh vật là tác nhân gây nên mầm bệnh trong thực phẩm

- Tỷ lệ nhu cầu tăng trưởng và phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm đó

- Loại trừ mầm bệnh có mặt trong thực phẩm

Hình 2.1: Mối quan giữa vi sinh vật chỉ thị và mầm bệnh

Các tiêu chí này áp dụng cho hầu hết các vi sinh vật trong thực phẩm có tác nhân gây bệnh bất kể có nguồn gốc thực phẩm nào Tuy nhiên tác nhân gây bệnh được quan tâm có nguồn gốc từ đường ruột, để phát hiện sự ô nhiễm phân của nguồn nước và sự hiện diện của tác nhân gây bệnh đường ruột

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng

- Tốc độ hấp thu và bài tiết: Đây là đặc tính quan trọng trong quá trình đánh giá

ô nhiễm Đối với những chất có thể bài tiết nhanh chỉ có thể phát hiện được ở nồng độ cao trong cơ thể sinh vật ngay sau khi chất đó được thải ra môi trường

- Đặc điểm sinh lý: Bao gồm quá trình trao đổi chất, lượng mỡ dự trữ, khả năng bắt mồi, khả năng sinh sản… Những sinh vật có quá trình trao đổi chất mạnh hơn (cá) thì có khả năng tích tụ nhanh hơn ngay cả trong điều kiện nguồn thức

ăn bị hạn chế

- Tuổi và kích thước: Đây là yếu tố ảnh hưởng lớn đến kết quả đánh giá đặc biệt đối với cá Chúng có mối quan hệ chặc chẽ với các chất tích tụ trong cơ thể

- Anh hưởng của các chất:

+ Những enzyme khử độc ảnh hưởng đến sự hấp thụ và bài tiết của các chất

Chỉ thị Mầm bệnh

Số lượng

Thời gian

+ Sự thay đổi mật độ hấp thụ của các chất

+ Sự thay đổi đặc tính bên trong của sinh vật sẽ ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ và bài tiết

+ Sự bài tiết của các chất tạo nên những hợp chất phứt tạp hơn

- Sự biến đổi của môi trường: Sự thay đổi nhiệt độ, độ cứng, độ mặn, độ đục… + Nhiệt độ: Không ảnh hưởng đến độ tan của rất nhiều chất mà còn ảnh hưởng đến khả năng tích tụ của sinh vật

+ Nước cứng: Làm giảm tính độc của một số kim loại nặng trong môi trường + Độ mặn và độ đục: Là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến mức độ hấp thụ của các sinh vật, đặc biệt ở những vùng cửa sông

- Dinh dưỡng: Một trong số các nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến nồng độ kim loại nặng tích tụ trong cơ thể sinh vật nhất là những sinh vật hấp thụ qua thức

ăn

2.1.5 Ý nghĩa của các vi sinh vật chỉ thị

Vi sinh vật chỉ thi vệ sinh thực phẩm có ý nghĩa rất lớn trong việc đánh giá an toàn về vi sinh và chất lượng thực phẩm

a Vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình

Tổng lượng vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết lượng vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt độ trung bình mà nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm bị nhiễm Khi đó người quản lý và sản xuất thực phẩm phải kiểm tra lại điều kiện vệ sinh trong sản xuất, điều kiện bảo quản và phân phối

Thực phẩm bị phân hủy trong 1 gam chứa khoảng 106 đến 108 tế bào visinh vật hiếu khí

b Vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình

Tổng lượng vi sinh vật kị khí ưa nhiệt độ trung bình cho biết khả năng thực phẩm

nhiễm Clotridium

b Định nghĩa

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2) Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

2.1.4.2 Coliform tổng số

a Giới thiệu

Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: Số lượng hiện diện của chúng

biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

b Nguồn gốc

Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae

và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân

của con người (Geldreich 1978)

Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xuyên xét nghiệm vi khuẩn trong nước ở London Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương tiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchinson và Ridgway 1977)

Đầu thập niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của coliform như là một dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham (Durham năm 1893) thì khái niệm về

vi khuẩn Coliform và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm

1901

Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn coliform

Năm 1909 MacConkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn coliform

Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coli được đem ra sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978)

Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm IMVIC (Indole, Methyl đỏ, voges – Proskauer và muối của acid Citric) Việc thử nghiệm cho thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn coliform phân, các dạng vi khuẩn trong đất và trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay

c.Đặc điểm

Vi khuẩn coliform là những trực khuẩn gram âm, không hình thành bào tử, có

phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của - galactosidase Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có thể lên men lactose (với -galactosidase) cho việc sản xuất acid và sinh hơi khi ủ ở 35 – 37oC trong vòng 24 - 48 giờ ở 36 ± 2oC

