Các phương pháp phân tích protein sử dụng HPLC và LC

Một bài tiểu luận phân tích mang tính tham khảo cho các bạn học kỹ thuật hoá học, phân tích, các học viên cao học, bài trình bày các phương pháp phân tích protein.

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Trường Đại Học Bách Khoa

MỤC LỤC

I Khái niệm về kĩ thuật sắc kí……… 3

II Phương pháp HPCL……… 4

1 Khái niệm HPLC……… 4

2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột……….7

3 Phân loại sắc ký ……….8

4 Ưu – nhược điểm của HPLC………9

5 Phân tích protein bằng HPLC……….10

6 Phân tích AMINO ACID bằng phương pháp HPLC………12

7 Ứng dụng của phương pháp HPLC trong công nghệ thực phẩm…….13

III PHƯƠNG PHÁP LC-MS………16

1 Khái niệm LC-MS……… 16

2 Nguyên lý chung……….17

4 Nguồn ion hóa trong đầu dò khối phổ……… 19

5 Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ……… 23

6 Ứng dụng……… 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PROTEIN SỬ

DỤNG HPLC và LC-MS

I Khỏi niệm về kĩ thuật sắc kớ

Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích ( xác định ) các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hoá học,vật lý và hoá lý của các chất trong những

điều kiện nhất định Các tính chất đó có thể là:

 Tính chất hấp phụ của chất rắn,

 Tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion,

 Sự rây phân tử theo kích thước của chúng

 Sự tạo phức và sự liên hợp phân tử,

 Sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau,

Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái của chất mẫu và pha động khi tiến hành tách sắc ký Đó là

 Kỹ thuật phân tích sắc ký khí và

2 Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng

Trong kỹ thuật sắc ký lỏng lại được chia thành hai nhóm, đó là:

+ Sắc ký lỏng áp suất thường ( sắc ký cổ điển), và

+ Sắc ký lỏng hiệu suất cao ( áp suất cao: (HPLC)

Và hiện nay ( sau năm 2000 ) đã có sắc ký lỏng siêu áp, loại này làm việc với áp suất cao từ 900-1500 bar ( UHPLC: 900-1500 bar )

Trong sắc ký cột ( có dạng rắn-lỏng hay lỏng-lỏng ), kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất thường đã ra đời và được ứng dụng từ lâu ( đã trên 60 năm ) Nhưng hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng như dung môi để chạy sắc ký Ngược lại kỹ thuật HPLC tuy mới ra đời và phát triển khoảng trên chục năm lại đây, nhưng hiện nay đang được phát triển rất nhanh và đã ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học, sản xuất và công nghệ Vì kỹ thuật tách sắc ký HPLC này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao và tốn ít thời gian cũng như tốn ít mẫu Nói chung trong khoảng 15 năm qua, kỹ thuật phân tích HPLC

đã chiếm đến gần 70 tổng số các công trình nghiên cưu và ứng dụng về sắc ký

Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm:

 Sắc ký lớp mỏng áp suất cao ( HPTLC )

 Sắc ký cột lỏng áp suất cao hay sắc ký lỏng hiệu suất cao ( HPLC )

Trong nhóm HPLC, tuỳ theo bản chất của quá trình sắc ký của pha tĩnh trong cột tách mà người ta chia thành:

1 Sắc ký phân bố ( PC ) của chất tan giữa hai pha không tan ( trộn) vào nhau

2 Sắc ký hấp phụ pha thường ( NP-HPLC ),

3 Sắc ký hấp phụ pha ngược hay pha đảo ( RP- HPLC ),

4 Sắc ký trao đổi ion ( IEX-HPLC ) và cặp ion ( IP-HPLC ),

5 Sắc ký rây phân tử ( FG-HPLC )

II Phương phỏp HPCL

1 Khái niệm HPLC

Sắc ký (Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa

vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …) Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ

có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo

hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

Sắc ký là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi

là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển

và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thực phẩm Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thực phẩm cho phép kiểm định tính và định lượng

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút

Số lượng mẩu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20microlit

2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và

lọai sắc ký

Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion

Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử

Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một

pha động Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân

tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C Sẽ được tách ra khỏi

nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng

hợp các tương tác

Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) và ngược lại Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết

định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới đây )

3 Phân loại sắc ký

Sắc ký hấp phụ :

Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loại như sau :

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ :

- Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi

Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP )

Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau :

- L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm

- L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm

- L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm

Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH2, CN vv

4 Ưu – nhược điểm của HPLC

4.1 Ưu điểm của HPLC

- Tốc độ nhanh (nhiều phân tích <30 phút)

- Độ phân giải cao (nhiều loại pha tĩnh)

- Độ nhạy cao (kết hợp nhiều loại Detector)

