CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

Bài trình bày về "CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM"

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12/2013

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM

LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

I Giới thiệu chung về các họ Vitamin trong thực phẩm

1 Phân loại Vitamin trong thực phẩm – phản ứng sinh hóa của vitamin

Vitamin được ghép bởi hai chữ: “vita” và “amine” “Vita” gốc Latinh có nghĩa là sựsống, “amine” là các acid amin Vitamin là những acid amine cần thiết cho sự sống

Cơ thể con người cần một lượng nhỏ Vitamin nhưng thiếu chúng cơ thể sẽ mắc bệnh.Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên 30 loại vitamin khác nhau,đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo và tác dụng sinh lý của chúng Người

ta cũng tổng hợp một số lượng lớn vitamin bằng tổng hợp hoá học ở phòng thínghiệm

Căn cứ vào tính hoà tan của vitamin mà ngày nay người ta chia vitamin ra làm hainhóm

1.1 Các vitamin tan trong nước

Vitamin tan trong nước chủ yếu tham gia và làm nhiệm vụ xúc tác trong quá trình sinhhọc gắn liền với sự giải phóng năng lượng ( các phản ứng oxi hoá - khử, sự phân giảicác hợp chất hữu cơ ) nghĩa là chúng hoàn thành chức năng năng lượng như nhómcác Vitamin B1 (tiamin), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (axit pantotenic),Vitamin B5 (nicotinamit), Vitamin B6 (piridoxin), Vitamin B7 (biotin), Vitamin B10(axit folic), các vitamin B12 (các cianocobalamin), vitamin B15 (axit pangaminic),vitamin C, vitamin P (citrin), vitamin U (S-metyl-metionin), Vitamin C,…

1.2 Các vitamin tan trong chất béo ( trong dầu và mỡ)

Vitamin hoà tan trong chất béo (trong dầu và mỡ) thì tham gia vào phản ứng tạo nêncác chất, tạo nên các cấu trúc, các cơ quan và các mô của cơ thể, nghĩa là chúng hoànthành chức năng tạo hình như nhóm các Vitamin A (A1, A2), D, K, E

2 Phân bố

Thực phẩm chứa nhiều loại vitamin, điển hình như

- Vitamin A có nhiều trong gan, cá, sữa

- Tiền tố vitamin A có nhiều trong cà rốt, rau xanh, quả mơ, dưa chột, quả đào cómàu vàng, ngô

- Vitamin D có nhiều trong cá, gan, lòng đỏ trứng, thịt lợn, chất béo của sữa

- Vitamin E có nhiều trong bột mì, quả hạnh nhân

- Vitamin C có nhiều trong cam, chanh, bưởi, rau xanh, cải bắp, cải xoong, xoài,

củ cải, hành tây, ớt ngọt, rau mùi, ổi

- Vitamin B1 có nhiều trong gạo, bột mì, bột đậu xanh, thịt gà, nấm

- Vitamin B6 có nhiều trong gan bê, ruốc thịt, thịt gà, ngô

- Vitamin B9 (hay còn gọi là axit pholic) có nhiều trong măng tây, rau xanh, đậurau xanh, gan, thịt gà, trứng

- Vitamin B12 có nhiều trong pho mát làm từ thịt dê và thịt cừu, cá, quả hạnhnhân, cải xoong, dưa bắp cải, sữa tươi, sữa bột, sữa chua, sữa đậu nành, nướckhoáng

3 Cấu tạo, tính chất, trạng thái cảm quan

Vitamin B3 Vitamin B5

Vitamin C

Các vitamin rất khác nhau về tính chất vật lý, tính chất hóa học Trong tự nhiên, cácvitamin tồn tại ở dạng rắn hoặc dạng keo Ví dụ

- Vitamin B: nhóm các vitamin B đều tan tốt trong nước, thường ở dạng tinh thể

- Vitamin B1 là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, thường có mùiđặc trưng Khi tiếp xúc với không khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm(khoảng 4% nước)

- Vitamin B1 có tính axit, hoà tan tốt trong môi trường nước, axit acetic, nhưng

- khó tan trong ethanol 96% và methanol, không tan trong ete, benzen haycloroform và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nướng Vitamin B1nóng chảy ở 2330C-2520C

- Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bịphân huỷ khi đun nóng

- Vitamin B2 ở dạng tinh thể màu vàng, có vị đắng, dễ bị phân hủy bởi ánh nắngmặt trời, nhiệt độ cao và không ổn định với tia cực tím Trong vùng UVVitamin B2 hấp thu tại 2 bước sóng 223,3 và 268,0nm Vitamin B2 hoà tantrong nước, ổn định trong môi trường axit, chịu nhiệt, phân huỷ nhanh trongmôi trường kiềm Nó cũng bền vững khi đông lạnh, ở trạng thái khô VitaminB2 bền với nhiệt và axit

- Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước và trongrượu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ nóng chảy

ở 1600C, pyridoxin hydrochloric nóng chảy ở 204-206 0C, bền vững khi đunnóng Bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tínhoxy hóa Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng Chúng phân hủy nhanh khi chiếusáng ở môi trường kiềm hay trung tính, còn trong môi trường axit thì pyridoxin,pyridoxan và pyridoxamin bền hơn

- Vitamin C kết tinh không màu hoặc hơi vàng, rất dễ tan trong nước (300g/lít).Dung dịch nước 5% có pH=3 Có khi dùng dạng muối natri dễ tan trong nướchơn (900g/lít).

- Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:

 Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơthể

 Tiền vitamin A: nó chính là một tiền chất của vitamin A được biết đếnnhiều dưới tên bêta-caroten Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruộtthành vitamin A để cơ thể có thể sử dụng

- Vitamin E: tồn tại trong tự nhiên với 8 dạng khác nhau, là chất dầu lỏng, khôngmàu, hòa tan rất tốt trong dầu thực vật, rượu etylic có thể kết tinh chậm trongrượu metylic nếu giữ ở nhiệt đọ thấp tới -35 oC Vitamin E khá bền với nhiệt,nhưng không bền với tia tử ngoại

4 Tầm quan trọng của Vitamin

Thông thường các vitamin trong cùng một nhóm có tác dụng bổ sung, hoàn thiện, làmtăng tác dụng của nhau Các nhóm đại diện cùng tác dụng như thế gồm có:

- Nhóm các vitamin làm tăng khả năng chống lại viêm nhiễm gồm có vitamin A,B1, B2, C, D, H, P

- Nhóm các vitamin bảo đảm cho hệ thần kinh hoạt động hoàn hảo gồm vitamin

- Nhóm các vitamin chi phối tới hoạt động sinh dục gồm có A, C, E

- Nhóm trợ giúp sự tăng trưởng: gồm tất cả các vitamin trừ vitamin H

5 Việc lạm dụng Vitamin và hậu quả

- Vitamin phần lớn không tổng hợp được trong cơ thể mà phải có trong thức ănnguồn gốc động vật và thực vật Việc thiếu vitamin sẽ gây ra nhiều rối loạn cho

- Các chuyên gia dinh dưỡng nói rằng cách tốt nhất để cơ thể hấp thụ các vitamin

là thông qua một chế độ ăn uống lành mạnh với nhiều trái cây và rau Mọingười nên dùng vitamin bổ sung chỉ khi họ không thể bổ sung đủ vitamin quathực phẩm hoặc có nhu cầu thêm, và nên tham khảo ý kiến bác sĩ hoặc chuyêngia dinh dưỡng uy tín về đúng liều để dùng

II Các phương pháp phân tích xác định hàm lượng Vitamin trong thực phẩm

Các vitamin đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu từ rất lâu Đi kèm vớiviệc nghiên cứu các vitamin thì các phương pháp phân tich hóa lý, y sinh dùng để xácđịnh hàm lượng các vitamin từ các nguồn gốc khác nhau cũng đã phát triển khá đầy đủ

và chi tiết Trong phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin liệt kê các phương pháp xác địnhhàm lượng vitamin trong thực phẩm theo 2 nhóm vitamin tan trong nước và trong dầu.Dựa vào cấu trúc hóa học, trạng thái tồn tại của các vitamin, hàm lượng các vitamin cótrong mẫu cần phân tích và các điều kiện thiết bị, hóa chất có trong phòng thí nghiệm,các vitamin được xác định bằng rất nhiều cách khác nhau từ phương pháp phân tích cổđiển đến phương pháp phân tích hiện đại

