CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HỢP CHẤT HỌ NITROFURAN TRONG MẬT ONG

Bài trình bày về "CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HỢP CHẤT HỌ NITROFURAN TRONG MẬT ONG"

KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

MÔN: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC -1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN -2

1.1 Các định nghĩa -2

1.2 Ảnh hưởng đến sức khoẻ -3

1.3 Các tiêu chuẩn quy định đối với nitrofuran -3

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MẬT ONG -4

2.1 Phương pháp ELISA -5

2.2 Phương pháp New Charm II -9

2.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS/MS với đầu dò ESI -10

2.4 Phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS/MS với đầu dò DAD (Diode Array Detector) -19

2.5 Phương pháp phân tích dòng chảy dùng chất nhạy quang FI-CL -24

TÀI LIỆU THAM KHẢO -29

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Các định nghĩa

Ong mật dễ bị nhiễm các bệnh từ vi sinh vật, vi khuẩn, vi rút, nên người ta sử dụng thuốc kháng sinh nhằm tăng năng suất, bảo vệ và điều trị bệnh cho ong mật

Dư lượng thuốc kháng sinh được phát hiện trong sản phẩm mật ong thuộc nhóm A6 [3] gồm

- Sulfonamides: Sulfathiazole, sulfamethazine, sulfamethaxazole, sulfanilamide

- Aminoglycosides: Streptomycine

- Tetracyclines: Oxytetracycline, Chlortetracycline

- Amphenicols: Chloramphenicol

Thuốc kháng sinh được sử dụng trong quá trình nuôi ong

Beta-lactams (penicilins) và macrolides (tylosine, erythromycin)

e) Thuốc kháng sinh họ nitrofuran trong mật ong

Theo tiêu chuẩn EU năm 2002-2003 [4b] thì nhóm chất thuộc họ nitrofuran được phát hiện trong mật ong gồm

- Nitrofurans gốc: furazolidone (FZD), nitrofurazone, furaltadone, and nitrofurantoin

- Nitrofuran chuyển hoá: nitrofurazone (SEM) (1.6 μg/kg - ppb), furazolidone (AOZ), g/kg - ppb), furazolidone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), semicarbazide (SC), and 1-aminohydantoin (AH)

- Nitroimidazoles: metronidazole, ronidazole, dimetridazole…

1.2 Ảnh hưởng đến sức khoẻ

Họ nitrofuran có tác dụng ngăn ngừa nhiễm trùng đường tiết niệu đối với người Tuy nhiên nhóm chất nitrofuran lại gây tác hại cho sức khỏe con người, đặc biệt là gây ung thư và đột biến ở người [4]

Các tác dụng phụ phổ biến nhất với nitrofurantoin là buồn nôn, nôn, tiêu chảy Phản ứng ít gặp hơn bao gồm sốt , ớn lạnh, và khác nhau phản ứng Nó cũng có thể gây xơ hóa phổi và viêm gan tự miễn dịch Tất cả những tác dụng phụ thường gặp hơn ở người lớn tuổi Nhiều người cho biết ngứa ran và tê ở cánh tay và chân chỉ sau một vàingày sử dụng và ngứa ran và tê chỉ trong vài tuần hoặc thậm chí vài tháng

Ngoài ra còn có các báo cáo về trường hợp nghiêm trọng và gây tử vong của suy gan

và phổi

Trẻ sơ sinh (trẻ sơ sinh đến tuổi của một tháng) có hệ thống enzyme chưa trưởng thànhtrong các tế bào máu đỏ (glutathione không ổn định) và nitrofurantoin do đó không được sử dụng vì có thể gây thiếu máu tan máu Đối với cùng một lý do, nitrofurantoin không nên cho phụ nữ mang thai sau 38 tuần của thai kỳ, hoặc những người sắp sinh con

Nitrofurantoin chống chỉ định ở bệnh nhân có chức năng thận giảm (CrCl <

60ml/phút) do tích tụ và mức độ trong đường tiết niệu thấp hơn trong gan [2]

1.3 Các tiêu chuẩn quy định đối với nitrofuran

Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi trong đó có nitrofuran [4]