Coliforms gồm 4 chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy, 1991) Chúng thường có mặt trong đường ruột của động vật có vú (ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất, trên cơ

gồm Escherichia và loài Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter

Citrobacter freundii Escherichia cloacae

Hình 2.3 Coliform chịu nhiệt lên men đường lactose

d Hiện diện

Vi khuẩn coliform hiện diện ở khắp nơi, kể cả trong đất, da, nước sông, nước

ao, rau cải,…

Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh khiết của nước hay rau Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy.Vì vi khuẩn coliform vẫn có khả năng sống sót trong nước ấm, Sự hiện diện của coliform trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân

Coliform chịu nhiệt xuất hiện từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất

Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá

37.000 2.300

160.000 4.800

Bảng 2.3 Chỉ tiêu của coliform trong thực phẩm

TCVN5289/92 Cá fillet, tôm, mực

Bảng 2.4 Giới hạn cho phép coliform trong thực phẩm

Thực phẩm Giới hạn cho phép CFU/g hay CFU/ml

Nước giải khát không cồn 10

2.1.4.3 Escherichia Coli:

a Giới thiệu:

- Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) là một trong những vi khuẩn

sống ký sinh trong đường ruột của động vật

- Vi khuẩn E coli cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần

của khuẩn lạc Sự có mặt của vi khuẩn trong nước là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân

- Vi khuẩn này được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân, bởi vì nó thường tạo khuẩn lạc trên thành ruột và nó không gây nguy hiểm cho sức khỏe

cách tiếng La Tinh nên vi khuẩn này coa tên Escherichia coli

- Vi khuẩn do Escherich phát hiện trong tả lót của trẻ em được công bố với tên

gọi đầu tiên là Bacterium coli commune 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên

môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá

- Năm 1895 người ta lại gọi bằng tên Bacillus coli

- Năm 1991 vi khuẩn được thống nhất toàn cầu

là Escherichia coli

c Phân loại khoa học:

d Đặc điểm hình thái và phân bố:

- Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, được đặc trưng bởi tính chất

enzyme –galctosidase và -Glucoronidase,là loài trực khuẩn hình que, kích thước (1.1 – 1.5) x (2 - 6)ìm, có độ dài 3 ìm di chuyển bằng lông và roi, vi khuẩn gram âm và yếm khí tùy tiện Không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp là 35 – 37oC, pH thích hợp 6.4 – 7.5 (tối ưu nhất là 7.2 – 7.4), sinh sản trong khoảng 5 – 12oC, sinh sản mạnh ở 5oC Nó phát triển ở nhiệt độ 44 – 45oC trên môi trường tổng hợp, lên men đường lactose và mannital có sinh hơi và sinh acid, sinh endol từ triptophan

- Escherichia coli là một trong số thành viên của nhóm vi khuẩn Coliform được

sử dụng để chỉ ra nguồn phân Chúng được xếp vào loại có tính kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên loại O và H Tuy nhiên, chúng không sinh oxidase hoặc thủy phân ure và một số không sinh hơi, có thể phát triển ở 37oC

- Chúng phân bố ở khắp nơi trong môi trường đặc biệt trong thực phẩm, nước

và ruột già

e Đặc điểm sinh hóa và nuôi cấy:

Hình 2.4: Escherichia coli

- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ E.coli làm đục nhẹ môi trường, càng để

lâu càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có nổi váng mỏng trên môi trường

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S có màu xám trắng, tròn, ướt, bề nặt bóng, kích thướt khoảng 2 – 3mm

+ Trên môi trường thạch EMB: E.coli cho khuẩn lạc tím ánh kim

+ Trên môi trường thạch MacConkey: E.coli cho khuẩn lạc đỏ hồng

+ Trên môi trường thạch nghiêng TSI: E.coli tạo acid/acid (vàng/vàng)

Để phân biệt E.coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử nghiệm IMViC E.coli cho kết quả IMViC là ++ - - hoặc - + - -

 Kháng nguyên lông H: Có bản chất là Protein, tạo nên khả năng di động của E.coli, kém chịu nhiệt Có khoảng 56 type kháng nguyên