A Định lượng các nhóm Vitamin tan trong nước

Như đã nêu ở trên, các Vitamin thuộc nhóm này bao gồm các Vitamin B, Vitamin C…Đặc điểm chung của nhóm này là có cấu trúc phân cực, tan nhiều trong nước Cácphương pháp xác định hàm lượng nhóm Vitamin này bao gồm:

1 Phương pháp cực phổ

a) Nguyên lý:

Các Vitamin nhóm B và Vitamin C là những hợp chất phân cực

Vitamin nhóm B như B1, B3, B6, B9, Vitamin C trong thực phẩm được phân tíchbằng phương phấp cực phổ trên thiết bị METROHM 797 VA COMPUTRACE củahãng METROHM (Thụy Sỹ)

Thời gian khuấy sau khi cho mẫu 3s

Thời gian cân bằng trước khi quét thế 10s

Thời gian 1 xung 0,04s

- Nền đệm axetat, pH=6,5

- Kết luận: Phương pháp cực phổ là một trong những phương pháp phân tích hữu

cơ nhanh và đạt được độ chính xác cao, ngoài ra chi phí cho máy móc thiết bị

và hoá chất phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm ở Việt Nam

2 Phương pháp chuẩn độ Iot xác định Vitamin C

a) Nguyên tắc: được xây dựng trên nguyên tắc phản ứng oxy hóa khử

Iốt tương đối không tan trong nước, nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách pha trộn iốt với iođua và hình thành triiođua:

I2 + I- < > I3

-Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic:

là điểm dừng cho phản ứng chuẩn độ

Quy trình chuẩn độ này thích hợp trong việc kiểm tra hàm lượng vitamin C trong viên thuốc vitamin C, nước ép quả, trái cây tươi, đông lạnh hoặc trái cây đóng gói và rau quả Phương pháp chuẩn độ có thể thực hiện chỉ sử dụng dung dịch iốt và không dùng iodate, nhưng dung dịch iodate ổn định hơn và cho kết quả chính xác hơn

b) Tiến hành:

- Chuẩn bị dung dịch

 Dung dịch chỉ thị 1% tinh bột:

 Cho 0,5 g tinh bột hòa tan vào 50 ml nước cất nóng gần sôi

 Hòa tan hoàn toàn và để dung dịch nguội trước khi sử dụng

 Dung dịch iốt:

 Hòa tan 5 g KI và 0,268 g KIO3 trong 200 ml nước cất

 Thêm 30 ml acid sunfuric 3 M

 Cho dung dịch này vào ống đong 500 ml và pha loãng dung dịch bằng nước cất đến vạch định mức 500 ml Hòa tan dung dịch hoàn toàn

 Cho dung dịch vào becher 600 ml

- Xử lý mẫu (kẹo vitamin C):

 Hòa tan 0,250 g kẹo vitamin C (acid ascorbic) trong 100 ml nước cất

 Dùng nước cất pha loãng thành dung dịch 250 ml bằng bình định mức

 Thêm 25,00 ml dung dịch mẫu xác định vitamin C vào bình erlen 125 ml

 Thêm 10 giọt dung dịch hồ tinh bột 1 %

 Rửa sạch buret với một lượng nhỏ dung dịch iốt và sau đó cho dung dịch iốt vàburet Ghi lại vạch thể tích dung dịch ban đầu trong buret

 Chuẩn độ dung dịch cho đến điểm dừng phản ứng, thấy dấu hiệu đầu tiên của màu xanh dương bền trong 20 giây khi lắc đều dung dịch

 Ghi nhận vạch thể tích dung dịch iốt trên buret Lượng iốt đã dùngcho chuẩn độ chính là thể tích dung dịch iốt ban đầu trừ đi dung dịch sau chuẩn độ

 Làm lại thí nghiệm chuẩn độ ít nhất 2 lần Các kết quả chấp nhận sai

khác 0,1 ml

c) Tính toán kết quả:

Gọi Viot: thể tích dung dịch chuẩn Iot dùng chuẩn độ (mlk)

Niot: nồng độ đương lượng dung dịch Iot dùng chuẩn độ (N)

Ta có:

iot iot sample

sample

V * NN

Rất nhiều hợp chất giàu e, như hợp chấy chứa hai hoặc nhiều nối đôi liên hợp và do có electron nên phát huỳnh quang.