Theo tiêu chuẩn EU thì không có giới hạn cao nhất MRLs (Maximum Residue Limits) thuốc kháng sinh sử dụng cho ong mật, có nghĩa là không cho phép sử dụng kháng sinh đối với ong mật MRLs tạm thời đối với các chất thuộc họ nitrofuran là 1 ppb [1]

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH

NHÓM NITROFURAN TRONG MẬT ONG

Các phương pháp xác định nitrofuran và chất chuyển hoá trong mật ong

- Định tính, bán định lượng: Charm II Test, ELISA [3]

- Định lượng: HPLC, LC/MS [9]

Trong đó, phương pháp định lượng nitrofuran trong mật ong gồm: GC/MS/MS (Sánchez-Brunete, Albero, Miguel, & Tadeo, 2005), LC/MS (Tribalat, Paisse,

Dessalces, Grenier-Loustalot, 2006), LC-ESI/MS/MS Phương pháp xác định

nitrofuran trong thức ăn cho ong mật: HPLC/UV, LC/MS (McCracken & Kennedy, 1997), LC/DAD (Barbosa et al., 2007), CL/FI

Xét nghiệm miễn dịch (immunoassays) có độ nhạy cao và cho phép định lượng dẫn xuất của các chất chuyển hoá nitrofuran mà không cần những bước tinh chế phức tạp.

2.1.3 Bộ Kit Immuno nitrofuran ELISA [5]

Bộ Kit Immuno Nitrofuran (AOZ) ELISA là dụng cụ thử nghiệm theo phương pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh, dùng để phát hiện bán định lượng nitrofuran (AOZ) trongmẫu thủy sản, gà, mật ong

Thời gian ủ nhiệt: 30 phút +20phút

Thời gian phân tích: 1 giờ

- Dịch hãm (13 ml)

2.1.3.2 Thiết bị và dụng cụ hoá chất

- Máy đọc ELIA có bước sóng: 450nm

- Micropipette đa kênh 50 - 200 µL

- Micropipette đơn kênh 50, 100 and 200 µL

- Máy trộn mẫu, ống đong, ống ly tâm, máy ly tâm

- Hóa chất: Ethyl acetate, Hexane, nước cất

2.1.3.3 Chuẩn bị dung dịch thử

- Dung dịch rửa/chiết: pha loãng 10 lần dung dịch rửa với nước cất (1 ml + 9 ml)

- Dung dịch đệm phân tích: pha loãng 10 lần dung dịch với nước cất (1 ml + 9 ml)

- Pha dung dịch cộng hợp Enzyme với dung dịch đệm rửa/chiết (30 L + 12 ml)Đem tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng (20-25°C) trước khi sử dụng

2.1.3.4 Chuẩn bị mẫu: Mật ong

- Hút 1 ml mật ong cho vào ống ly tâm

- Thêm 4 ml nước cất + 0,5 ml dd HCl 1M và 10 ml hexan lắc trong 1 phút

- Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000v/p

- Làm lạnh ống ly tâm 30 phút ở nhiệt độ -80°C

- Lấy lớp bên dưới làm nóng chảy ở nhiệt độ 50°C trong 5 phút bằng nồi water bath

- Thêm 50 L thuốc thử gốc và lắc 1 phút

- Để ống ly qua đêm (khoảng 16 giờ) trong tủ sấy ở nhiệt độ 37°C

- Thêm 5 ml dd đệm phân tích , 0.5 ml dd NaOH 1M và 5 ml ethyl acetate và lắc 1 phút

- Ly tâm tốc độ 3000v/p thời gian 10 phút

- Dùng pipette hút chính xác 2 ml trên bề mặt (ethyl acetate layer) cho vào ống tube khác Làm khô ở 50°C bằng khí Nitơ

- Hòa tan cặn với 1 ml hexan lắc đều

- Thêm 1.6 ml dung dịch chiết/rửa và trộn đều 1 phút

- Hút 50 µL dung dịch mẫu thử cho vào giếng mẫu

- Thêm 100 µL dung dịch cộng hợp vào các giếng trên (giếng mẫu, giếng chuẩn và giếng đối chứng âm)

