- Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí, không lên men mantose, khử nitrat thành nitrit, có khả năng phân giải Tyroxin, Catalase(+), Citrate(+).
e. Cơ chế gây bênh: e.1. Độc tố:
- Độc tố gây tiêu chảy (Diarrhoed toxin): Vi khuẩn sản sinh độc tố trong thịt, rau quả, gia vị. Là một loại protein gây hủy hoại biểu bì mạc ruột, gây tiêu chảy.
- Độc tố gây nôn mửa emetic toxin: có mặt trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất là phospholipit có tính ổn định và không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
- Ngoài ra chúng còn gây chết người bởi enzyme hemolyzin, gây nhiễm trùng, viêm màng não,…
e.2. Cơ chế:
Bào tử của B.cereus bám vào các tế bào Caco – 2 (trên các tế bào biểu mô của
người). Sau khi bám vào các bào tử nảy mầm một cách nhanh chóng trong vòng 1h,
hình thành tế bào B.cereus dinh dưỡng trên đỉnh của các biểu mô, tiếp đó sẽ sản
sinh ra độc tố. Độc tố xuất hiện trong đường ruột sẽ tập trung ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen gây ra bệnh một cách trầm trọng.
f. Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa:
- Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn 105/g thực phẩm sẽ gây độc. Dẫn đến đau
bụng, buồn nôn sau 1 – 5h bệnh kéo dài 24h.
- Phòng: Không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn được hâm nóng
trên 80oC trước khi ăn.
2.1.4.10. Streptococcus faecalis:
- Trước năm 1984, enterococci là thành viên của Streptococcus như vậy
E.faecalis được gọi là Streptococcus faecalis.
- Streptoccus là liên cầu khuẩn, có dạng hình cầu hoặc hình ovan kéo dài. Là vi
khuẩn gram dương, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày. - Là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện nhưng phát triển tốt trong điều kiện kị khí. Khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đậm, khi nuôi cấy trong môi trường azide tetrazolium chứa TTC. Có phản ứng catalase và oxidase âm tính, chúng chịu được
nồng độ muối 6.4%, pH= 4.5 – 10, nhiệt độ 10 – 45oC.
b. Đặc điểm và phân bố:
- Là chỉ tiêu để xác định mức độ ô nhiễm phân của thực phẩm.
- Thuộc nhóm liên cầu khuẩn phân, đường kính < 2ìm. Nhiệt độ thích hợp cho
sinh trưởng và phát triển là 30 – 35oC. Enterococcus faecalis có thể sống sót trên
các bề mặt môi trường.
- Không chịu được nhiệt độ thanh trùng, pH<6.3, chất kháng sinh và chất sát trùng. Không tạo độc tố, lên men glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường. Chúng thủy phân esculine khi có mặt của 40% các muối mật tạo 6,7-hydroxycoumarin (chất này kết hợp với Fe3+ tạo hợp chất màu nâu đen). Nó cũng có thể sản xuất một phản ứng pseudocatalase nếu trồng trên thạch máu.
- Là cầu khuẩn gram dương nó có khả năng tăng sinh mạnh mẽ được sử dụng làm acid lactic điều trị rối loạn đường ruột, là thành phần chính của một số Probiotic. Tuy nhiên, nó phát triển mạnh trên vết thương và vết bỏng.
c. Cấu trúc tế bào:
Có bốn phân tử DNA và ba plasmid tròn được xác định: Plasmid – 1 chứa 66.320bp.
Plasmid – 2 chứa 17.963bp. Plasmid – 3 chứa 57.660bp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các plasmid mã hóa một sộ gen bao gồm: transposases, protein kháng đa
thuốc và sự phát triển của một chất ức chế ppGpp. E.faecalis nhiễm sắc thể là
37.38%.
- Ngoài ra e.faecalis cũng chứa gen 3Ebp(mã hó cho màng sinh học và pili) quy
định OG1RF operons gây viêm nội tâm mạc của E.faecalis. Sử dụng operons để sản
xuất pili bề mặt. Các pili bề mặt được sử dụng để bám vào bề mặt tế bào và là kháng nguyên của con người trong quá trình viêm nội tâm mạc.
d. Triệu chứng và biện pháp phòng ngừa:
- Viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van tim. Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng.
