CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hàm LƯỢNG AFLATONXIN TRONG THỰC PHẨM

Bài trình bày về "CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hàm LƯỢNG AFLATONXIN TRONG THỰC PHẨM"

TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC



PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATONXIN

TRONG THỰC PHẨM

NHẬN XÉT

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1

1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin 1

1.2 Các loài có khả năng sản sinh Aflatoxin 1

1.3 Điều kiện sản sinh độc tố Aflatoxin 1

1.3.1 Chủng sinh độc tố 1

1.3.2 Cơ chất và môi trường 1

1.4 Cấu trúc và các tính chất của Aflatoxin 1

1.4.1 cấu trúc hóa học 1

1.4.2 Tính chất vật lý 1

1.4.3 Tính chất hóa học 1

1.4.4 Sự chuyển hóa và bài tiết Aflatoxin 1

1.5 Độc tính của Aflatoxin 1

CHƯƠNG 2 : NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA AFLATOXIN 1

2.1 Cơ chế tác động của Aflatoxin 1

2.2 Ảnh hưởng của Aflatoxin lên thực vật 1

2.3 Ảnh hưởng của các Aflatoxin lên động vật 1

2.3.1 Tác dụng cấp tính 1

2.3.2 Tác dụng mãn tính 1

2.4 Ảnh hưởng của Aflatoxin lên con người 1

CHƯƠNG III: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH AFLATOXIN 1

3.1 Phát hiện bằng con đường lý – hóa học 1

3.1.1 Chiết xuất và tinh chế nước chiết 1

3.1.2 Tách bằng sắc ký 1

3.2 các phương pháp định lượng 1

3.2.1 Sắc ký lỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer chromatography- HPTLC) 1

3.2.2 phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( high ferformane liquid chromatorgaphy- HPLC) 1

3.3 xét nghiệm ở người 1

KẾT LUẬN 1

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

MỞ ĐẦU

Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trênlương thực và thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bản vệ sức khỏe con người và vật nuôi.Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và aspergillus paraciticus tạo ra, làđộc tố nguyên hiễm nhất và thường nhiễm trong nông sản, gây độc cho người và gia súc, nhưgây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan ( ung thư gan…), gây quái thai , gây dột biến,…Thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tựnhiện thì aflatoxin B1 được coi là nguy hiểm nhất Mặc dù sự hiện diện của aspergillus flavuskhông phải lúc nào cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưngcũng có thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin

ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao,thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thu hoạch phơisấy nông sản kém, kho chứ không đảm bảo khô ráo thoáng mát, là điều kiện thuận lợi chonấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là yêu cầu cần thiết và quan trọng Giới hạn vềmức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm Để cócái nhìn tổng quan về aflatoxin, các ảnh hưởng của độc tố này lên cơ thể con người cũng nhưcác loại động vật và các phương pháp phân tích để phát hiện và phòng tránh việc nhiễm

aflatoxin nên em đã chọn đề tài “ các phương pháp phân tích Aflatoxin trong thực phẩm”

Do kiến thức và thời gian hạn chế, các thông tin trong bài tiểu luận chủ yếu lấy từ cáctrang web nên bài tiểu luận này không tránh khỏi những sai sót, mong thầy thông cảm vàđóng góp ý kiến cho bài của em được hoàn thiện hơn

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN

1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin.

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “ bệnh gà tây” Sau đó các loại gia cầm khác nhưvịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều Qua điều tra, người ta xác định được bệnh

có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra Đến năm 1961 người ta đãtìm ra độc tố hóa học của độc chất này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus vàAspergillus parasiticus Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2.Giữa 4 loại trên thì B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộđộc nhanh nhất và phổ biến nhất

Năm 1961 các công trình nghiên cứu công nhận rằng aflatoxin tạo ra bởi nấmAspergillus flavus va có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động vật Trên động vậtthủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố aflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley

và các cộng sự

Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin Các nhà khoa học cũng

đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin

1.2 Các loài có khả năng sản sinh Aflatoxin.

Aflatoxin được tạo ra bởi hai loại nấm quen thuộc là Aspergillus flavus và Aspergillusparasiticus với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ chất, điều kiện khí hậu vàmôi trường

