các phương pháp phân tích protein

Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PROTEIN A CHUẨN BỊ MẪU Trong nhiều trường hợp mẫu sinh học mẫu môi trường thường có thành phần phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích thấp không tương thích cho việc phân tích trực tiếp hệ sắc ký Trước phân tích mẫu cần phải phân lập, tách làm hợp phần mẫu cần phanâ tích Thu thập Lấy mẫu Bảo quản Chiết Xử lý mẫu Làm giàu Tách làm Phát Phân tích Đònh lượng Sơ đồ đặc trưng trình phân tích sắc ký Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Thu thập mẫu đại diện phần quan trọng với quy trình phân tích, có sai sót trình lấy mẫu không thu kết phân tích xác Sau lấy mẫu, áp dụng kỹ thuật hấp phụ với hợp chất hữu lọc với mẫu lắng cặn (huyền phù) Các mẫu có kích thước mẫu lớn mẫu rau mẫu không đồng không dạng phù hợp cho phân tích sắc ký Trong trường hợp này, sau lấy mẫu cầc làm kho,â cắt, nghiền, xay, rã hay ray nhỏ để làm giảm kích thước lam cho mẫu đồng Tiếp theo, trộn mẫu dạng bột để nhận mẫu đồng Cần lưu ý tránh nhiễm bẩn thay đổi thành phần mẫu suốt trình xủ lý bảo quản mẫu, phân tích lượng vết Kết qua phân tích ý nghóa xuất trình hóa học (như trình: quang phân, hấp phụ, bay hơi, nhiệt phân, hoạt động vi sinh phản ứng hóa học) trình lấy phân tích mẫu Mẫu phải bảo quản phù hợp cho đền phân tích, ví dụ đựng chai thuỷ tinh để chỗ tối giữ 0oC, điều kiện ức chế trình hoá học vừa nêu Với mẫu sinh học thực phẩm, ngâm nước giải phóng Enzym có khả thay đổi thành phần mẫu thời gian bảo quản điều kiện lạnh có nitơ nên ngâm nước vừa đủ trước phân tích Kỷ thuật tách làm giàu sử dụng phương pháp Vật Lý Các phương pháp thường dược sử dụng để tách làm giàu hợp chất hữu chưng cất, chiết hấp phụ Một số phương pháp phân tích lượng vết hợp chất hữu nước nêu tóm tắt bảng Các phương pháp phân tích protein Phương pháp Làm giàu lạnh Nguyên tắc Điện di sắc ký Phạm vi ứng Chú thích Mẫu nước làm dụng Tất Giảm thiểu lượng mẫu bò đông lạnh cục bộ, loại mẫu mát bay hoạc làm chất hoà tan biến đổi hoá học phần không làm lạnh Sự mẫu chủ yếu bò hút giữ, hấp phụ, bay tạo dòng lớp nước đá Kích cỡ mẫu bò giới hạn Làm khô lạnh Mẫu nước làm Các chất hữu Có thể vận dụng thể lạnh loại bỏ nước không bay tích mẫu lớn tinh khiết trình thăng hoa Không áp dụng với điều kiện chânh chất bay không Các hợp phần vô Chưng cất chân Nước bay Các chất hữu đồng thời làm giàu Quá trình chậm thể không áp suất thấp không bay tích mẫu lớn ở/hoặc gần nhiệt độ môi trường Các chất vô làm giàu đồng thời Ít làm nhiễu bẩn mẫu Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký mẫu bò biến đổi phân huỷ nhiệt dom phản ứng hoá học Thẩm thấu Mẫu nước di Khối lượng vi sinh Không thể làm giàu ngược qua màng lọc phân tử >200 hợp chất với khối lượng điều kiện áp suất mẫu nhỏ cao Các hợp phần mẫu nước mà Các chất vô làm điểu kiện bình nhiễm bẩn mẫu thường qua màng Màng lọc hấp phụ làm giàu hợp phần giải phóng tạp chất vào mẫu Lọc siêu âm Mẫu nước lọc Phân tử mẫu Màng lọc dùng để làm giàu điều kiện áp lớn phẩn tử có kích thước suất qua màng khác mà cho phân tử có kích thước nhỏ Thường sử dụng cho qua giữ lại chất có phân tử lượng phân tử có kích >1000 thước lớn Có thể làm giàu với thể tích mẫu lớn nhiệt độ thấp Các phương pháp phân tích protein Chiết dung môi Mẫu nước chiết với moat dung môi Điện di