- Thêm 100 µL dung dịch cơ chất vào mỗi giếng

- Giữ và lắc nhẹ các giếng trộn đều dung dịch

- Để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng (25±2°C)

- Thêm 100 µL dung dịch dừng màu vào mỗi giếng, lắc nhẹ

- Đọc kết quả trên máy đo màu (máy đọc ELISA) trong vòng 5 phút

2.1.3.6 Kết quả

- Màu đậm = ít Nitrofuran (AOZ)

- Màu nhạt = nhiều Nitrofuran (AOZ)

- So sánh màu hoặc mật độ quang của các giếng mẫu với màu hoặc mật độ quang của các giếng đối chứng âm và dương Từ đó xác định được mức độ nhiễm Nitrofuran (AMOZ) trong mẫu

- Hoặc chính xác hơn ta vẽ đồ thị đường chuẩn của Nitrofuran (AOZ) và dựa vào đó định lượng mức độ nhiễm của mẫu

- Tính toán theo công thức sau:

Trong đó: Ao: mật độ quang tại giếng đối chứng âm (không có Nitrofuran (AOZ))

Ax: mật độ quang tại giếng chuẩn hoặc mẫuDựng đường chuẩn của Nitrofuran (AOZ) với trục X chia độ logarith

2.1.3.7 Lưu ý

- Các thuốc thử cần ở nhiệt độ phòng khi tiến hành thí nghiệm, sau đó cần cho trở lại ngay vào tủ lạnh, không nên để bên ngoài quá lâu Riêng đối với cộng hợp enzyme chỉ nên lấy ra 1 lượng vừa đủ dùng không nên để toàn bộ cộng hợp enzyme ra nhiệt độ phòng

- Bảo quản tại 2 - 8oC Lưu ý không được để đông đá, đông đá sẽ làm ảnh hưởng hoạt tính enzyme

- Trộn đều cộng hợp một cách nhẹ nhàng, tránh tạo bọt

- Không để các hoá chất tiếp xúc ánh nắng

- Phải cẩn thận, luôn mang găng tay, áo blouse Dụng cụ sau khi dùng phải làm vệ sinhsạch sẽ, rửa bằng nước Javen 5%

- Không dùng bộ kit khi đã quá hạn

- Sử dụng pipette đúng sẽ giúp có kết quả đúng

- Khi cho cộng hợp vào giếng phải cho thật nhanh để thời gian cộng hợp ở trong giếng

là gần như bằng nhau giữa các giếng, nếu không kết quả sẽ sai lệch

2.2 Phương pháp New Charm II [6]

Năm 1986 thì phương pháp Charm II là phương pháp hàng đầu trong trong việc phân tích kháng sinh trong sữa Vì phương pháp này nhanh, đơn giản, nhạy.Ngày nay thì áp dụng trong mọi mẫu, mẫu mật ong vào 2003 [6b]

2.2.1 Ưu điểm [6]

Phương pháp Charm II Test cho kết qủa định lượng trong vòng 10-20 phút nhanh hơn

1 giờ so với các phương pháp định lượng khác trong khi giới hạn phát hiện

Furazolidone (FZD) chuyển hoá thành 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ) tương đương với phương pháp ELISA và LC/MS Thêm nữa, phương pháp ELISA, LC/MS, HPLC phải mất thời gian cô cao, lôi cuốn dung môi hữu cơ trong khi cao chiết Charm II sử dụng dung dịch đệm, không ảnh hưởng đến sức khoẻ

Hệ thống Charm II còn có thể phát hiện các chất beta-lactams, sulfonamides,

tetracyclines, aminoglycosides, macrolides, amphenicols/chloramphenicol

Năm 2007, định lượng AOZ bằng Charm II cho độ nhạy 0.3 ppb, nồng độ kháng sinh trong mật ong khoảng g/kg hoặc ppb