Một số loại nấm mốc khác cũng có khả năng sinh ra Aflatoxin với lượng rất ít như loài:penicillium puberulum Bai, các chủng loại thuộc Aspergillus như Aspergillus tamariitika,Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper…

Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Aspergillus flavusthường lẫn với nhiều loại nấm khác, đặc biệt là với penicillium rubrum stoll và khi đó có thểnhầm Aflatoxin là do penicillium sản sinh ra

Trong một số trường hợp, cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Stergmatoxistin và Avecsin

vì có cấu tạo hóa học gần giống với Aflatoxin

Aspergillus parasiticus Aspergillus flavus

1.3 Điều kiện sản sinh độc tố Aflatoxin.

Khả năng sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus rấtkhác nahu Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tốnhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường

1.3.1 Chủng sinh độc tố.

Aflatoxin được sản sinh từ hai chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khả sát đều sản sinh ra Aflatoxin,chỉ có 73% có thể sản sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh Aflatoxin ở mức độ cao nhất.Người ta đã ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng tùy theo chất từ đó đã phân lập cácchủng Aspergillus và tùy theo nguồn gốc địa lý Chẳng hạn người ta đã thấy trong số 284 mẫuphân lập từ gạo ở Hoa Kỳ có 94% số chúng có sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từlạc cũng tại nước này và chỉ có 71% với các mẫu được phân lập cũng từ lạc nhưng ở Ixraen.Ngoài ra, lượng Aflatoxin cũng thay đổi rất nhiều tùy theo chủng

Ngoài việc định lượng tổng số các Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêngphần của các Aflatoxin khác nhau đã biết Nói chung Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất cảtrong thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó rất xa là Aflatoxin B2, cònAflatoxin G2 và các Aflatoxin khác thì tỷ lệ khá thấp

Phân biệt các chủng sinh độc tố và không sinh độc tố qua những đặc điểm hình thái:chủng sinh độc tố có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả các giống cấy lâu ngày( thể bìnhhai lớp, cuống bào tử đính với vách có gai) Một chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đóqua

nhiều lần cấy truyền liên tiếp trên các môi trường tổng hợp Thế nhưng chủng độc của chúngtăng lên khi cấy truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp.

1.3.2 Cơ chất và môi trường

Cơ chất là các hạt có dầu, dặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc Lượng độc tố chứatrong lạc cao nhất Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hayphomat ô nhiễm tự nhiên thường không có hoặc có rất ít độc tố Ngược lại gần 1/3 số chủngphân lập từ các gia vị có khả năng sinh sản Aflatoxin

Ngay cả trên cùng một cơ chất khả năng sản sinh Aflatoxin của các chủng Aspergillusflavus cũng khác nhau Nguyên nhân của hiện tượng này cũng có thể do một số giống lạc cótính kháng với Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sởphát hiện trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm Aflatoxin Đây là hướng nghiêncứu của nhiều nhà khoa học sử dụng nhằm loại bỏ Aflatoxin theo một cách có lợi nhất

Sự hình thành Aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển, khốilượng sợ nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại Thời gian để sản sinhAflatoxin cực đại thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó giảm đi Lý do của sự giảmlượng Aflatoxin trong những ngày tiếp theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thânnấm mốc

Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh Aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25oC -28oC.Nếu nuôi cấy Aspergillus flavus ở 45oC thì khả năng sản sinh Aflatoxin bị hạn chế

Hàm lượng trong cơ chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành Aflatoxin

Ở lạc nhân, lượng nước từ 15-30% thì sự hình thành Aflatoxin sau 2 ngày, trền gạo cần lượngnước là 24-26% và ở ngô là 19-24% Như vậy có thể nói sự sản sinh Aflatoxin diễn ra rấtnhanh Đặc biệt là sau thu hoạch, cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gain làm khô kéodài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm Aflatoxin