∏-Các e của một phân tử tồn tại trong điều kiện năng lượng thấp nhất (mức năng l ượng thấpnhất của trạng thái cơ bản)vì các e này không ổn định trong bất cứ một bậc năng lượngnào khác Trạng thái cơ bản này là trạng thái năng lượng bình thường của một phân tử.nếu như phân tử này bị chiếu bởi bức xạ tử ngoại và nó hấp thụ một số proton thì phân tửnày sẽ bị kích thíchđén một trạng thái năng lượng cao hơn Hiện tượng này cũng giốngnhư hiện tượng đã xảy ra khi một e hoặc các e thu năng lượng và nhảy từ trạng thái nănglượng cơ bản đến mức năng lượng cao nhất của trạng thái kích thích đầu tiên

Theo lí thuyết lượng tử thì mức năng lượng của một phân tử có thể tồn tại chỉ trong một

số trạng thái xác định ,cho nên chỉ có ánh sáng với những tần số tương ứng với nănglượng cần thiết để nâng phân tử từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích bị hấp thụ.Bởi vì một trong rất nhiều trạng thái kích thích có thể được hình thành, nên các hợp chất

có ít năng lượng hơn photon kích thích

Các hợp chất phát quang tự nhiên đươc gọi là sự phát huỳnh quang tự phát Nhiều hợpchất không phát huỳnh quang có thể được chuyển hóa hóa học thành các chất phát huỳnhquang hóa học.nếu các e của một hợp chất được tự do hơn (ví dụ bằng cách thay thế O,Nhoặc S vào cấu trúc) khả năng phát huỳnh quang sẽ tăng lên Tuy nhiên một số nhóm có

thể có xu hướng định xứ các điện tử và do đó làm giảm độ huỳnh quang.từ những điềutrên có thể thấy rằng bước song hấp thụ và bước song phát xạ của mỗi hợp chất sẽ khácnhau Có nhiều hợp chất hấp thụ năng lượng vpứi bứơc sóng như nhau,một số chất phátquang tại cùng một bước sóng sự kết hợp của hai bước sóngkhá đặc trưng cho một hợpchất, do đó phép đo huỳnh quang có thể được dùng trong phân tích định tính Nếu có sựnghi ngờ về sự có mặt của một hợp chất phát quang, tiếp tục đo bước sóng lân quang, sự

xê dịch bước sóng huỳnh quang bởi PH, hiệu suất lượng tử, thời gian phát quang và dữliệu phân cưch hóa sẽ hoàn chỉnh sự nghiên cứu này

Tính đặc thù của phép đo huỳnh quang là đơn giản hóa và làm tăng độ tin cậy của quátrình phân tíchvì hợp chất thường được đo trực tiếp mà không phải chiết tách trước.không giống như quang phổ hấp thụ mà ở đó các hợp chất khác nhau co khả năng hấp thụcùng một bước sóng kích thích khác Với việc thay đổi bước sóng kích thích cực đại hoặcthay đổi PH, có thể làm giảm thậm chí đến mức tối thiểu tính chất đó

Phép đo huỳnh quang cũng có thể được dùng trong phân tich dịnh lượng vì cường độhuỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của hợp chất phát quang Tuy nhiên mối liên quantrực tiếp này chỉ đúng với dung dịch rất loãng vì ánh sáng phát ra từ những chất phátquang đều phải di qua dung dịch trước khi đến máy đo quang vì thế một lượng ánh sáng

sẽ bị hấp thụ bởi các phân tử khác trong dung dịch Nồng độ càng cao thì lượng ánh sángphát xạ bị hấp thụ càng lớn, cho đến một điểm nhất định khi mà sự tăng tiến tới bão hòa

và cường độ huỳnh quang cũng sẽ bắt đầu giảm dần (vì lí do này mà đường chuẩn nhưvậy thường được dùng trong các thí nghiệm đo huỳnh quang ) Do đó một giá trị củacường độ huỳnh quang có thể sẽ tương ứng với hai giá trị nồng độ của chất phát quang