- Tái sử dụng cột

- Hữu ích trong việc phân tích các cấu tử có phân tử lượng lớn

hoặc ion hóa (có độ bay hơi thấp)

- Mẫu dễ thu hồi (nên cũng có thể sử dụng để phân tách hỗn hợp)

4.2 Nhược điểm của HPLC

Thiết bị đắt tiền, đầu tư ban đầu cao

5 Phân tích protein bằng HPLC

Các protein được chạy qua cột nhồi bằng các hạt aganose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến phù hợp Có 2 phương pháp khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein

Phương pháp sắc ký trao đổi ion:

Các phân tử Protein được phân lập dựa trên diện tích ion hóa bề mặt của chúng bằng việc sử dụng các vật liệu làm cột là các hạt mang các nhóm chức tích điện âm hoặc dương (pha tĩnh) Các phân tử Protein tương tác yếu với các hạt sẽ được hồi lưu khi sử dụng 1 dung dịch muối loãng chảy qua cột sau đó (dung dịch mẫu – pha động) Các phân tử tương tác với pha động càng mạnh càng cần hàm lượng muối cao để hồi lưu mẫu (muốn làm “trung hòa” các vùng mang điện tích phải cho phép các phân tử Protein được giải phóng ra khỏi cột).Bằng việc tăng dần nồng độ muối trong các dung dịch đệm thu hồi mẫu, các phân tử Protein khác nhau hoặc gần giống nhau đều được tách thành phân đoạn khác nhau khi chúng được hồi lưu từ cột

Phương pháp này cho phép phân tách các loại Protein trên cơ sở đặc điểm khác

Phương pháp sắc ký lọc gel : nhau của các loại Protein về hình dạng và kích thước Khác với trong phương pháp sắc ký trao đổi ion của các hạt được sử dụng để nhồi cột trong phương pháp này không mang các nhóm tích đi ện mà thay vào đó là mang các lỗ có kích thước khác nhau Các phân tử Protein càng nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất cả các lỗ, vì vậy thời gian chạy qua cột dài hơn và thời gian hồi lưu muộn hơn Ngược lại các phân tử Protein kích thước càng lớn càng có thời gian hồi lưu sớm hơn

Đối với loại cột, các phân đoạn sắc ký được thu các nồng độ muối khác nhau hoặc ở các thời gian hồi lưu khác nhau thu được từng loại Protein được quan tâm nghiên cứu Các phân đoạn hoạt tính Protein được quan tâm cao nhất sẽ tích lũy và tiến hành tinh sạch bổ sung

Độ tinh sạch của Protein tăng lên khi các phân đoạn Protein được chạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau thông thường một cột sắc ký đơn lẻ không đủ để tinh sạch được một loại phân tử Protein mong muốn nào đó dù quá trình sắc ký được lặp

đi lặp lại nhiều lần thay vào đó người ta thường phải áp dụng một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được phân đoạn chứa một lượng lớn loại phân tử Protein được hồi lưu trong dung dịch muối đậm đặc từ cột tích điện dương (đối với Protein tích điện âm) hoặc được hồi lưu sắc ký lọc gel (đối với Protein kích thước nhỏ), các kích thước này đơn lẻ thường không đủ để thu được 1 sản phẩm Protein được tinh sạch hoàn toàn

6 Phân tích AMINO ACID bằng phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là phương pháp phân tích amino acid phổ biến nhất hiện nay Sau hơn

50 năm kể từ khi công trình phân tích amino acid tự động đầu tiên được công bố, nhiều công trình phân tích amino acid dựa trên phương pháp s ắc ký lỏng đã được công bố và đưa phương pháp sắc ký lỏng trở thành phương pháp tiêu chuẩn cho phân tích amino acid Hiện nay, trên thị trường, có bán các thiết bị phân tích tự động chuyên dụng cho các amino acid Trong s ắc ký lỏng, việc phân tách các amino acid được phát triển theo bốn cơ chế chính Sắc ký trao đổi ion: là phương pháp sắc ký lỏng đầu tiên được áp dụng để phân tích amino acid bởi Spackman (1958) Phương pháp này dựa trên s ự khác biệt v ề tính acid-baz của các amino acid nên khả năng tách rất cao Cho đến năm 1990, phương pháp này luôn được ứng dụng nhiều trong phân tích amino acid

Sắc ký pha đảo: Từ năm 1990, phương pháp s ắc ký lỏng này được ứng dụng r ộng rãi để phân tích các dẫn xuất của amino acid Tuy phương pháp s ắc ký pha đảo phải g ắn liền v ới các phản ứng tạo dẫn xuất cho amino acid; nhưng do có hiệu năng cao và dễ dàng áp dụng chế độ rửa giải v ới hệ pha động biến đổi, dễ

ghép nối v ới các đầu dò có độ nhạy cao, nên cho thời gian phân tích ng ắn, giới hạn định lượng thấp

