Năm 2010, Pawinee Thongsrisomboon sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy dùng chất nhạy quang là phương pháp xác định nhanh chóng và nhạy các chất họ nitrofurans như furazolidone (FZD), nitrofurantoin (NFT) và nitrofurazone (NFZ) trong thức ăn của vật nuôi dựa trên chất nhạy quang KMnO4 trong môi trường axit H2SO4.
Trong thời đại mới, phương pháp phân tích dòng FI phát triển trên nhiều lĩnh vực phân tích với ưu điểm là sử dụng tác nhân và lượng mẫu ít, tiêm mẫu liên tục và tự động, không yêu cầu sắc ký đơn, tốc độ phát hiện nhanh (thường từ 0.1-10 giây). Sử dụng chất nhạy quang phổ biến KMnO4.
Phương pháp này được xem là phương pháp mới, sử dụng ít mẫu và tác nhân, ít chất thải ra môi trường.
2.5.1 Dung dịch và thuốc thử
Tất cả đều dùng dung dịch phân tích.
- Dung dịch gốc KMnO4 (10-2 M) pha bằng cách hoà tan 0.1587 g KMnO4 (Ajax, Australia) trong nước khử ion và để trong tủ lạnh trong 1 tuần.
- Dung dịch chất mang H2SO4 0.1M chuẩn bị hằng ngày từ dung dịch axit sulphuric 2M (Merck, Germany) trong nước.
- Dung dịch thuốc thử KMnO4 đã axit hoá (2.5 x 10-5 M) chuẩn bị hằng ngày trong lúc pha dung dịch gốc KMnO4 thành dung dịch chất mang.
Tất cả các dung dịch đều được khử oxi bằng cách sục N2 trước khi dùng. Hệ thống nước tinh khiết dùng pha dung dịch hệ thống cất nước cực sạch (18.2 MX, Millipore, France).
- Nitrofurans (furazolidone, nitrofurantoin, và nitrofurazone) của Sigma–Aldrich (Steinheim, Germany). Dung dịch gốc 200 mg/L của tất cả các nitrofurans pha bằng cách hoà 0.02 g mỗi nitrofuran trong 80 ml dimethylformamide (Fisher, UK) thêm tiếp ethanol (Merck, Germany) để được 100 ml.
- Dung dịch nitrofuran chụẩn chạy cột được chuẩn bị hằng ngày bằng cách hoà tan dung dịch gốc (200 mg/L) với dung dịch chất mang và tránh ánh sáng vì tính kém bền của dung dịch loãng nitrofuran dưới bức xạ UV.
- Dung dịch gốc được giữ lạnh ở 4oC trong thùng gỗ khi không dùng. 2.5.2 Lấy mẫu
Thức ăn gia cầm, heo, bò mua từ cửa hàng trong chợ Chiang Mai. 2.5.3 Thiết bị
- Hệ thống FI (hình 2) gồm bơm nhu động 2 kênh theo tỉ lệ tuỳ chọn (Minipuls 3, Gilson, France), van tiêm mẫu (Type 50, Rheodyne Inc., CA, USA) và ống nối PTFE (đường kính 0.5 mm). Tín hiệu chất nhạy quang được thu trong máy đo độ sáng dòng
chảy, máy gồm hộp chảy (flow cell) là tấm kiếng hình xoắn ốc phẳng (ống kính đường kính 1.5 mm, đường kính cuộn xoắn 25 mm) giá thẳng để đỡ ống nhân quang (PMT) (Thorn-EMI 9828SB, Electron Tubes Ltd., UK). Hiệu điện thế cung cấp cho PMT phải từ nguồn năng lượng ổn định (Thorn-EMI model PM20D, Electron Tubes Ltd., UK). Hộp chảy, PMT, và bộ phận chia áp phải chứa trong vỏ bọc kín tránh ánh sáng. Đầu dò ở đầu ra ghi tín hiệu trên PC (Pentium IV) qua USB/RS-232 giao diện cùng với đầu dò multimeter (UNI-T, UT60F, Hong Kong) cho peak cao.
Hình 2: Sơ đồ đừơng đi của chất nhạy quang. P: bơm nhu động. V: van tiêm mẫu. T: ống nối PTFE. F: hộp chảy. W: hao phí. PMT: ống nhân quang.