 Kháng nguyên giáp mô K: Sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn, nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị nung nóng Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type A,L,B và người ta phân loại kháng nguyên này dựa vào tính chất hóa học

Một vài E.coli tiết độc tố ruột có những lông bám, những lông bám này bản chất là protein nên việc sắp xếp chúng vào kháng nguyên K là không phù hợp và sau

đó chúng được xếp và kháng nguyên tiêm mao F

 Kháng nguyên tiêm mao F: Tham gia vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella, dạng thẳng, xoắn, dài khoảng 4ìm, đường kính 2,1 – 7,0nm Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mạc nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Ví dụ: E.coli có mã số O157:H7 là vi khuẩn thường gặp nhất Chúng là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy có máu và gây tổn thương thận ở người Người bị nhiễm trùng vi khuẩn STEC thường có triệu chứng đau thắt bao tử, tiêu chảy thường có máu và ói mửa

 Việc sử dụng E.coli là một vi sinh vật chỉ thị được giới hạn bởi các yếu tố:

+ E.coli không phải là một loài vi sinh vật chỉ thị duy nhất

+ Nó là một trong số các chi của nhóm Coliform như Proteus và Aerobacter

thường được tìm thấy bên ngoài đường ruột của con người

+ Các vi sinh vật khác tìm thấy trong nước nhưng không đại diện cho phân ô

nhiễm mà chúng có một số đặc điểm giống E.coli

g Tính chất gây bệnh

Khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng lớn kèm theo độc tố của chúng E.coli

gây tiêu chảy gồm các nhóm sau:

Hình 2.5: E.coli O157:H7

- Nhóm EPEC (Entreropathaogenic E.coli): Gây tiêu chảy cho các em dưới 2

tuổi

- Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): Gây bệnh cho tẻ em, người lớn tiết ra

độc tố ruột ST và LT(Gây tiêu chảy trầm trọng và kéo dài)

- Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): Gây viêm loét niêm mạc gây tiêu chảy có

máu

- Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa tiêu chảy và là nguyên

nhân gây viêm đại tràng xuất huyết, làm tổn thương niêm mạc gây sưng,

Ví dụ: S.bovis chủ yếu xảy ra ở gia súc và cừu; S.equinus có trong ngựa và S.avium có ở gia cầm và các loài chim

Việc so sánh số lượng E.coli và Streptococcus faecal trong nước có thể được

dùng để xác định ô nhiễm precisesource

- Trong phòng thí nghiệm chúng được định nghĩa là tất cả các vi sinh vật sản xuất màu đỏ hoặc màu hồng trong vòng 48 giờ ở 35 ± 1.0oC (Phương pháp Standard, 1989)

- Một số loài có phân bố rộng hơn hiện diện trong đường ruột người và động

vật như: S.faecalis và S faecium hoặc có 2 biotype (S faecalis var liquefaciens và loại S faecalis có khả năng thủy phân tinh bột)

- Trong thực tế, S.faecalis tồn tại trong môi trường nước tốt hơn E.coli

2.1.4.5 Enterococcus:

a Giới thiệu:

- Enterococcus là vi khuẩn aicd lactic của Firmicutes phylum Cầu khuẩn gram

dương thường xảy ra trong cặp hoặc chuỗi ngắn và rất khó để phân biệt với

Streptococcus về đặc tính

- Năm 1984 khi phân tích di truyền DNA người ta đã tìm ra được sự khác biệt

của chi Enterococcus được phân loại như Streptococcus

- Nó là vi sinh vật kỵ khí tùy nghi, không cần oxi cho quá trình chuyển hóa nhưng nó có thể sống trong môi trường giàu oxi Chúng không có khả năng hình thành bào tử, chịu được nhiệt độ 10 – 45oC, pH = 4.5 – 10.0, và nồng độ NaCl cao

- Nhóm Enterococcus bao gồm hai chủng là S.faecalis và S faecium (metcalf và

Eddy, 1991)

- Chúng được phân biệt với Streptococcus bởi khả năng phát triển trong natri

clorua 6.5%, ở pH 9.6 và ở 10oC – 45oC

- Enterococci được xem là vi khuẩn chỉ thị chất lượng nước, đặc biệt là chỉ thị

cho chất lượng nước biển (Theo tiêu chuẩn phương pháp nawm; EPA, 1986)