2.2.2 Phương pháp Charm II Test

- Cơ chế hoạt động: Charm II sử dụng những tác nhân cần thiết gắn nguyên tử đánh dấu H3 và C14 vào trong mẫu thí nghiệm Mẫu thuốc có nồng độ cao dư lượng

nitrofuran sẽ cho kết quả âm và mẫu có nồng độ thấp cho kết quả dương

- Chuẩn bị mẫu: Mật ong được hoà tan 1 phần trong 3 phần đệm MSU và pH khoảng 7.5 với đệm M2

Cao mật ong được thêm liên tục thuốc thử đã hoạt hoá và sẽ cạnh tranh với mẫu thí nghiệm với nhiệt độ ủ khác nhau, rất nhạy trong định tính thuốc

Sau khi phản ứng hết đem ly tâm, nếu có kết tủa thì nguyên tử đánh dấu không tạo liênkết với mẫu mà tách thành phức gắn liên kết đồng vị đánh dấu Viên tròn (phức đồng

vị đánh dấu) được đem phân tích trong máy bắn tia lửa sau 1 phút cho kết quả Càng ít thuốc đánh dấu trong mẫu thì kết quả càng cao

2.2.3 Kết quả

- Định tính: Kết quả diễn đạt bằng điểm chuẩn Điểm chuẩn là một số cho biết âm hay dương, nhỏ hơn 2 SD là mẫu âm, lớn hơn 2 SD là mẫu dương Mẫu lớn hơn điểm chuẩn là mẫu không có thuốc còn mẫu nhỏ hơn hoặc bằng thì dự đoán là có thuốc Điểm chuẩn dựa vào giới hạn phát hiện LOD (limit of detection)  2-3 cho kết quả chính xác hơn

- Định lượng: dùng tỉ số B/Bo sau đó kiểm tra bằng HPLC hoặc LC/MS

B: cpm của mẫu thử

Bo: cpm của mẫu trắng, không có dư lượng nitrofuran

2.3 Phương pháp sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ LC/MS/MS với đầu dò ESI [7]

Năm 2007, Mayda I Lopez và các đồng nghiệp đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS ion hoá để xác định đồng thời dư lượng nitrofuran trong mẫu mật ong

Xác định đồng thời các chất furazolidone, nitrofurazone, furaltadone, và nitrofurantoinKhoảng định lượng: 0.5-2 ppb

3 Furazolidone, furaltadone, nitrofurazone, và nitrofurantoin mua từ Sigma (St Louis, MO)

- Dung môi methanol, hexane, và ethyl acetate loại HPLC mua từ Burdick & Jackson (Muskegon, MI)

- Thuốc thử loại ACS CH3COONH4, axit KH2PO4 và NaOH mua từ Sigma-Aldrich

- HCl đặc (loại thuốc thử ACS) and NaCl (loại thuốc thử USP) từ Fisher Scientific Co.(Pittsburgh, PA)

- Nước khử ion chưng cất từ hệ thống nước Milli-Q-Plus

- Cột Oasis HLB SPE (60 mg, 3 ml) từ Waters Corp (Milford, MA) Với đầu lọc Teflon syringe (13 mm, 0.2 m) của hãng Gelman Sciences (Ann Habor, MI)

+ Một Micromass Quattro gồm thiết bị phân tích khối phổ phương pháp ion hoá (ESI) ion dương (Waters, Milford, MA)

- Thiết bị khác Máy cô quay dung môi TurboVap LV Rack ống nghiệm 15 ml

(Zymark, Hopkinton, MA) Máy đo pH Orion model SA520 pH-meter (Orion

Research Inc., Boston, MA) Máy siêu âm model 175D (Crest Ultrasonics Corp., Trenton, NJ)

2.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch gốc (~ 1 mg/ml) Stock Solutions

Cân khoảng 10-12 mg mỗi chất AOZ, SC, AH, và AMOZ định mức trong 10 ml dung môi 100% methanol Riêng SC dùng bình 100 ml vì SC ít tan trong MeOH Nồng độ pha chính xác từ dung dịch tinh khiết hoặc dạng muối Hỗn hợp dung dịch chuẩn cuối cùng chứa 0.200 ng/L mỗi loại AOZ, SC, AH, AMOZ trong dung môi MeOH-nước 50% từ dung dịch chuẩn trung gian gồm 2.00 ng/L trong 100% MeOH