Vì ống bơm thay đổi tính chất theo thời gian nên ảnh hưởng đến tín hiệu phân tích, tốc độ dòng của cả hệ vì vậy cần đo đều đặn và liên tục.
- Cartridges Sep-Pack NH2 (6 ml, 1 g) mua từ Waters (Milford, USA), máy ly tâm (Centurion 1000 series, England) và máy cô quay áp suất (Eyela, Japan) để chuẩn bị mẫu cho phương pháp chiết và tinh chế.
- Phép đo sắc ký để so sánh dùng hệ HPLC của Agilent gồm bơm Agilent HPLC, dụng cụ tiêm mẫu 7725 với loop mẫu 20 µL và đầu dò DAD ở bước sóng 375 nm. Cột phân tích Hypersil 5 µm cột ODS (125 x 4.0 mm). Tất cả mẫu phải lọc qua ống tiêm đầu lọc Nylon 0.45 µm trước khi đem phân tích sắc ký (Theo Barbosa và đồng nghiệp, 2007). Pha động hệ 2 dung môi chạy gradient gồm CH3COONH4 14mM (pH = 4.6), và acetonitrile với tốc độ dòng 0.6 mL/phút.
2.5.4 Phương pháp
Dùng hệ thống FI, tiêm dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn khoảng 500 µL, tiêm bằng tay dung dịch chất mang H2SO4 0.1 M (tốc độ dòng 3.5 mL/phút), sau khi đã trộn với tác nhân KMnO4 (2.5 x 10-5M) trong dung dịch H2SO4. Ở cùng tốc độ dòng, hỗn hợp phản ứng chảy xuống với tốc độ 7.0 mL/phút đi qua hộp chảy cuộn hình xoắn ốc, và chất nhạy quang CL nồng độ cao được phát hiện bằng PMT ở 950 V. Đầu ra của PMT được ghi lại. Tín hiệu CL-FI cho chiều cao peak tương ứng dựng được đồ thị với các nồng độ khác nhau của mỗi chất.
2.5.5 Chuẩn bị mẫu
Nitrofurans được cô lập từ thức ăn vật nuôi (theo Barbosa, 2007), Cân 5.0 g thức ăn băm nhỏ bỏ trong cốc beaker polypropylene 250 ml. Sau đó thêm 20 ml dung dịch CH3COONH4 79 mM (pH 4.6) và thêm NH4OH ≥ 30% cho đến pH khoảng 8. Hỗn hợp sau đó được ổn định trong 15 phút, thêm 30 ml ethyl acetate rồi đem khuấy trong máy lắc trong 20 phút. Sau đó, chuyển hỗn hợp sang ống polypropylene và máy ly tâm trong 10 phút ở 3000 rpm. Lớp hữu cơ được thu và làm khô trong máy cô quay áp suất ở 35oC và 240 mbar, tiếp tục cô hồi lưu với 2 ml hỗn hợp acetone:methanol = 80:20 (v/v). Cao được gạn lọc qua cartridge Sep-Pack NH2 cartridge với 5 ml hỗn hợp trước acetone:methanol (80:20, v/v). Sau đó, nitrofurans tách ra với 5 ml ở phần trên. Phần tách ra được làm khô và dư lượng nitrofurans đun hồi lưu với 5 ml dung dịch chất mang H2SO4 0.1 M.
Nồng độ tương đương với dung dịch mẫu hoà với dung dịch chất mang H2SO4 0.1 M. 2.5.6 Kết quả và thảo luận
- Phương pháp FI-CL xác định dư lượng nitrofurans trong thức ăn vật nuôi dựa trên chất nhạy quang KMnO4 trong môi trường axit sulphuric. Chất nhạy quang sinh ra từ KMnO4 theo phản ứng
Mn (II) Mn (III) Mn (II)* Mn (II) + hν
Mn (II) là những ligand vững chắc để tạo phức với chất phân tích. Phức Mn (II) là sản phẩm của phản ứng oxi hoá Mn (III) dùng KMnO4 đã axit hoá. Phức Mn(II)–analyte sinh ra chuyển xuống vùng thấp hơn trong trường điện tử và phát ra photon khi trở lại trạng thái thường.