Chất tan có ảnh hưởng đến tính chất phát huỳnh quang của một hợp chất những chất tankhác nhau có thể làm tăng hoặc giảm cường độ phát quang Cũng như vậy hằng số điệnmôi thể hiện mức độ phát quang tự do của các điện tử л và do đó thể hiện sự thay đổi

bước sóng cực đại huỳnh quang Dung dịch đệm có xu hướng gây ảnh hưởng dập tắt bướcsóng của một số chất và ảnh hưởng này tăng khi dung dịch đệm tăng lên.

Cường độ phát huỳnh quang của một hợp chất dễ bị ion hóa sẽ thay đổi theo trạng thái ionhóa mà quá trình ion hóa này lại phụ thuộc độ PH Nhiều hợp chất sinh học có khả năngphát huỳnh quang tự nhiên hoặc pháy huỳnh quang hóa học dễ bị ion hóa, cường độ pháthuỳnh quang của những chất này phụ thuộc vào PH Một số hợp chất bị ion hóa bởi ánhsáng và do đó phát huỳnh quang

Cường độ huỳnh quang có xu hướng giảm khi nhiệt độ tăng Nhiệt độ càng cao thì tốc độchuyển động của các phân tử trong dung dịch càng tăng Do đó năng lượng hấp thụchuyển thành nhiệt chứ không phải là huỳnh quang

Với một số chất không bền trong dung dịch ,tốc độ phân hủy quang phụ thuộc vào cường

độ ánh sáng Phần lớn các chất phát huỳnh quang phân hủy thành các chất không pháthuỳnh quang Tuy nhiên một số phân hủy thành chất có độ huỳnh quang thậm chí còn caohơn chất ban đầu

Phần lớn những máy đo huỳnh quang có một khe đóng mở được ở ghiữa nguồn sáng vàmẫu thí nghiệm, khe này được mở ngay trước khi đo để giảm tối thiểu sự phân hủy quang

Sự dập tắt xảy ra khi sự phat huỳnh quang của một chất bị giảm bởi một chất khác Có hailoại dập tắt: dập tắt ảnh hưởng màng lọc và dập tắt thật ảnh hưởng màng lọc xảy ra khimàng lọc hấp thụ ánh sáng kích thích hoặc ánh sáng phát xạ còn sự dập tắt thật thì xảy rakhi yếu tố gây tắt làm giảm năng lượng của phát quang.làm cho năng lượng hấp thụ biếnthành dạng năng lượng khác chứ không phải thành dạng năng lượng huỳnh quang.sự dậptắt xảy ra trong trường hợp chất phát quang chuyển hóa thành chất không phát quang Cóthể phân tích các yếu tố dập tắt thong qua sự biến mất một hợp chất phát quang trongdung dịch Ví dụ như biến mất của phức chất borat-benzoin trong phổ phát quang bởi oxi

Đóng góp quan trọng nhất của phương pháp đo quang phổ huỳnh quang là tính đặc thù và

độ nhạy tính đặc thù được miêu tả ở trên ,còn độ nhạy thì thường gấp vài nghìn lần so vớiphương pháp quang phổ hấp thụ

Trong phương pháp đo phổ huỳnh quang ,bước sóng của ánh sáng phát xạ dài hơn bướcsóng của ánh sang kích thích Vì vậy, một máy đơn sắc dược dung để ngăn phần lopứnánh sang kích thích đến máy ghi phổ mà chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang đi qua,chonên phép đo huỳnh quang được tiến hành trong điều kiện cường độ ánh sang thấp trongcác kĩ thuật hấp thụ độ nhạy cảm của mức hấp thụ thấp nhất phụ thuộc vào tính chính xác,

do đó có thể so sánh hai cường độ ánh sáng tương tự nhau

Có hai ưu điểm trong việc sử dụng đo huỳnh quang so với kĩ thuật hấp thụ là:

 Chỉ cần đo một lần chứ không cần đo hai lần như trong kĩ thuật hấp thụ

 Kết quả đưa ra từ máy đo huỳnh quang tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ chứ khôngphải là tỉ lệ nghịch với logarit nồng độ

Dựa vào ưu điểm trên mà người ta dung phương pháp huỳnh quang để xác định hàmlượng vitamin B2

b) Nguyên tắc:

Trong ngũ cốc riboflavin (latoflavin,vitamin G, vitamin B2) là chất có màu vàng-xanh lácây được chỉ định bằng phương pháp phân tích huỳnh quang riboflavin có nhiều trong tếbào động vật và thực vật nó bền trong muối khoáng và phần lớn các tác nhân oxihóa,nhưng lại không bền trong dung dịch kiềm.nó rất nhạy cảm với tia khả kiến và tia tửngoại nên các thao tác được thực hiện trong ánh sáng dịu hoặc trong các dụng cụ thínghiệm thủy tinh có độ quang hóa thấp

Trong các tế bào sống, riboflavin thường kết hợp với axit photphoric hoặc cả với axitadenylic (FMN hoặc FAD) Cả 2 đều có thể kết hợp một số protein đặc thù để hình thànhcác enzyme oxi hóa Trong một số sản phẩm ( sữa), riboflavin tồn tại dưới dạng tự do cóthể thẩm tách cũng như dạng coenzyme.

Trong phần lớn các quy trình riboflavin, cần thiết phải xử lý các sản phẩm tự nhiên vớiaxit hoặc enzyme để thu được giá trị tối đa Bước xử lý này giải phóng riboflavin khỏiphức chất protein và giúp cho việc tách chiết dễ dàng hơn

Riboflavin được tách chiết từ ngũ cốc và phân tích bằng máy quang phổ quét tự vi Dùngmáy quang phổ huỳnh quang quét có điều khiển để điều chỉnh sự phát huỳnh quang củariboflavin khi có mặt những chất gây cản trở, những chất này theo lý thuyết có ảnh hưởngđến các chất chuẩn và mẫu thí nghiệm Do đó cường độ của sự phát huỳnh quang tỷ lệ vớinồng độ của riboflavin trong dung dịch loãng và nồng độ này được đo dựa vào sự chênhlệch độ huỳnh quang trước và sau sự khử Natritiosunfit (Na2S2O4 )

1 giờ, cứ 5 phút lại lắc một lần kiểm tra mức nước mỗi lần lắc bình, không đểnước cạn

 Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và cho vào cốc 100 ml.dùng máy đo PH chỉnhđến 6.0 (bằng dung dịch NaOH 0.5M)

Chú ý: Cho NaOH từ từ dể tránh những chổ có PH cao sẽ dẫn đến mât riboflavin

 Ngay lập tức thêm HCl 1M để giảm PH đến 4.5.Li tâm bằng ống li tâm thủy tinh

100 ml ở 2000 v/phút (rpm) trong 10 phút

 Pha loãng dịch lọc đến 250 ml với nước cất trong bình định mức

- Quá trình axit hóa và oxi hóa của dịch chiết

 Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 10ml dịch chiết và 1 ml nước.trộn đều bằngmáy trộn

 Lấy 2 ống nghiệm khác, cho vào mỗi óng 10 ml dịch chiết và 1ml dung dịch chuẩnriboflavin (0.5 microgam/ml) và trộn đều

 Cho 1 ml axit axetic đặc vào cả 4 ống nghiệm và để 2 phút

 Cho thêm 0.5 ml dung dịch KMnO4 3%vào mỗi ống, trộn đều và để 2 phút

 Cho 0.5 ml H2O2 3% vào mỗi ống và trộn đều màu đỏ sẽ biến mất trong vong 10giây

- Đo độ huỳnh quang của dịch chiết

 Để đo độ huỳnh quang của riboflavin, bước song phát xạ và bước sóng kích thíchphải được xác định bằng máy đo quang phổ quét (scanning spectrophotometer)