- Triệu chứng: Đau họng, sốt, mẩn đỏ da, tiêu chảy và nôn mửa. Xuất hiện sau 12 – 14h kéo dài 2 – 3 ngày.
- Nấu chín kỹ và làm lạnh sâu, vệ sinh sạch sẽ, vệ sinh cá nhân sạch sẽ.
CHƯƠNG III. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM 3.1. Các phương pháp truyền thống phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật:
3.1.1. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp: a. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu trên kính hiển vi: a. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu trên kính hiển vi:
Số lượng vi sinh vật được xác định bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Thường áp dụng để xác định mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, nấm mốc, tảo và protozoa.
Ưu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật cứa
trong mẫu.
Nhược điểm:
- Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết.
- Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu.
- Khó đạt được độ chính xác cao.
- Không thích hợp với huyên phù vi sinh vật có mật độ thấp
Đơn vị tính: tế bào/ml tế bào/g CFU/ml CFU/g MPN/ml MPN/g
Hình 3.1 : Cách đếm tế bào trong buồng đếm hồng cầu
- Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 – 10 tế bào vsv. Mẫu phải được pha loãng bằng dung dịch pha loãng chứa 0.1% pepton và 0.1% laurylsulphat và 0.01% methyl blue, tất cả các dung dịch pha loãng đều phải lọc trước khi sử dụng.
- Đặt một giọt mẫu đã được pha loãng vào buồng đếm, dùng nắp kính đậy lại và lau thật sạch vật kính và buồng đếm. Thể tích mẫu chứa trong buồng đếm là khoảng không gian giữa đĩa đếm và vật kính, sau đó để ổn định trong 5 phút. Đếm ngẫu nhiên 50 – 100 ô nhỏ. Tính trung bình số lượng vi khuẩn trong các ô nhân với 20.000 và dộ pha loãng mẫu trước đó ta được số lượng tế bào trong 1ml.
b. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang: Các chất nhuộm phát huỳnh quang: Các chất nhuộm phát huỳnh quang:
- Acridin cam (AODC)
- 4’,6-dianodino-2-phenyl-indol (DAPI)
- Fluorescein isothiocyanate (FTTC)
Ưu điểm:
- Loại bỏ sai số do các chất vẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kết quả phản ánh đúng với sinh khối
- Không sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để pha loãng mẫu thực phẩm.
- Các dung dịch pha loãng mẫu:
+ Saline peptone water (SPW) NaCl:1g
Peptone: 8.5g
Nước cất vừa đủ:1 lít
+ Buffered peptone water (BPW) NaCl: 5g
Peptone: 10g
Hình 3.2: Pha loãng mẫu
Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng: 10g + 90ml dung dịch pha loãng = độ pha
loãng 101 , làm tương tự cho các bước tiếp theo.
Sau đó cấy vào môi trường
Hình 3.3: Cấy vào môi trường
3.1.2. Định lượng Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
3.1.2.1. Nguyên tắc
Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch
chọn lọc thích hợp chứa lactose. Sau khi ủ 370C + 10C trong 24 – 48 giờ, đếm số
lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc Coliforms là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời môi trường còn chứa muối mật như một tác nhân chọn lọc và các tác nhận chỉ thị như neutral red, crystal violet. Khẳng định các dòng khuẩn lạc đặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL.
Để tránh các trường hợp không phát hiện được Coliforms do bị tổn thương hay suy yếu do trong quá trình chế biến, bảo quản hay tiếp xúc với môi trường chọn lọc
làm chúng không phát triển thành khuẩn lạc, chúng ta phải phục hồi khả năng hoạt động của Coliforms bằng một môi trường chứa nguồn carbon khác như môi trường tryptone soya agar.
Số lượng Coliforms được xác định bằng số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, hệ số khẳng định và nồng độ pha loãng trước khi cấy mẫu vào đĩa.
3.1.2.2. Môi trường và hóa chất
- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)
- Violet Red Bile Agar (VRB)
- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)
- EC broth
3.1.2.3. Quy trình phân tích
a. Chuẩn bị mẫu
Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nhưng quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng mẫu chứa khoảng <100 khuẩn lạc
b. Cấy mẫu và đổ môi trường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc.
Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội
đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và
khả năng của Coliforms. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông
đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 + 10C trong 24 – 48 giờ.
c. Đọc kết quả
Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính >0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật
Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB
d. Khẳng định
Trong trường hợp mẫu có chưa các nguồn carbon khác không phải lactose, để tránh các trường VSV sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và tạo khuẩn lạc tương tự như Coliforms, giai đoạn khẳng định là cần thiết. Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với
các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ ở 370C trong
24 – 48 giờ. Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khẩn lạc khẳng định
Hình 3.5: Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL
e. Cách tính kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms theo công thức:
N
A (CFU/g hay CFU/ml) = x R
n1vf1 + … + nivfi
Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v: thể tích cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỷ lệ xác nhận
Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ số thập phân.
3.1.3.1. Nguyên tắc
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện
hiếu khí ở 300C/72h + 6h hoặc 370C/48h + 6h
3.1.3.2. Môi trường và thiết bị nuôi cấy
a. Môi trường
- Dung dịch pha loãng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) hoặc Buffer Pepton (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Water (BPW)
- Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA)
b. Thiết bị
- Tủ ấm 300C + 10C
3.1.3.3. Quy trình phân tích
a. Chuẩn bị mẫu
Cân chính xác 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 90ml (hoặc 225 ml) dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2,5 phút. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi
đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1.
Dich pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch
pha loãng đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương
tự để có được các độ pha loãng cần thiết.
b. Đổ đĩa
Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật. Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2 – 3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45 –
500C. Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3 – 5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc
c. Nuôi ủ
Các đĩa được lật ngược lại và nuôi ủ ở 300C trong 72 giờ
d. Đọc kết quả
Hình 3.6. Tổng số vi sinh vật hiếu khí
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính như sau:
N
A (CFU/g) =
n1Vf1 + … + niVfi
Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
Ví dụ: trong một trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể thu được kết quả sau: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 Kết quả Đĩa 1 235 26 Đĩa 2 246 21 235 + 246 + 26 A = = 2,4.105 cfu/g 2 x 1 x 10-3 + 1 x 1 x 10-4
Các kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân.
3.1.4. Phương pháp màng lọc vi sinh vật: - Kích thước lỗ lọc 0.47ìm hay 0.22ìm. Đường kính và màng lọc phụ thuộc vào đường kính phễu lọc thường là 45mm.
- Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc.
- Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp : < 150 khuẩn lạc/ màng. - Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 – 10ml
- Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dung dịch pha loãng hay nước cất vô trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.8 : Các bộ phận của thiết bị lọc vi sinh vật
Ưu điểm: Xác định được mật độ VSV cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml,
100ml…
Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn.
3.1.5.Phương pháp MPN (phương pháp tối khả) : 3.1.5.1.Nguyên tắc:
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, 2 nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiệm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu.
3.1.5.2.Sơ đồ quy trình kiểm nghiệm:
1ml (10-1) + 9ml nước vô trùng 1ml(10-2) + 9ml nước cất vô trùng
Stormacher
Hình 3.9: Sơ đồ quy trình kiểm nghiệm
Bước 1: 10gr thực phẩm + 90ml Nacl 0.85% hoặc là nước vô trùng, Stormacher
thu được nồng độ 10-1, mục đích đồng nhất để phân bố đều vi sinh vật.
Bước 2: Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vật có trong mẫu ban đầu.
Lấy 1ml mẫu ở nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm thứ nhất, sau đó cho 9ml nước vô
trùng, ta được ống nghiệm có nồng độ 10-2. Sau đó lấy 1ml mẫu ở nồng độ 10-2 cho
vào ống nghiệm thứ hai, cho thệm 9ml nước cất vô trùng thu được ống nghiệm có
nồng độ 10-3. Làm tương tự như trên ta được ống nghiệm có nồng độ 10-4, 10-5…
Bước 3:Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nồng độ
liên tiếp (10-1, 10-2, 10-3) như sau: Mỗi nồng độ lấy 3 ống nghiệm cho vào mỗi ống
nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiệm sao cho nghập ống durham. Ghi 3 nồng độ liên tiếp bên ngoài ống nghiệm (mỗi nồng độ 3 ống nghiệm).
Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ở nồng độ 10-1 vào 3 ống nghiệm có ghi nồng độ