- Hệ thống FI phải được thiết kế dưới những điều kiện phản ứng khác nhau cho mỗi tín hiệu CL. Cường độ CL cao nhất khi tiêm mẫu vào dòng H2SO4 0.1M và trộn với 2.5 x 10-5M KMnO4 trước khi qua đầu dò.
- Khảo sát điều kiện thay đổi + Nồng độ axit khác nhau
+ Hiệu điện thế của ống nhân quang + Nồng độ KMnO4 + Tốc độ dòng + Thể tích mũi tiêm + Chất hoạt động bề mặt + Những chất làm nhạy Analyte H+, MnO42-
- Ứng dụng phân tích
+ Để đánh giá khả năng phân tích của phương pháp: vẽ đồ thị kiểm tra trong vùng 0.5-8 mg/L. Kiểm tra mỗi nitrofuran phân tích và độ chính xác của phương pháp bằng cách phân tích 12 mẫu 4 mg/L trong bảng 1, FZD, NFT và NFZ với lượng mẫu là 120, 123 và 117 chạy trong 1 giờ.
+ Ảnh hưởng của những chất gây nhiễu: Mỗi dung dịch chuẩn 4 mg/L nitrofuran khi tiêm mang theo các cation (Ca2+, Na+ và PO43-) và anion (Cl-) có rất nhiều trong thức ăn vật nuôi với tỉ lệ khối lượng ion khác nhau. Khoảng phân tích trong hệ FI-CL từ 10-1000 khi thêm lượng lớn chất ngoài. Nồng độ cation cao nhất giới hạn trong bảng 2.
+ Phân tích thức ăn vật nuôi: So với phương pháp HPLC-DAD trong bảng 3
2.5.7 Kết luận
- Chất KMnO4 có thể dùng làm chất nhạy quang xác định furazolidone, nitrofurantoin và nitrofurazone trong thức ănvật nuôi.
- Phương pháp không yêu cầu thiết bị tinh vi, hệ đơn giản, nhanh và mẫu cao thô, giới hạn phát hiện thấp.
Kết quả tốt hơn khi so với phương pháp HPLC. Phương pháp nay phù hợp trong phòng thí nghiệm của nhà máy sản xuất thức ăn vật nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Dr Sapna Johnson, Dr Nimisha Jadon, Antibiotic Residues in Honey, Centre for science and environment, 2010.
[1b] Kümmerer K, Henninger A, Promoting resistance by the emission of antibiotics from hospitals and households into effluents, Clin. Microbiol. Infec. V.9, p.1203– 1214, 2003.
[2] http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrofurantoin#Pharmacology http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrofuran
[3] Stefan Bogdanov, Current status of analytical methods for the detection of residues in bees products, APIACTA, V.38, p.109-197, 2003.
[4] Trần Thị Hồng, Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS, ĐH Khoa học tự nhiên, 2012.
[4b] M. Vass, K. Hruska, M. Franek, Nitrofuran antibiotics: A review on the application, prohibition and residual analysis, Veterinarni Medicina, V.53, p.469– 500, 2008.
[5] Công ty thời đại xanh www.greenage.vn
[6] Stephen Holmes, Say-Jong Law, Charm II: A Simple, Fast and Effective Way to Test for Chloramphenicol, Tetracycline and AOZ-Nitrofuran Antibiotic Residues in Honey, Charm Sciences, 2007.
[6b] Bob Salter, Charm II System - Comprehensive Residue Analysis System for Honey, Apiacta, 38, p.198-206, 2003.
[7] Mayda I. Lopez, Mark F. Feldlaufer Anthony D. Williams, Pak-sin Chu,
Determination and Confirmation of Nitrofuran Residues in Honey Using LC-MS/MS, J. Agric. Food Chem, 55, p.1103−1108, 2007.
[8] Jorge Barbosa, Sara Moura, Rita Barbosa, Fernando Ramos, Maria Irene Noronha da Silveira, Determination of nitrofurans in animal feeds by liquid chromatography- UV photodiode array detection and liquid chromatography-ionspray tandem mass spectrometry, Analytica Chimica Acta 586, p.359–365, 2007.
[9] Pawinee Thongsrisomboon, Boonsom Liawruangrath, Saisunee Liawruangrath, Sakchai Satienperakul, Determination of nitrofurans residues in animal feeds by flow injection chemiluminescence procedure, Food Chemistry 123, p.834–839, 2010.