CÁC PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH dư LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY sản

Bài trình bày về "CÁC PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH dư LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY sản"

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC  TIỂU LUẬN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ Đề tài: CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN GVHD: TS. Huỳnh Khánh Duy HV: Nguyễn Thị Bích Duyên MSHV: 13050181 Lớp: Cao học 2013 TP. Hồ Chí Minh - 2013 Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  i MỤC LỤC MỤC LỤC i MỞ ĐẦU v Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL 1 1.1 Tính chất hóa lí 2 1.2 Nguồn gốc: 2 1.3 Phân bố 2 1.4 Cơ chế kháng khuẩn 3 1.5 Tác dụng và tác hại: 3 1.5.1 Tác dụng 3 1.5.2 Tác hại 3 1.6 Tiêu chuẩn 4 Chƣơng 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CAP TRONG THỦY SẢN 5 2.1. Tổng quan về sự phát triển của những phƣơng pháp phân tích lƣợng dƣ CAP trong thủy sản 6 2.2 Sắc kí lỏng (LC) 7 2.2.1 LC/APCI/MS [3] 7 2.2.1.1Chuẩn bị mấu 7 2.2.1.2 Cài đặt thiết bị 7 2.2.1.3 Kết quả 8 2.2.2 LC/MS/MS [7] 8 2.2.2.1Thiết bị: 8 2.2.2.2 Điều kiện phân tích: 8 2.2.2.3 Kết quả: 9 2.2.3 LC/MS/MS ESI (-) [2] 10 2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu 10 2.2.3.2 Điều kiện thiết bị 11 2.2.3.3 Kết quả: 12 2.3 Sắc kí khí (GC) 15 2.3.1 GC/MS/MS [1] 16 Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  ii 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu 16 2.3.1.2 Thông số 17 2.3.1.3 Kết quả 18 2.4. Phƣơng pháp Kít Elisa [4] : 19 2.4.1 Tóm tắt quy trình 19 2.4.2 Kết quả: 20 2.4.3 Kết luận 24 2.4.4 Ƣu và nhƣợc điểm 24 KẾT LUẬN 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  iii Danh mục hình ảnh Hình 1. 1: Cấu trúc phân tử CAP 2 Hình 2. 1: Kết quả phân tích CAP 8 Hình 2. 2: Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb) 9 Hình 2. 3: Phổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP 10 Hình 2. 4: Phân tích CAP (5 ng/mL) 12 Hình 2. 5: Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn chiết của CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157). 13 Hình 2. 6: Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL. 14 Hình 2. 7: Đường cong hiệu chuẩn chiết xuất tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0.1 đến 200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R 2 = 0.9997 14 Hình 2. 8: Quy trình chuẩn bị mẫu 16 Hình 2. 9: Nguyên tắc phân mảnh của CAP-TMS ether trong chế độ NCI: (1) m/z 304, (2) m/z 322; (3) m/z 358; (4) m/z 394; và (5) m/z 430 18 Hình 2. 10: Xác định CAP 18 Danh mục bảng biểu Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP 4 Bảng 2. 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong thủy sản 6 Bảng 2. 2: Thông số GC cho việc phân tích CAP bằng GC-MS 2 17 Bảng 2. 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC-MS 2 17 Bảng 2. 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu 19 Bảng 2. 5: Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỉ lệ dương giả 20 Biểu đồ 2. 1: Mẫu tôm 21 Biểu đồ 2. 2: Cá fillet 22 Biểu đồ 2. 3: Mẫu nhuyễn thể 22 Biểu đồ 2. 4: Mẫu ghẹ, cua 22 Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  iv Biểu đồ 2. 5: Mẫu thủy sản tẩm bột 23 Biểu đồ 2. 6: Mẫu chả giò, há cảo 23 Biểu đồ 2. 