Độ pH ban đầu của môi trường ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin, dù nó làbao nhiêu thì lúc nào cũng có xu hướng quy về trị số giữa 4 và 5

Nguồn carbon: người ta đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường hexoza vàomôi trường nuôi cấy lên sản lượng Aflatoxin của Aspergillus và kết luận rằng các đườngglucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp Aflatoxin

Các ion kim loại: sự có mặt của Zn, Mg hay Fe kích thích khả năng sản sinh Aflatoxin,

Co, Cr, Mn, Ca có ít hiệu lực

Các chất khác; khi Aspergillus flavus phát triển trên hạt lúa mì, lượng Aflatoxin tạo ra ởgiai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi nhũ Ngoài ra người ta còn thấy việc thêmlipid ( chiết từ mầm lúa mì bằng pentan) vào một cơ chất gồm mầm lúa mì đã loại bỏ lipid cóhiệu quả tốt đến sản sinh Aflatoxin Ảnh hưởng có lợi của các axit béo đến việc hình thànhđộc tố được nhiều người công nhận, làm cho người ta nghĩ rằng chúng có vai trò quan trọngtrong việc sinh tổng hợp các Aflatoxin, việc phân hủy sinh học của chúng đưa đến sự hìnhthành các tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp Aflatoxin Thêm

Dimetylsunfoxit (DMSO) vào môi trường nuôi cấy sẽ làm nồng độ Aflatoxin hoặc tăng lênchút ít hoặc giảm sút rất nhiều Ở đây có le4la2 một tác dộng chuyển hóa qua lại hơn là mộtphản ứng hóa học giữa DMSo với các Aflatoxin.

1.4 Cấu trúc và các tính chất của Aflatoxin.

1.4.1 cấu trúc hóa học.

Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật Hiện nay người ta đã tìm thấykhoảng 18 loại Aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất gồm 4 hợpchất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất bởi nấm Aspergillus flavus vàAspergillus parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2.bốn chất được phân biệt trên cơ sở màuphát quang của chúng B là chữ viết tắt của Blue và G là viết tắt của Green Các sắc kí lớpmỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom:metanol (98.5 :1.5) được tách bằng hệthống clorofrom:carbon tetraclorua:nước:metanol(2:2.5:1:3) đã phát hiện 2 vết huỳnh quangdưới ánh sáng tử ngoại, một vết huỳnh quang xanh tím, đó là Aflatoxin B1, một vết khác có Rfthấp hơn và huỳnh quang màu lục, đó là Aflatoxin G1, Aflatoxin G1 có cấu trúc gần giốngAflatoxin B1, nó có 2 chức lacton, còn Aflatoxin B1 chỉ có một Bằng cách khử nối đôi cáchtrong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B1 và G1 ta thu được hai sản phẩm độckhác là Aflatoxin B2 và Aflatoxin G2 So với Aflatoxin B1, độc tố của chúng đối với vịt conkém hơn từ 60 đến 100 lần, như vậy chúng sẽ không độc, nếu không có khả năng mất hidratchuyển thành Aflatoxin B1 rất độc

Aflatoxin B1, B2 trong sửa bò chuyển hóa và gọi là Aflatoxin M1 và Aflatoxin M2( M làviết tắt của milk) Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanh màu tím, Aflatoxin M2 có Rf thấp hơn

và huỳnh quang màu tím Aflatoxin M1 là hidroxi-4 Aflatoxin B1, và Aflatoxin M2 là hidroxi –

4 Aflatoxin B2

Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếptheo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

Ngoài 6 loại Aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại Aflatoxin khác,người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin.

- Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất của fenolic của Aflatoxin B1.Người ta đã phân lập được chúng trên ambeclit XAD – 2( Rohm và Haas) Trọng lượng phân

tử của nó, xác định bằng khối phổ là 2.8 Sản phẩm này là kết quả sự khử metyl của Aflatoxin

thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiên khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêuhủy Aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định.