- Dung dịch chuẩn Working Standard Solutions

Dung dịch chuẩn của dư lượng chất chuyển hoá nitrofuran 0.00500, 0.0100, 0.0200, 0.0400, 0.0800 ng/L lấy từ dung dịch gốc cuối cùng (0.200 ng/L) hoặc pha trong MeOH-nước 50%

- Dung dịch gốc nội chuẩn Internal Standard Stock Solutions

Cân khoảng 2-3mg chất nội chuẩn dạng tinh khiết hoặc dạng muối các chất AOZ-d4, SC+3, và AMOZ-d5 định mức trong 10 ml methanol 100% Hỗn hợp dung dịch làm chất nội chuẩn gồm 0.0400 ng/L mỗi chất AOZ-d4, SC+3, và AMOZ-d5 trong

MeOH-nước 50% pha từ 2.00ng/L hỗn hợp dung dịch gốc trung gian 100% MeOH Tất cả dung dịch chuẩn được ổn định trong một năm bảo quản dưới nhiệt độ < -10°C

- Mẫu chuẩn định lượng Calibration Standards

Chuẩn 5 chất chuyển hoá nitrofuran AOZ, SC, AH, AMOZ ở các nồng độ 0.250, 0.500, 1.00, 2.00, and 4.00 ng/g (với nồng độ ppb trong mật ong) thêm vào 100 L dung dịch chuẩn (0.00500, 0.0100, 0.0200, 0.0400, 0.0800 ng/L) và 50 L dung dịch nội chuẩn (tương đương1 ng/g trong mật ong) cho vào ống ly tâm polypropylene 50

ml Chuẩn độ kiểm tra mẫu mật ong nhằm làm giàu mẫu cao tăng phản ứng của dẫn xuất

Hình 1: Công thức hoá học của nitrofuran mẹ và các chất chuyển hoá

3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-3-amino-2-oxazolidinone (AMOZ),

semicarbazide (SC), and 1-aminohydantoin (AH)

2.3.3 Dư lượng nitrofuran từ tổ ong

- Đàn ong Bee Colonies.

2 đàn ong (Apis mellifera) lấy 5 khung lỗ tổ ong từ 5 tổ Đàn thứ 2 lấy 5 khung lỗ tổ ong ngẫu nhiên ở trên lỗ thấp nhất Ong chúa được giữ bằng cách đặt dụng cụ đuổi ongbên dưới giữa phần đỉnh và đáy tổ để bảo đảm không có ong con nào được ấp trên tổ Đàn ong được nuôi trong phòng thí nghiệm USDA-ARS Bee Research Laboratory ở Beltsville, MD Thí nghiệm được bắt đầu đầu tháng 5 năm 2005, suốt trong mùa bồ kếtgai đen (Robinia pseudoacacia) và tulip poplar (Lirodendroan tulipifera) làm nguồn mật hoa

- Liều lượng nitrofuran trong mật ong Dosing Nitrofurans to Bees

Furazolidine (23.2 mg), nitrofurazone (25.3 mg), furaltadone (25.8 mg), và

nitrofurantoin (25.6 mg) (mua từ Sigma-Aldrich) trộn với 159.9 g đường hạt và 80 g mật ong dẻo thành bánh giống một miếng chả hambuger nhỏ 50.02 g chả gồm hỗn hợp đường-mật ong đặt lên trên khung tổ ong của một trong số đàn ong thí nghiệm 25.04 g chả của cùng hỗn hợp đem đặt ở cùng vị trí của đàn thứ 2 Liều lượng bảo đảm

đủ lượng thuốc cho ong bệnh Mật ong dùng trong chả thuốc được thu từ đàn ong của năm trước và đã được phân tích để bảo đảm không còn thuốc

- Thu mật nhiễm bệnh Collection of Incurred Honey

Những con ong ở cả 2 đàn tiêu thụ những miếng chả trong 24h Sau 3-4 ngày, đem những miếng chả, những khung chứa mật ong dán nhãn và dự trữ trong những tổ trống