sắc ký Tất Các mẫu có lực cao với loại mẫu pha nước không chiết hữu không trộn lẫn Hiệu xuất tách phụ thuộc vào lực Quá trình chiết chất tan với dung thực cách chiết môi hữu lần nhiều lần với dung môi chiết Các tạp chất dung môi làm giàu Hấp thụ bề Mẫu nước cho Tất với mẫu Các chất hấp phụ bao gồm: mặt qua cột chứa loại mẫu than hoạt tính, nhựa tổng chất hấp phụ hợp, polyuretan dạng bọt, hợp phần hữu pha liên kết chất hấp phụ Sau trao đổi ion chúng rửa giải lượng nhỏ Nhìn chung, kó thuật dung môi hữu hiệu can ý việc phân biệt đối xử Biến đổi mẫu vcà hiệu suất thu hồi không hoàn toàn cung vấn đề cần ý Tách khí Một khí trơ tinh khiết Các chất dễ kó thuật Kó thuật bao gồm tách vòng Các phương pháp phân tích protein thổi qua Điện di sắc ký bay cho qua mẫu nước kín, sục khí – bẫy lai kó thuật không gian Khi đó, hợp phần dễ bay chuyển Hạn chế thể tích mẫu từ pha lỏng lên pha nhỏ khí qua bẫy lạnh bẫy hấp Hiệu chiết phụ thuộc phụ vào tính chất vật lý hóa học chất tan Kỹ thuật chưng cất phù hợp để tách hợp chất hữu dễ bay từ mẫu long phần có khả tan mẫu rắn Cơ sở vật lý trình tách phụ thuộc vào phân bố hợp phần can lỏng – Các hợp phần dễ bay tập trung vào pha thu ngưng tụ Hiệu trình tách phụ thuộc vào tính chất vật lý hợp phần hỗn hợp, thiết bò sử dụng phương pháp chưng cất Một số kiểu cột chưng cất nêu bảng Với thiết bò bay kiểu ống đồng trục, màng quay, màng keo màng rơi chưng cất áp suất khí áp suất thấp tách hiệu chất hữu dễ bay Các thiết bò chưng cất màng treo mang rơi tác dụng nhanh có hiệu hơn, dễ sử dụng tạo sàn phẩm phụ so với thiết bò cất dung môi có mặt hầu heat cá phòng thí nghiệm tổng hợp hữu Các chất hữu phân cực dẽ bay ancol, nitril, Andehyt, keton đặc biệt thích hợp tách chưng cất, dòch chiết sau làm phân tích mà không cần làm tinh khiết B PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Đònh nghóa: Sắc ký trình tách liên tục phần hỗn hợp chất phân bố không đồng chúng pha tónh pha động pha đông xuyên qua pha tónh Có ngiều phương pháp điện di sắc ký khác nhau: sắc ký hấp thụ, sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký cao áp, sắc ký dấy,… tất phương pháp dựa vào chế nhau: - Hấp phụ - Phân bố - Trao đổi ion - Rây phân tử Sắc khí hấp phụ: a) Nguyên tắc: Sắc khí hấp phụ dựa vào tích chất hấp phụ khác cấu tử hỗn hợp cần phân tách Các chất hấp phụ sử dụng thường đưa lên cột hình trụ đứng, dung dòch cần phân tích chuyển động qua cột Từng cấu tử dung dòch hập phụ lên cột với mức độ khác b) Yêu cầu hấp phụ dung môi Đối với chất hấp phụ - Chất hấp phụ tương tác hoá học - Có tính chất chọn lọc - Các chất hấp phụ không phân cực (than hoạt tính, diatonit…) không hấp phụ chọn lọc phân tử không phân cực Các phương pháp phân tích protein - Điện di sắc ký Diện tích bề mặt kích thước hạt phải thích hợp Hạt cacng1 bé cân hấp phụ đương thiết lập nhanh khả tách tốt - Chất hấp phụ phải ổn đònh tiêu chuẩn hoá để thu kết trùng lặp Đối vối dung môi - Dung môi hoà tan tương đối tốt tất cẩu tử cần phân tách, bò hấp phụ tối thiểu pha tónh (chất hấp phụ) không phản ứng hoá học với chất tan chất hấp phụ Đối với Axit amin dung môi thường sử dụng là: nước, rượu metylic, fomaldehid nước, eteretylic, phenol, choloreform Chất hấp thụ thường là: cilicaget, nhôm oxit, titan dioxide, than hoạt tính, tinh bột sắc ký phân bố a) nguyên tắc: Dựa phân