- Chiếm ưu thế trong đường ruột như E faecalis enterococci, E.faecium, E.durans và E.hirae… Ngoài ra cũng có một số loài được tìm thấy trong đường ruột như S.bovis và S equinus

d Tăng trưởng

- Enterococci gram dương có nhiều khó tính trong nhu cầu dinh dưỡng hơn

gram âm Gram dương yêu cầu cung cấp yếu tố tăng trưởng nhiều hơn đặc biệt là vitaminB và acid amin nhất định

- Chúng phát triển ở phạm vi rộng Mặc dù là vi sinh vật ưa khí nhưng chúng không sản xuất catalase (trừ pseudonolase bởi một số chủng trưởng thành trong sự hiện diện của oxi), và được phát triển tốt ở điều kiện của quá trình oxy hóa thấp

Được nghiên cứu trên phân của trẻ sơ sinh khoảng năm 1900 do Tisser đặt tên

nó là Bacillus bifidus; sau này nó được đặc tên là Lactobacilius bifidus và hiện tại Bifidobacterium bifidum Bifidobacteria được dùng để chỉ thị sự ô nhiễm phân

a Đặc điểm hình thái và yêu cầu tăng trưởng

- Những vi khuẩn gram dương, kỵ khí có nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu và tối

- Chúng được tìm thấy trong phân người ở cấp bậc cao hơn mỗi gam (108 -

109) hơn E.coil (106 - 107), và điều này đã làm cho chúng trở nên các chỉ số ô nhiễm

phân con người

- Phương pháp phân biệt giữa giống trong phân người và phân động vật được

đưa ra bởi Gavinietal và chia Bifidobacteria với những nguồn gốc từ người thuộc

nhóm I, III, VII

Hình 2.8: Bifidobacterium

- Gần đây chúng được đề xuất như chỉ thị ô nhiễm phân trong nước ngọt nhiệt

đới khi chúng chết giảm nhanh hơn coliform hoặc Enterococci Bifidobacteria

thường gặp trong ngũ cốc rau quả, động vật

2.1.4.7 Staphylococcus aureus:

a Giới thiệu:

- S.aureus do Robert Koch (1843 - 1910) phát hiện

năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và Louis Pasteur

(1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của

lịch sử ngành vi sinh vật học

- Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotlsnd Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội Phẩu Thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông

sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và trình bày tương đối đầy đủ vai

trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng Đến năm 1884 được

Rosenbach nghiên cứu tỉ mĩ, nó thuộc họ Microccaeae

- Sự hiện diện của Staphylococcus aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ

sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến

b Phân loại khoa học:

- Giới: Eubacteria

Hình 2.9: Bifidobacterium

Hình 2.10: Staphylococcus aureus

- Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh, được xếp vào nhóm

vi khuẩn cơ hội, vì sự có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập

- Vi khuẩn Staphylococcus aureus hình cầu, đường kính 0.8 – 1.5ìm, gram

dương, có khả năng sinh nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm Các tế bào thường liên kết thành các chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả năng sinh coagulase

- S.aureus hiếu khí hay kỵ khí ý có khả năng lên men và sinh axit từ manitol,

trehalose, saccarose Có khả năng tăng trưởng trên môi trường có đến 15% NaCl Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc

- Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất là khi

Hình 2.11: Staphylococcus

d Đặc điểm sinh hóa và điều kiện sinh trưởng:

- S.aureus còn được gọi là tụ cầu khuẩn gây bệnh, do đó cần xác định để biết

mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích có mang mối nguy hiểm cho người tiêu dùng hay không

- Staphylococcus aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và

phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập

- Phát triển tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh Nhiệt độ tối thích 37oC, pH tối ưu = 7.2

- Lên men đường glucose, lactose, maltose, sacharose, glycerol, manitol Không lên men salicin,raffinose, inulin

- Có khả năng chịu măn cao, chúng làm đông tụ sữa Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu

- Phản ứng indol - , NH3 - , thủy phân gelantine, đông huyết tương

- Trên môi trường thạch khuẩn lạc có dạng hình tròn trơn bóng, đục mờ

- Trên môi trường lỏng, tế bào ở dạng cặn, vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm ở

- exfoliatine: Là men phá hủy lớp thượng bì, men này gây tổn thương da tạo bọng nước Ví dụ: hội chứng Lyell do tụ cầu

- Sáu độc tố ruột: (Enteroxine A,B,C,D,E,F) bền với nhiệt Các độc tố ruột đóng

f Khả năng gây bệnh:

f.1 Gây ngộ độc thực phẩm:

- Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm đó

sẽ bị ngộ độc Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống trong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng, và ít có khả năng truyền nhiễm

- Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột Type A và D gây ngộ độc thực phẩm cho người

