CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hàm LƯỢNG AFLATONXIN TRONG THỰC PHẨM

Bài trình bày về "CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hàm LƯỢNG AFLATONXIN TRONG THỰC PHẨM"

TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC  PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATONXIN TRONG THỰC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2014 NHẬN XÉT ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … ………………………………………………………………………… … …………………………………………………………… 4 MỞ ĐẦU Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực và thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bản vệ sức khỏe con người và vật nuôi. Độc tố aflatoxin chủ yếu do loài vi nấm Aspergillus flavus và aspergillus paraciticus tạo ra, là độc tố nguyên hiễm nhất và thường nhiễm trong nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan ( ung thư gan…), gây quái thai , gây dột biến,… Thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong. Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiện thì aflatoxin B1 được coi là nguy hiểm nhất. Mặc dù sự hiện diện của aspergillus flavus không phải lúc nào cũng gắn liền với việc tồn tại aflatoxin với hàm lượng gây độc, nhưng cũng có thể hiện nguy cơ lớn về việc có thể nhiễm aflatoxin. ở nước ta với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao, thời vụ canh tác, thu hoạch thường rơi vào mùa mưa trong khi các phương tiện thu hoạch phơi sấy nông sản kém, kho chứ không đảm bảo khô ráo thoáng mát, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là yêu cầu cần thiết và quan trọng. Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. Để có cái nhìn tổng quan về aflatoxin, các ảnh hưởng của độc tố này lên cơ thể con người cũng như các loại động vật và các phương pháp phân tích để phát hiện và phòng tránh việc nhiễm aflatoxin nên em đã chọn đề tài “ các phương pháp phân tích Aflatoxin trong thực phẩm” Do kiến thức và thời gian hạn chế, các thông tin trong bài tiểu luận chủ yếu lấy từ các trang web nên bài tiểu luận này không tránh khỏi những sai sót, mong thầy thông cảm và đóng góp ý kiến cho bài của em được hoàn thiện hơn. 5 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 1.1. Lịch sử phát hiện Aflatoxin. Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “ bệnh gà tây”. Sau đó các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều. Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961 người ta đã tìm ra độc tố hóa học của độc chất này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất. Năm 1961 các công trình nghiên cứu công nhận rằng aflatoxin tạo ra bởi nấm Aspergillus flavus va có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động vật. Trên động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố aflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley và các cộng sự. Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố aflatoxin. Các nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin. 1.2. Các loài có khả năng sản sinh Aflatoxin. Aflatoxin được tạo ra bởi hai loại nấm quen thuộc là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ chất, điều kiện khí hậu và môi trường. Một số loại nấm mốc khác cũng có khả năng sinh ra Aflatoxin với lượng rất ít như loài: penicillium puberulum Bai, các chủng loại thuộc Aspergillus như Aspergillus tamariitika, Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper… Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Aspergillus flavus thường lẫn với nhiều loại nấm khác, đặc biệt là với penicillium rubrum stoll và khi đó có thể nhầm Aflatoxin là do penicillium sản sinh ra. Trong một số trường hợp, cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Stergmatoxistin và Avecsin vì có cấu tạo hóa học gần giống với Aflatoxin. 6 Aspergillus parasiticus Aspergillus flavus 1.3. Điều kiện sản sinh độc tố Aflatoxin. Khả năng sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus rất khác nahu. Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như chủng nấm mốc, các cơ chất, các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất và môi trường. 1.3.1. Chủng sinh độc tố. Aflatoxin được sản sinh từ hai chủng nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khả sát đều sản sinh ra Aflatoxin, chỉ có 73% có thể sản sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh Aflatoxin ở mức độ cao nhất. Người ta đã ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng tùy theo chất từ đó đã phân lập các chủng Aspergillus và tùy theo nguồn gốc địa lý. Chẳng hạn người ta đã thấy trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Hoa Kỳ có 94% số chúng có sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc cũng tại nước này và chỉ có 71% với các mẫu được phân lập cũng từ lạc nhưng ở Ixraen. Ngoài ra, lượng Aflatoxin cũng thay đổi rất nhiều tùy theo chủng. Ngoài việc định lượng tổng số các Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng phần của các Aflatoxin khác nhau đã biết. Nói chung Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất cả trong thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó rất xa là Aflatoxin B2, còn Aflatoxin G2 và các Aflatoxin khác thì tỷ lệ khá thấp. Phân biệt các chủng sinh độc tố và không sinh độc tố qua những đặc điểm hình thái: chủng sinh độc tố có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả các giống cấy lâu ngày( thể bình hai lớp, cuống bào tử đính với vách có gai). Một chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đóqua nhiều lần cấy truyền liên tiếp trên các môi trường tổng hợp. Thế nhưng chủng độc của chúng tăng lên khi cấy truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp. 7 1.3.2. Cơ chất và môi trường Cơ chất là các hạt có dầu, dặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc. Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hay phomat ô nhiễm tự nhiên thường không có hoặc có rất ít độc tố. Ngược lại gần 1/3 số chủng phân lập từ các gia vị có khả năng sinh sản Aflatoxin. Ngay cả trên cùng một cơ chất khả năng sản sinh Aflatoxin của các chủng Aspergillus flavus cũng khác nhau. Nguyên nhân của hiện tượng này cũng có thể do một số giống lạc có tính kháng với Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin. Các nhà tạo giống đã dựa vào cơ sở phát hiện trên nhằm tạo ra những giống lạc không bị nhiễm Aflatoxin. Đây là hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học sử dụng nhằm loại bỏ Aflatoxin theo một cách có lợi nhất. Sự hình thành Aflatoxin phụ thuộc vào sinh khối sợi nấm và thời gian phát triển, khối lượng sợ nấm càng nhiều thì sản sinh độc tố càng nhiều và ngược lại. Thời gian để sản sinh Aflatoxin cực đại thường từ ngày thứ sáu đến ngày thứ bảy sau đó giảm đi. Lý do của sự giảm lượng Aflatoxin trong những ngày tiếp theo là do quá trình tự phân giải của chính bản thân nấm mốc. Nhiệt độ thích hợp nhất để sản sinh Aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25 o C -28 o C. Nếu nuôi cấy Aspergillus flavus ở 45 o C thì khả năng sản sinh Aflatoxin bị hạn chế. Hàm lượng trong cơ chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành Aflatoxin. Ở lạc nhân, lượng nước từ 15-30% thì sự hình thành Aflatoxin sau 2 ngày, trền gạo cần lượng nước là 24-26% và ở ngô là 19-24%. Như vậy có thể nói sự sản sinh Aflatoxin diễn ra rất nhanh. Đặc biệt là sau thu hoạch, cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gain làm khô kéo dài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm Aflatoxin. Độ pH ban đầu của môi trường ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin, dù nó là bao nhiêu thì lúc nào cũng có xu hướng quy về trị số giữa 4 và 5. Nguồn carbon: người ta đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường hexoza vào môi trường nuôi cấy lên sản lượng Aflatoxin của Aspergillus và kết luận rằng các đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp Aflatoxin. 8 Gluxit Nồng độ 1% 3% D glucose +++ +++ D manose +++ +++ D fructose +++ +++ D galactose - ++ D gulose - 0 D arabinose - - D ribose - + D eritrose - 0 D glyxerandehyt +++ +++ D xilose + ++ Nguồn đạm: trên môi trường có đạm Nitrite, Aspergillus flavus tiết ra ít Aflatoxin, môi trường có đạm amoniac, axit uric và axit glutamic, Aspergillus flavus sản sinh ra nhiều hơn, vì vậy trong công thức cổ điển của Czapeck, NaNO 3 được thay thế bằng NH 4 Cl hay một muối amoni khác. Lượng Aflatoxin cao nhất trên môi trường có nấm men hay có pepton hoặc tốt hơn nữa là có các axit amin. Tiamin và các vitamin nhóm B kích thích sự tổng hợp các Aflatoxin, riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng. Các ion kim loại: sự có mặt của Zn, Mg hay Fe kích thích khả năng sản sinh Aflatoxin, Co, Cr, Mn, Ca có ít hiệu lực. Các chất khác; khi Aspergillus flavus phát triển trên hạt lúa mì, lượng Aflatoxin tạo ra ở giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn giai đoạn phôi nhũ. Ngoài ra người ta còn thấy việc thêm lipid ( chiết từ mầm lúa mì bằng pentan) vào một cơ chất gồm mầm lúa mì đã loại bỏ lipid có hiệu quả tốt đến sản sinh Aflatoxin. Ảnh hưởng có lợi của các axit béo đến việc hình thành độc tố được nhiều người công nhận, làm cho người ta nghĩ rằng chúng có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp các Aflatoxin, việc phân hủy sinh học của chúng đưa đến sự hình thành các tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hóa sinh tổng hợp Aflatoxin. Thêm Dimetylsunfoxit (DMSO) vào môi trường nuôi cấy sẽ làm nồng độ Aflatoxin hoặc tăng lên chút ít hoặc giảm sút rất nhiều. Ở đây có le4la2 một tác dộng chuyển hóa qua lại hơn là một phản ứng hóa học giữa DMSo với các Aflatoxin. 9 1.4. Cấu trúc và các tính chất của Aflatoxin. 1.4.1. cấu trúc hóa học. Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 18 loại Aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất gồm 4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, được đặt tên là B 1 , B 2 , G 1 , G 2 .bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue và G là viết tắt của Green. Các sắc kí lớp mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom:metanol (98.5 :1.5) được tách bằng hệ thống clorofrom:carbon tetraclorua:nước:metanol(2:2.5:1:3) đã phát hiện 2 vết huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, một vết huỳnh quang xanh tím, đó là Aflatoxin B 1 , một vết khác có Rf thấp hơn và huỳnh quang màu lục, đó là Aflatoxin G 1 , Aflatoxin G 1 có cấu trúc gần giống Aflatoxin B 1 , nó có 2 chức lacton, còn Aflatoxin B 1 chỉ có một. Bằng cách khử nối đôi cách trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B 1 và G 1 ta thu được hai sản phẩm độc khác là Aflatoxin B 2 và Aflatoxin G 2 . So với Aflatoxin B 1 , độc tố của chúng đối với vịt con kém hơn từ 60 đến 100 lần, như vậy chúng sẽ không độc, nếu không có khả năng mất hidrat chuyển thành Aflatoxin B 1 rất độc. Aflatoxin B 1 , B 2 trong sửa bò chuyển hóa và gọi là Aflatoxin M 1 và Aflatoxin M 2 ( M là viết tắt của milk). Aflatoxin M 1 có huỳnh quang xanh màu tím, Aflatoxin M 2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang màu tím. Aflatoxin M 1 là hidroxi-4 Aflatoxin B 1 , và Aflatoxin M 2 là hidroxi – 4 Aflatoxin B 2 . Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B 1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G 1 , trong khi đó B 2 và G 2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn. 10 [...]... dụng qua máy Densitometer Hội hóa học phân tích ( A.O.A.C -1980) đã lưu ý đến phương pháp phân tích dịnh lượng sử dụng TLC Phương pháp này được mở rộng thành chương trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ưng thư thế giới các kết quả của chương trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao Hiện có 4 phương pháp phân tích TLC phổ biến nhất là CB( contiamintion... Qua các phương pháp nghiên cứu trên cho thấy việc kiểm tra Aflatoxin trong thực phẩm là việc cần thiết nhằm đảm bảo giá trị kinh tế trong sản xuất và bảo vệ sức khỏe cộng đồng phương pháp phân tích Aflatoxin được chấp nhận trên toàn thế giới là phương pháp sắc kí lỏng hiệu hiệu năng cao Phương pháp sắc kí bản mỏng được dùng nhiều trong phòng thí nghiệm Hiện nay các quá trình phân tích Aflatoxin trong. .. ngờ không chuyển thành màu vàng 3.2 các phương pháp định lượng Mặc dù các quy trình luôn luôn thay đổi, nhưng các bước cơ bản vẫn giữ nguyên, bao gồm: chiết xuất, loại trừ mỡ, làm sạch, phân tích và định lượng sự phối hợp các kĩ thuật chiết xuất lỏng và dẫn đến phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất ngày nay là phương pháp CB ( contamination branch) của Epp;ey Phương pháp BF (best food) nhanh và kinh... Aflatoxin ở việt nam các phương pháp phân tích độc tố Aflatoxin đã được sử dụng rộng rãi như phương pháp bản mỏng, phương pháp sắc kí lỏng cao áp… TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Moreau Claude, Đặng Hồng Miên(dịch), “ Nấm Mốc Độc Trong Thực Phẩm NXB khoa học kỹ thuật, 1980 [2] Viện công nghệ sinh học và thực phẩm- Trường đại học công nghiệp thành phố hồ chí minh,” An Toàn Và Vệ Sinh Thực Phẩm NXB đại học công... 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg (0.03 µg) Aflatoxin B1 ở củ lạc Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC như một phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất 3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ( high ferformane liquid chromatorgaphyHPLC) Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, chọn lọc dùng định lượng. .. mặc của các phân tử nhỏ hơn chỉ ra rằng có sự tồn tại Aflatoxin trong vòng 24 giờ Tuy nhiên phương pháp này dựa trên thời gian bán hủy của sự chuyển hóa, mức độ AFB 1-guanine tính được có thể thay đổi theo từng ngày, vì vậy nó chắc chắn không phải là phương pháp tốt để xác định hàm lượng Aflatoxin đối với sự phơi nhiễm trong thời gian dài Một phương pháp khác là tính lượng phức AFB 1-alumin trong huyết... hủy Aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định Các Aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform, metanol và đặc biệt ở dimetylsulfoit ( dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc áp 11 dụng các Aflatoxin vào các động vật thực nghiệm) Tính tan của Aflatoxin trong nước dao động từ 10 – 20 mg/l 1.4.3 Tính chất hóa học Sự có mặt của các vòng lacton ở phân tử Aflatoxin... việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng Aflatoxin của các sản phẩm, mặc dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu Công thức nguyên tử Trọng lượng phân tử... với TFA đồng phân để xác định được các Aflatoxin B1, B2, G1, G2 ở nồng độ 5pg Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của Aflatoxin B1 Kết quả phát triển phương pháp đồng phân cột 23 3.3 Xét nghiệm ở người Hiện tại có 2 phương pháp thường được sử dụng để phát hiện mức độ nhiễm Aflatoxin ở người Phương pháp đầu tiên là tính lượng phức AFB 1-guanine trong nước tiểu... dẫn đến sự khẳng định sai lệch Phương pháp khẳng dịnh sự có mặt của Aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản sắc ký Dựa vào sự biến đổi của Aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu cả Aflatoxin chuẩn và Aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của Aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski . KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC  PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AFLATONXIN TRONG THỰC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2014 NHẬN. người cũng như các loại động vật và các phương pháp phân tích để phát hiện và phòng tránh việc nhiễm aflatoxin nên em đã chọn đề tài “ các phương pháp phân tích Aflatoxin trong thực phẩm Do kiến. là các hạt có dầu, dặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc. Lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hay phomat ô nhiễm tự nhiên