bố chất tan hai pha lỏng không trộn lẫn vào cho chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng yên (pha tónh) Như sắc ký phân chia gồm hai pha - Pha cố đònh (pha tónh): chất mang (các chất rắn, giấy) nước(độ ẩm môi trường) - Pha di dỗng: dung môi Pha tónh hấp thụ bề mặt chất rắn (chất mang) liên kết hóa học với chất mang Nhờ vào độ hòa tan khác hai pha nên sau thời gian cấu tử đưỡc tách rời khỏi hỗn hợpvà dònh vò khac giấy, mỏng chất mang cột b) Phân loại: Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Dựa vào dạng chất mang, người ta chia sắc ký phân bố làm ba loại: - Nếu chất mang nạp lên cột hình trụ đứng, gọi sắc ký cột Chất mang thường sử dụng là: silicagel, cao su, tinh bột, cellulose,… - Nếu chất mang dạng giấy (sắc ký giấy), dược gọi : sắc ký giấy - Nếu chất mang trải thành lớp mỏng lên phiến kính ta có sắc ký lớp mỏng Ví dụ minh họa: Phân tích hỗn hợp axit amin sắc ký giấy - Nguyên tắc: chấm hỗn hợp axit amin lên tờ giấy lọcrồi nhúng tờ giấy vào dung môi thích hợp(phenol,butanol,…) dung môi thấm tờ giấy kéo theo cấu tử hỗn hợp chiều dài tờ giấy Mỗi acid amin có chiều dài phân bố riêng pha động pha tỉnh Kết acid amin phân tích thành acid amin riêng biệt - Dùng thuốc thử phu lên giấy, thể màu vết ứng vối chất Ta nhận thấy vò trí acid amin tách khỏi hỗn hợp Trong điều kiện đònh (dung môi, nhiệt độ loại giấy,…), tốc độ di chuyển dung môi cấu tử đặc trưng hệ số Rf Rf= Khoảng di chuyển cấu tử Khoảng dòch chuyển dung môi Nguyên liệu, hóa chất, thiết bò Nguyên liệu : Các acid amin chuẩn (hỗn hợp MI): dung dòch nghiên cứu Thiết bò : Bình sắc ký, giấy chạy sắc ký: Whatman – Hóa chất : Dung môi cho sắc ký thường hỗn hợp nhi6èu chất khác Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký VD; Butanol : acid acetic : H2O với tỷ lệ 5:2:3 Thuốc thuốc thử Sakaguchi I: Naphtol : Urê : 5g Cồn : 10ml 0.01 Thuốc thử Sakagichi II: Brome : NaOH 5% : 2g 10ml Thuốc thử Isatin: 100g Isatin 50ml n-butanol chứa 5% acid acetic đậm đặc Thuốc thử Ninhydrin: dung dòch 0.2% ninhydrin aceton - Các bước tiến hành Bước 1: Chuẩn bò giấy sắc ký: Trên giấy vẽ hai vong tròn đồng tâm có đường kính 12.8 cm cm Vẽ đường kính thẳng góc AB CD chấm amino acid theo hình vẽ Cắt dao lam theo đường kính AB đoạn 2mm bên bên tâm O Cắt giấy khác kích thước 40 x 12 mm, gấp làm ba dọc theo chiều dài cắt nhọn đầu ta lưỡi gà 10 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Đổ dung dòch phủ gel điện di cho 0,5ml gel stacking vừa điều chế xong để tráng bề mặt gel, đổ bỏ Đổ cho đầy gel stacking vào đặt lựợc vào để thành giếng Chú ý không để tạo bọt khí lược Để gel cố đònh 60 phút Nhẹ nhàng lấy lược khỏi gel, tránh làm hỏng vách ngăn cách Tráng lại giếng dung dòch điện di, sau đổ bỏ dung dich điện di Đặt gel vò trí hộp điện di, bơm 5-10μl có nồng độ khoảng 1μg/μl mẫu protein xử lý dung dòch pha mẫu vào giếng Đóng điện tiến hành điện di Sau khoảng 1giờ, vách màu thò xuống gần đến đáy gel tắt điện di lấy gel nhuộm Bước 6: Nhuộm đọc kết Đặt gel dung dòch cố đònh màu nhanh 30 phút, lắc nhẹ Chuyển gel qua dung dòch protein vài giờ, lắc nhẹ đến thấy vệt màu lên Cuối cho gel vào dung dòch tẩy màu, dung dòch thay hai lần ngày đến gel Gel hoàn tất bảo quản dung dòch acid acetic 7% nước D MỘT SỐ VÍ DỤ VỀ ỨNG DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRÊN Phân tích