7: Mẫu đồ khô 23 Ký hiệu ACPI: atmospheric pressure chemical ionization ECD: đầu dò cộng kết điện tử ESI: ion electronspray ESI (-): negative ion electronspray GC: sắc kí khí LC: sắc kí lỏng LOD: giới hạn phát hiện MS: khối phổ Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  v MỞ ĐẦU Chloramphenicol (CAP) có đặc tính kháng khuẩn nên thƣờng đƣợc sử dụng để chữa bệnh trong tôm và đƣợc sử dụng trực tiếp để bảo quản nguyên liệu. Tuy nhiên, việc sử dụng CAP không đúng cách gây ra hiện tƣợng kháng thuốc và tích tụ trong thủy sản gây nên những nguy hiểm cho sức khỏe con ngƣời. Hiện nay, ở Việt Nam đã có nhiều loài thủy hải sản đã bị cảnh báo và cấm xuất khẩu do sử dụng CAP quá liều lƣợng. Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại cho ngƣời tiêu dùng. Trong tiểu luận này, em xin trình bày về “Những phƣơng pháp xác định hàm lƣợng Chlorophenicol trong thủy sản” Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  2 1.1 Tính chất hóa lí CAP có tên khoa học là: 2,2-dicholoro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1- (hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl)ethyl] acetamide. Hình 1.1: Cấu trúc phân tử CAP Công thức phân tử: C 11 H 12 Cl 2 N 2 O 5 CAP là chất độc màu trắng hoặc có ánh vàng với tinh thể hình kim hoặc phiến dài, không mùi, vị rất đắng. Tính tan: tan tốt trong những dung môi phân cực nhƣ cồn 96%, propylen gylocol, rất dễ tan trong aceton và ethylacetat, khó tan trong nƣớc. Độ bền: dung dịch CAP bền vững trong môi trƣờng hơi acid hay trung tính, bền vững với nhiệt độ (chịu nhiệt đến 100 0 C) 1.2 Nguồn gốc: Năm 1947 Burlcholder đã phát hiện ra CAP từ môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn có tên là Streptomyces Veneduela. Chỉ hai năm sau ngƣời ta đã tổng hợp đƣợc kháng sinh này. Dƣới tác động của của quá trình chuyển hóa, CAP có thể chuyển hóa thành dạng D-threo-2-amino-(p-nitrophenyl)-1,3-propanediol và dạng D-glucuronide. Gần 90% lƣợng CAP sẽ bài tiết bằng đƣờng niệu dƣới dạng chuyển hóa, 15% bài tiết dƣới dạng ban đầu. 1.3 Phân bố CAP đƣợc phân bố rộng khắp trong cơ thể từ tim, gan, phổi thận, lá lách, huyết thanh, huyết tƣơng đến dịch màng phổi, dịch cổ trƣớng, tinh dịch, nƣớc bọt, nƣớc tiểu. Nó có khả năng thẩm thấu nhanh qua dạ dày và phân tán nhanh trong cơ thể. CAP cũng rất dễ hấp thụ vào cơ thể nên khi dùng CAP chữa bện hoăc thêm vào thức ăn gia súc sẽ tồn dƣ trong thịt, sữa, trứng. Khi thải vào môi trƣờng, CAP hiện diện dƣới dạng thể khí là chủ yếu. CAP phát tán trong không khí chủ yếu bởi lắng khô, bám trên các lớp trầm tích và chất lắng sinh học sống trong nƣớc. Khả năng thay đổi của CAP trong đất cao nhƣng nó không bốc hơi, kể cá đất khô lẫn đất ẩm. Dƣới tác động phân giải của vi sinh vật, Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  3 CAP có thể bị phân giải trong đất và nƣớc. CAP cũng bị phân giải bởi các vi sinh vật đƣờng ruột theo đƣờng phân hủy thành gốc amine. Sự hấp thu và bài tiết: CAP đƣợc hấp thu qua hệ tiêu hóa, và đƣợc đƣợc bài tiết chủ yếu qua thận. 1.4 Cơ chế kháng khuẩn CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của Ribosom ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp đƣợc protein dẫn đến yếu đi và chết. Trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S nên sẽ bị ảnh hƣởng. Điều này lý giải độc tính cao của CAP. 1.5 Tác dụng và tác hại: 1.5.1 Tác dụng CAP là kháng sinh có hoạt phổ rộng, tác dụng lên phần lớn các vi khuẩn và một số loại virut. CAP có nhiều khả năng kháng khuẩn hơn Peniciline và Steptomycine, diệt đƣợc nhiều loai vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm, xoắn khuẩn Ricketsia và với cả những vi khuẩn