Hình: Sắc ký đồ phân tách các dabsyl AA bằng phương pháp sắc ký pha đảo

Sắc ký điện động micellar: đây là phương pháp kết hợp giữa điện di mao quản

và sắc ký Phương pháp này có khả năng phân tách các amino acid rất tốt do hiệu năng lớn

Trong những năm gần đây, các công ty sản xuất cột s ắc ký thường giới thiệu các cột phân tích amino acid chuyên dụng Với cột chuyên dụng, công việc phân tích amino acid thường đơn giản hơn Tuy nhiên, các cột phân tích này thường có giá thành cao

Ngoài các phương pháp xác định đồng thời như trên, một s ố amino acid có các tính chất đặc trưng có thể được xác định đơn lẻ Cysteine và cystine thường được xác định trực tiếp theo phương pháp điện hóa Tryptophan cũng có thể xác định đơn lẻ bởi phương pháp quang phổ với thuốc thử dimethylamino benzaldehyde và sodium nitrite [1]

7 Ứng dụng của phương pháp HPLC trong công nghệ thực phẩm

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực như: Trong nông sản, thực phẩm chế biến, thức ăn gia súc, thuỷ hải sản

Ví dụ:

·Kiểm tra dư lượng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản

· Kiểm tra dư lượng hóc môn (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạt cho gia súc

· Kiểm tra dư lượng màu đã bị cấm có trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan có

trong trứng gia cầm và trong son môi, 3 MCPD (3 Monoclo propan 1,2 diol) có trong nước tương, formon có trong bánh phở…

+ Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra hàm lượng hoạt chất chính trong

dược phẩm, dư luợng chất có thể gây độc hại…

+ Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, môi trường…

- Trong ngành y tế nói chung và trong công tác phòng chống sốt rét nói riêng kỹ

thuật sắc ký lỏng cao áp vẫn có vai trò lớn Hiện nay, thuốc giả và thuốc kém chất

lượng là một vấn nạn không những ở Việt Nam mà cả trên toàn thế giới, đã có hàng

ngàn ngươi chết vì thuốc giả và thuốc kém chất lượng Để góp phần vào chiến dịch

này, Labo kiểm định hoá chất và thuốc của Viện đã ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng

cao áp (HPLC) để kiểm tra hoạt chất chính có trong 2 loại thuốc sot rét là Artesunate và Chloroquine

- Được tiến hành trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) hiệu Agilent 1100 với đầu

dò UV-VIS, chất chuẩn được mua tại Viện kiểm nghiệm có độ tinh khuyết trên 99% Cân mẫu và chuẩn ở một liều lượng như nhau và chạy trên cùng một điều kiện sắc ký giống nhau Sau khi máy chạy xong kết quả được so sánh giữa chuẩn và mẫu bằng diện tích peak được phần mền của máy ghi lại:

+ Nếu hàm lượng mẫu phân tích bằng hoặc lớn hơn trong giới hạn 10% so với hàm

lượng mẫu thuốc chuẩn thì kết luận mẫu thử đó đạt chất lượng

+ Nếu hàm lượng mẫu phân tích nhỏ hơn 10% so với hàm lượng của mẫu thuốc chuẩn thì kết luận mẫu đó là kém chất lượng

+ Nếu phân tích mẫu thuốc cùng điều kiện với mẫu chuẩn mà không thấy xuất hiện

peak thì ta khẳng định là mẫu thuốc đó không có hoạt chất cần phân tích hay mẫu

thuốc đó là giả

- Bên cạnh việc kiểm tra thuốc Labo còn ưng dụng HPLC trong các nghiên cứu thử

nghiệm lâm sàng thuốc sốt rét mới như Artekin (dihydroartemisinine + piperaquine), Artequick (artemisinine + piperaquine) và đánh giá hiệu lực của thuốc sốt rét hiện dùng

- Ngoài ra HPLC còn được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm Xác định axit hữu cơ trong lá, vỏ quả bứa khô được bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp Lá tươi và vỏ quả bứa khô được chiết với nước ở nhiệt độ 1270C thời gian 30-60 phút dưới áp suất 0,15 MPa Đồng thời, vỏ quả bứa khô được chiết bằng dung môi (axeton và metanol) trong bộ chiết soxhlet ở nhiệt độ 750C trong thời gian 8 giờ Mẫu được bơm vào máy sắc kí lỏng cao áp cùng với axit photphoric 0,01 M và metanol với tốc độ dòng là 0,7 ml/phút sử dụng đetectơ 210 nm Axit