ở nhiệt độ phòng 25oC Những khung lấy đi được thay bằng những khung với lỗ tổ ongtrống Thu thêm 2 mẫu mật ong từ mỗi loài trong 1-2 tuần được 4 mẫu Mật ong được

chiết kiệt từ lỗ tổ ong bằng spatulas làm bằng thép không gỉ và đem lọc qua vải thưa

đã tiệt trùng rồi đựng trong những bình tráng bằng methanol Tuỳ thuộc loài và số ngày hút mật, ong bệnh sản xuất từ 300 ml đến >1L mật cho mỗi mẫu

- Chuẩn hoá phương pháp cho mật nhiễm bệnh Incurred Honey for Method

Validation

Mỗi mẫu mật ong bệnh lấy từ phòng thí nghiệm Bee Research Laboratory được chia nhỏ đựng trong tối ở 3 nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng, -20°C, và -80°C Những mẫu này được đem đi phân tích độ bền của nitrofuran gốc và dư lượng chất chuyển hoá nitrofuran trong mật ong bệnh ở nhiệt độ phòng Mật ong dự trữ ở -80°C làm mẫu

0 ở nhiệt độ phòng Theo định kỳ, các mẫu được lấy từ ong bệnh ở nhiệt độ phòng và trữ ở -80°C để làm chậm các phản ứng phân huỷ Sự phân mảnh nitrofuran gốc và chấtchuyển hoá dư lượng kháng sinh trong mật ong được giữ trong tổ hoặc ở nhiệt độ phòng chờ đem lọc sau khi thu thì không sử dụng Phương pháp đánh giá dùng cho mật nhiễm bệnh giữ ở -20°C Kiểm tra mật ong từ phòng thí nghiệm Bee Research Laboratory và mua mật ong từ cửa hàng tạp hoá địa phương để kiểm tra lại mẫu, chỉ ranhững điểm giống nhau và kiểm tra phương pháp trên mật ong có tính chất vật lý khác (kết tinh, sẫm màu, sạch và chứa lượng lớn lỗ tổ ong hay phấn hoa)

2.3.4 Phương pháp trích ly dư lượng chất chuyển hoá nitrofurans.

5 chất chuẩn và 12 mẫu chuẩn bị trước 2 ngày đem phân tích là thích hợp Cân mật ong đã đồng nhất hoá (2.00  0.1 g) đựng trong ống ly tâm polypropylene 15ml Sau khi cân, thêm vào 10L dung dịch chuẩn tương ứng làm giàu mẫu ở 3 nồng độ (0.500, 1.00, và 2.00 ng/g) Cũng thêm vào 100L dung dịch đem chuẩn có các chất chuyển hoá nitrofuran tương ứng từ những ống ly tâm polyethylene 50L để làm giàu 5 mẫu chuẩn định lượng (0.250, 0.500, 1.00, 2.00, và 4.00 ng/g) Kiểm soát mẫu không bệnh

và mẫu bệnh phải cùng lúc Tất cả mẫu và dung dịch chuẩn phải thêm 50L hỗn hợp nội chuẩn cho nồng độ bằng nhau là 1.00 ng/g mật ong

Sau khi thêm 5 ml NaCl 10% và mẫu và chất chuẩn đậy nắp và quay hỗn hợp cho đến khi mật ong phân huỷ hết Mẫu mật ong (không phải dung dịch chuẩn) được ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 5 phút và 4000 rpm (3400 RCF) Phần nổi lên trên dùng pipet Pasteur nạp vào cột Oasis HLB với 2 ml methanol và 2 ml nước Nước giải hấp thu vào ống ly tâm polypropylene 50 ml Dư lượng chất chuyển hoá nitrofuran đi qua cột SPE thu được nước giải hấp Những ống mẫu quay lần thứ 2 với 1 ml nước Nước rửa được lọc tiếp tục trong cột SPE và tương tự thu được nước giải mẫu