đã kháng Peniciline và Streptomycine. Ở ngƣời, CAP đƣợc dùng để chữa thƣơng hàn, viêm não, ít đƣợc dùng cho các trƣờng hợp khác do độc tính cao. Ngoài ra, CAP còn đƣợc bổ sung vào thuốc mỡ bôi mắt nhằm điều trị bệnh nhiễm trùng mắt nhƣ viêm kết mạc, viêm giác mạc hoặc có trong thành phần thuốc mỡ bôi cục bộ để điều trị vết thƣơng ngoài da và tai. Đôi khi CAP đƣợc điều chế ở dạng viên uống hoặc có thể tiêm vào tĩnh mạch trị các bệnh. Trong thú y, CAP đƣợc cho vào thức ăn của gia súc để phòng bệnh và cho vào môi trƣờng sống để chữa bệnh. Tuy nhiên, do có một số hiệu ứng phụ không mong muốn nên việc ứng dụng CAP trong điều trị có xu hƣớng giảm dần. 1.5.2 Tác hại Khi sử dụng trong chăn nuôi, một phần kháng sinh chƣa đào thải sẽ tồn dƣ sang sản phẩm thực phẩm và một lƣợng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ thoát ra và lắng động vào môi trƣờng, theo thời gian có thể dẫn tới các biến đổi về hệ sinh thái. Vì CAP có thể tồn tại lâu trong thực phẩm, khi thƣờng xuyên sử dụng thực phẩm này, con ngƣời có thể gặp những nguy cơ nhƣ: hệ sinh vật cũng nhƣ quá Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên  4 trình tổng hợp vitamin ở ruột bị thay đổi làm cho các vi khuẩn gây bệnh lờn thuốc. Do đó muốn tiêu diệt đƣợc cần phải có liều kháng sinh càng ngày càng cao khiến ngƣời bị nhiễm bệnh ngày càng nặng hơn, khó chữa trị hơn. Ngoài ra, CAP đi vào cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra triệu chứng xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong (do chƣa có đủ men gan để khử CAP); suy tủy, phá hủy cấu trúc tủy xƣơng dẫn đến thiếu máu, có thể dẫn đến tử vong; có thể tƣơng tác với AND, ARN dẫn đến những sai lệch về di truyền; gây bạch cầu, giảm hồng cầu, sự thay đổi thành phần máu xảy ra nếu hàm lƣợng CAP trong máu lớn hơn 25µg/ml; gây viêm lƣỡi, miệng do thiếu vitamin B2 và PP, bồn nôn, ói, tiêu chảy. Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại cho ngƣời tiêu dùng. 1.6 Tiêu chuẩn Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP Kháng sinh Kí hiệu Giới hạn phát hiện tối thiểu EU Mỹ Nhật Chloramphenicol CAP 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb [...]... Nguyễn Thị Bích Duyên Chƣơng 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CAP TRONG THỦY SẢN 5  Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 2.1 Tổng quan về sự phát triển của những phƣơng pháp phân tích lƣợng dƣ CAP trong thủy sản Bảng 2 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong thủy sản Phƣơng pháp Thực phẩm nền LOD (µg/kg) Tham khảo LC-MS Một số loài thủy sản 0.1 Van de Riet (1992) GC-ECD... 13.418 mẫu thủy sản các loại đã qua phân tích sàn lọc bằng ELISA thì có 167 mẫu là dƣơng tính giả, chiếm 1.3% tổng số mẫu đã phân tích Điều này cho thấy, ELISA là một công cụ hữu hiệu cho việc sàn lọc các mẫu thủy sản đối với chỉ tiêu CAP Tỉ lệ dƣơng tính giả đối với nhóm sản phẩm thủy sản tẩm bột (tôm, cá, mƣc tẩm bột), chả giò – há cảo là khá cao (12.2% và 13.8%) so với các đối tƣợng mẫu thủy sản cùng... biệt thủy sản tẩm bột (từ 18.2 % còn 1.36%) và không có dƣơng giả đối với nhuyễn thể Với những kết quả nêu trên có thể đƣa ra nhận định rằng hiện tƣợng phát hiện dƣơng giả trên xét nghiệm ELISA là phổ biến đối với tất cả các loại mẫu thủy sản Tuy nhiên mức độ ảnh hƣởng của nền mẫu tới kết quả của phép thử ELISA là khác nhau giữa các loại thủy sản khác nhau Ảnh hƣởng của nền mẫu đối với đối tƣợng thủy sản. .. có trong mẫu phân tích có ảnh hƣởng đáng kể đến độ chính xác