Các Aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform, metanol

và đặc biệt ở dimetylsulfoit ( dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc ápdụng các Aflatoxin vào các động vật thực nghiệm) Tính tan của Aflatoxin trong nước daođộng từ 10 – 20 mg/l

1.4.3 Tính chất hóa học.

Sự có mặt của các vòng lacton ở phân tử Aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủyphân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biến thựcphẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng Aflatoxin của các sản phẩm, mặc dù sự cómặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả Tuy nhiên nếu xử lý kiềm

là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu

Côngthức nguyêntử

Trọn

g lượngphân tử

Điể

m nóngchảy

in M1 O7 tím AFlatox

in M2

C17H14

tím

Bảng: Tính chất hóa lý chủ yếu của các Aflatoxin

ở nhiệt độ cao ( khoảng 100oC) sự mở vòng decarboxylation xảy ra và phản ứng có thểtiến xa hơn, dẫn đến sự mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm

Khi có các axit vô cơ và bổ sung nước, Aflatoxin B1 và G1 chuyển hóa thành Aflatoxin

B2A và G2A Các sản phẩm cộng hợp tương tự của Aflatoxin B1và G1 cũng được hình thànhvới clorua axit formic thionyl, clorua axit axetic và axit thionyl trifluoroacetic

Nhiều tác nhân oxy hóa, chẳng hạn như hypochlorite natri, thuốc tím, chlorine,hydrogen peroxide, ozone và peborat natri phản ứng với aflatoxin và thay đổi các phân tửAflatoxin, một số phản ứng làm mất huỳnh quang

Sự hydro hóa Aflatoxin B1 và B2 sinh ra Aflatoxin G1 và G2 tương ứng Sự khửAflatoxin B1 bằng 3 mol hydro sinh ra tetrahydroxyaflatoxin Khử Aflatoxin B1 và B2 bằngnatriborohydride tạo ra RB1 và RB2 tương ứng hiện tượng đó là kết quả của việc mở vònglacton bởi sự khử nhóm axit và nhóm xeton ở vòng cyclopenten

1.4.4 Sự chuyển hóa và bài tiết Aflatoxin.

Allcrofl và camaghan là những người đầu tiên nhận thấy nếu cho bò sữa ăn khô lạc cónhiều Aflatoxin, thì sữa của chúng có độc với vịt con một ngày tuổi Qua phân tích người taphát hiện ra các chất độc chỉ gồm những vết Aflatoxin B1, chủ yếu là các dẫn xuất Aflatoxin

M1 và M2 Một lượng rất ít Aflatoxin đó đã được phát hiện trong các giống nuôi cấyAspergillus flavus trên lạc và trên nhiều cơ thể khác Để chắc chắn rằng các Aflatoxin Mtrong sữa là những sản phẩm chuyển hóa của Aflatoxin ăn vào, người ta cho chuột cái đangcho con bú uống Aflatoxin B1 và đã tìm thấy Aflatoxin M trong sữa Aflatoxin M1 còn đượctìm thấy trong sữa dê, mật chuột, gan chuột, phân và nước tiểu bò cái và cừu, máu, nước tiểu,mật, thận thỏ con, trong nước tiểu người ăn bơ dầu lạc có nhiễm khuẩn

Việc chuyển hóa các Aflatoxin diễn ra rất nhanh Nếu cho bò cái ăn một lượng duy nhất( 0.5 mg/kg) hỗn hợp các Aflatoxin B1: 44%, G1:44%, B2:2% và phân tích đều đặn sữa, người

ta thấy 85% lượng Aflatoxin phát hiện trong sữa và nước tiểu được bài tiết ra trong vòng 48giờ, 4 ngày sau trong sữa và 6 ngày sau trong nước tiểu, phân không phát hiện một vết bàonào nữa Trong sữa chỉ có Aflatoxin M và lượng chất này chỉ chiếm 0.35% lượng Aflatoxin