Thể tích cuối của chất chuẩn thêm 3 ml nước Milli-Q để bằng nước mẫu giải hấp Thêm vào chất chuẩn và nước giải 100 L dung dịch 2-nitrobenzaldehyde (50 mM trong methanol) rồi thêm 5 ml dung dịch HCl 0.125M, để lắc đều qua đêm trong bồn nước 37°C (~14-16 giờ)

Mẫu và chất chuẩn được làm lạnh tới nhiệt độ phòng và thêm 3 ml đệm K2HPO4 0.1M.Sau đó, điều chỉnh pH của mẫu và chất chuẩn khoảng 7.15 - 7.25 bằng cách thêm dungdịch NaOH 0.8M hoặc HCl 0.125M Thêm vào 4 muỗng cà phê NaCl hạt (~1.25 ml)

và 5 ml hexane Lắc nhẹ và ly tâm ở 4000 rpm (~ 3400 RCF) trong 10 phút ở 15oC Bỏlớp hexane trên bề mặt, lớp nước chia làm 2 với 6 ml EtOAc Mẫu và chất chuẩn được trộn, quay mạnh trong 15 giây Sau đó đem ly tâm ở 4000 rpm (~ 3400 RCF) trong 5 phút ở 15 °C, thu lớp trên EtOAc vào ống polypropylene sạch 15 ml Lớp EtOAc đượcrửa 2 lần với nước và sấy trong Turbo Vap LV ở 50 °C Để đạt độ chính xác cao (đặc biệt là NP-AMOZ) ngay khi cao khô thêm vào 2 ml methanol rửa trong thành ống Quay mạnh ống trong 10 giây và tiếp tục làm khô

Làm lại cao theo hai bước Đầu tiên, thêm 40 L methanol lắc trong 15 giây và đánh siêu âm trong 2 phút Tiếp theo thêm 160 L nước lắc trong 15 giây và lọc qua đầu lọcmẫu tự động PTFE 0.2-m cho vào lọ nhỏ 300-L

2.3.5 Phương pháp trích ly nitrofurans gốc

Sản phẩm trên tiếp tục xử lý để định lượng nitrofurans gốc có trong mẫu mật ong bệnh

đã đem định lượng chất chuyển hoá nitrofuran Sau khi qua cột SPE thu dung dịch nước giải chứa chất chuyển hoá nitrofuran, rửa cột SPE trong 1 phút với 3 ml hexane

và làm khô, sau đó nitrofurans gốc được rửa giải với 3 ml acetonitrile Sau đó đem sấy trong Turbo Vap LV để làm bay hơi acetonitrile ở 50°C; thêm 5 ml NaCl 10% và tiếp tục chiết để được phân đoạn cao ethyl acetate Tóm lại, để ngăn không cho nitrofurans gốc tạo dẫn xuất với 2-NBA phải chú ý pH Hai chất furaltadone và furazolidone được đem phân tích bởi hệ LC/MS/MS đầu dò ESI bắn phá ion dương trong khi

nitrofurazone và nitrofurantoin bắn phá ion âm

2.3.6 Phân tích định lượng

- Chạy sắc ký LC:

Pha động: NH4Ac 10 mM (A) và 100% methanol (B)

Chạy gradient trong 20 phút, tốc độ dòng 0.200 ml/phút

Thời gian 2 phút 1 phút 14 phút 1 phút 2 phút

Phương pháp isostatic gradient isostatic gradient Isostatic

Tiêm 10 L mẫu vào cột ở nhiệt độ 4 °C và nhiệt độ cột giữ ở 25 °C

Ổn định cột ít nhất 1 giờ trước khi tiêm mẫu Trong lúc này ta ổn định khí và thiết bị điện Tiêm 3 lần mẫu chuẩn để ổn định và kiểm tra thiết bị Một loạt mẫu đem chuẩn gồm: dung môi, chất chuẩn, dung môi, điều chỉnh ion âm dương, để hiệu chỉnh mẫu, dung môi, mẫu cao chiết, dung môi và chất chuẩn

Sau mỗi lần chạy, rửa cột với MeOH-nước = 75:25 trong 1 giờ, tốc độ dòng 200 ml/phút để đẩy hết NH4Ac và chất khác ra khỏi cột

- Phân tích MS/MS