của xét nghiệm ELISA Hiện tƣợng dƣơng tính giả là do phản ứng không đặc hiệu của kháng thể với các chất nền trong dịch chiết Trong trƣờng hợp này có thể rút ra nhận xét rằng tinh bột có trong mẫu là tác nhân chính dẫn đến phản ứng không đặc hiệu và gây ra dƣơng tính giả Bảng 2 5: Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỉ lệ dư ng... đối với thủy sản khô cũng khá cao (18.2%), đặc biệt thƣờng có hiện tƣợng tạo nhũ trong giai đoạn làm sạch dịch chiết bằng hexan Hiện 20  Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên tƣợng này có lẽ do ảnh hƣởng của các chất phụ gia thêm vào để bảo quản hàng thủy sản khô Các sản phẩm dạng mắm gây ra một tỉ lệ dƣơng tính giả rất cao (43.3%), cho thấy cần phải có quy trình xử lý mẫu chuyên biệt cho các đối... LOD và LOD tƣơng ứng là 0.003 µg/kg và 0.01 µg/kg Impens và những cộng sự đã mô tả phƣơng pháp sàn lọc bằng ELISA và xác định dƣ lƣợng CAP bằng GC-MS/MS và LC-MS/MS cả hai kĩ thuật đều cho LOD là 0.1 µg/kg Ngày nay, GC-MS và LC-MS/MS là kĩ thuật đáng tin cậy nhất để xác định dƣ lƣợng CAP trong thủy sản nói riêng và trong mô động vật nói chung 6  Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 2.2 Sắc kí lỏng... và phổ biến nhất trong phân tích lƣợng dƣ CAP Sự kết hợp này của sắc kí lỏng và khối phổ (LC-MS) có thể định tính và định lƣợng những hợp chất phân cực không bay hơi (nhƣ CAP) mà không cần đồng phân hóa Neuhaus và những cộng sự đã mô tả phƣơng pháp LC-MS/MS với LOD 0.08 µg/kg và LOQ 0.3 µg/kg trong tôm Mottier và những cộng sự đã phát triển phƣơng pháp dùng LC(ESI)-MS/MS cho thủy sản với giá trị LOD... Điện thế ion hóa: 4200V Nhiệt độ ống mao quản: 5000C 2.2.2.3 Kết quả: * Định lượng CAP dựa trên phân mảnh ion: CAP đƣợc xác nhận dựa trên phân ion phân tử m/z=321; hai ion xác nhận m/z = 151,9 và m/z=256,9; và chúng đƣợc định lƣợng dựa trên m/z = 151,9  Đường chuẩn định lượng CAP Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên 6 điểm chuẩn với các nồng độ chuẩn 0.1 ppb; 0.2 ppb; 0.3 ppb; 0.4 ppb; 0.5 ppb; 1 ppb Hình... sản khô, các loại thực phẩm dạng tẩm bột, phối chế (chả giò, há cảo…) là rất đáng kể Tuy nhiên ở hàm lƣợng phát hiện là > 0.3ppb tỉ lệ này là chấp nhận đƣợc cho tất cả các loại nền mẫu khác nhau (ngoại trừ mắm) * So sánh sự tƣơng đồng kết quả phân tích giữa ELISA và LC-MS/MS Kết quả thực nghiệm trên các mẫu thủy sản nhiễm CAP của ELISA và LCMS/MS đƣợc trình bày trong các biểu đồ từ 2.1-2.7 Các giá trị... 2011 [7] T.D Nguyen et al Ealuation of Elimination of Chloramphenicol in Shrimp (Peanaeus monodon) under Experimental Coditions Using LC/MS/MS [8] A.D Nguyen et al Đánh giá kết quả thử nghiệm dư lương Chloramphenicol trong thủy sản bằng Kít Elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC-MS/MS [9] Wongtavatchai et al “Who Food Additives series: 53, Chloramphenicol [Online] Dec.11, 2013, http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v53je03.htm . Tiêu chuẩn 4 Chƣơng 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CAP TRONG THỦY SẢN 5 2.1. Tổng quan về sự phát triển của những phƣơng pháp phân tích lƣợng dƣ CAP trong thủy sản 6 2.2 Sắc kí lỏng. việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại cho ngƣời tiêu dùng. Trong tiểu luận này, em xin trình bày về “Những phƣơng pháp xác định hàm lƣợng Chlorophenicol trong thủy. CAP trong thủy sản Bảng 2. 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong thủy sản Phƣơng pháp Thực phẩm nền LOD (µg/kg) Tham khảo LC-MS Một số loài thủy sản 0.1