- Sử dụng thuốc kháng sinh: Tùy vào từng trường hợp người ta sử dụng thuốc kháng sinh khác nhau cho bệnh nhân, tuy nhiên người ta cần làm kháng sinh đồ cho từng bệnh nhân và dùng gamma- globuline chống tụ cầu

- Quá trình thích ứng và thời gian điều trị

f.4 Phòng ngừa:

- Thực hiện tốt vệ sinh cá nhân và sinh hoạt hằng ngày, ăn uống hợp vệ sinh, nấu kỹ trước khi dùng Không lấy sữa từ động vật viêm vú, trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả năng sinh độc tố

- Tăng cường uống vitamin, năng cao sức khỏe, rửa tay bằng nước nóng và xà phòng, hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển…

2.1.4.8 Clostridium:

a Giới thiệu:

- Vi khuẩn Clostridium được Emile van Ermengem phân lập vào năm 1895

- Năm 1896, Emile Van Ermengem tìm ra mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn

Clostridium botulinum).Kê từ năm 1953 tất cả các loài neurotoxins botulinum sinh (loại A - G) đã được cho rằng C.botulinum, nhưng sau đó kiểu hình và kiểu gen đáng

kể tồn tại để chứng minh tính không đồng nhất trong các loài Điều này đã dẫn đến

việc phân loại lại của C.botulinum loại G giống như một loài

- Năm 2003 bộ gen của C.botulinum được công bố (công trình của viện Sanger

với tiến sĩ Roger Huston và tiến sĩ M.Peck)

b Phân loại khoa học:

- Giới: Bacteria

- Clotridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần

lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng

lượng Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt và

một số loài thuộc nhóm ưa lạnh Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là

C.botulinum và C.perfringens

- C.botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng đưựoc trong môi

trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác Các dòng trong loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A-F Kiểu ký hiệu nguyên A,B và F có hoạt tính thủy giải protein tạo nên một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willin và Hobbs, còn các kiểu C,D và E không có khả năng này Kiểu A thường thấy trên các mẫu thịt trong khi kiểu

E chỉ được phân lập trên các mẫu cá

- C.perfringens làloài kỵ khí không bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trong các môi

trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử trên môi trường nuôi cấy Ellner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline Loài này

có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm

Hình 2.12: Clostridium

- Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có

chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 370C trong 1 -2 ngày Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 500C Trên môi trường này các khuẩn lạc

Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường

d Cấu trúc tế bào và phân tử của C.botulinum:

d.1 Cấu trúc tế bào: Kích thước 0.3 – 0.7ìm x 3.5 – 7.0ìm, có hình que, không có roi,

là vi khuẩn gram dương, sinh bào tử Tuy nhiên bào tử thường to hơn chiều ngang của tế bào

d.2 Cấu trúc phân tử:

Toxin được tổng hợp từ một chuỗi polypeptid có

trọng lượng phân tử gần 150.000 dalton Ở cấu

trúc này, phân tử độc tố có hoạt lực tương đối

thấp, nhưng khi bị một số enzyme của vi khuẩn và

trypsin tách ra thành hai chuỗi nặng (100.000

dalton) và nhẹ (50.000 dalton) nối với nhau bằng

cầu nối sulfur có gắn với một phân tử Zn

Độc tố gen Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể Bacteriophage Plasmid

Close relatives C.Sporogens

C.putrificum

C.butyricum C.beijerinickii

C.haemolyticum C.novyi type A

C.subterminale C.haemolyticum Bảng 2.5: Các độc tố gây hại cho người và động vật

e.2 Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum:

- Clostridium botulinum sẽ tiết ra một độc tố sinh học mạnh ức chế sự phóng

thích hoạt động của các bó cơ, tác động đến nơi tiếp hợp cholinergic qua trung gian Calcium vào khe sinap làm mất khả năng chi phối hóa học tại chổ và mất hoạt động thần kinh của sợi nơron vận động trong thoi cơ Hoạt chất này tác động tại nơi tiếp hợp thần kinh cơ nên ngăn cản sự phóng thích Acetylcholine và gây ra liệt

- Độc tố của Clostridium botulinum tác dụng qua 3 giai đoạn: Kết nối, Thâm

nhập, Ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh Độc tố này không ảnh hưởng vào sự tổng hợp hay dự trữ Acetylcholine nhưng ảnh hưởng vào sự phóng thích chất này ở sợi tận cùng tiền tiếp hợp