protein điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS – Page) Để kiểm tra mức độ tinh protein đích sau qua trình tách chiết tinh chế người ta sử dụng phương pháp điện di (electrophoresis) Kỹ thuật điện di để xác đònh mộtt cách gián tiếp trọng lượng phân tử phân tử nghiên cứu tinh chế chúng Điện di phương pháp nghiên cứu di chuyển phân tử tích điện, đặc biệt protein nucleacid Nguyên tắc kó thuật điên di 31 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký tác dụng điện trường phân tử tích điện âm di chuyển vè cực dương phân tử tích điện dương di chuyển cực âm điện trường Sự di chuyển phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, điện tích, thành phần hóa học phân tử lực điện trường Có nhiều phương pháp điện di khác nhau, việc sử dung phương pháp tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu Trong nghiên cứu protein kó thuật điện di thường sử dụng là: điện di gel Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide (SDS - Page) a) Nguyên tắc: Gel Polyacrylamide gel tạo thành polymer hóa phân tử Acrylamide N, N’-Methylene – Bis – Acrylamide Quá trình Polylmel hóa xúc tác hệ thống Ammonium persulfate N,N,N’,N’-tetra methylethylenediamine (TEMED) Điện di gel Polyacrylamide làm tăng khả phân tách mẫu protein di chuyển chúng gel phụ thuộc vào điện trường kích thước lỗ gel Khả phân tách giới hạn lượng phân tử phân tử sinh học mà gel phân tách tùy thuộc vào nồng độ Acrylamide BisAcrylamide: Nếu nồng độ thấp tạo lỗ gel lớn, cho phép phân tách phân tử sinh học có kích thước lớn; ngược lại nồng độ cao cho lỗ gel nhỏ, có khả phân tách phân tử sinh học có kích thước nhỏ Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel (SDS-Page) kỹ thuật điện di gel polyacrylamide có hiên diện SDS, tác nhân làm biến tính âm tính hóa phân tử protein Phương pháp thường sử dụng để xác đònh trọng lượng phân tử proptein thành phần độ chế phẩm protein trình tinh chế Trong kó thuật protein xử lý với chất tẩy SDS tác nhân khử cầu nối disulfite mercaptoethanol dithiothretiol (DTT) Với tác nhân protein từ cấu trúc 2,3,4 biến đổi thành chuỗi 32 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký polypeptide (bậc 1) tất protein tích điện âm Nhờ đó, di chuyển gel phân tử protein phụ thuộc kích thước: phân tử có kích thước lớn di chuyển chậm phân tử có kích thước nhỏ qua lỗ gel có kích thước đònh Trong thực tế để xác đònh phân tử lượng protein, người ta thường so sánh với thang phân tử lượng chuẩn, hỗn hợp protein có trọng lượng phân tử khác biết Với mục đích đưa protein mẫu vạch xuất phát đồng thời tạo phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di gel không liên tục (discontinouus gel) Ở phương pháp gel gồm hai lớp: - Lớp lớp gel gom (stacking gel): protein mẫu dồn lại tạo thành băng mỏng - Lớp hay lớp gel phân tách (separating gel): tạo băng protein có kích thước khác từ hỗn hợp protein xuất phát ban đầu Hai lớp gel phân biệt dung dòch đệm (buffer), nồng độ Acrylamide vò trí Kỹ thuật SDS – PAGE xác đònh phân tử protein có trọng lượng từ 10,000 – 20,000 Daltons Những phân tử protein có lượng lớn 20,000 Daltons thường xác đònh gel có nồng độ Acrylamide 2,5% Những gel dễ vỡ để phân tích protein có trọng lượng phân tử lớn người ta thường sử dụng hỗn hợp gel agarose acrylamide b) Vật liệu phương pháp Vật liệu • + Dụng cụ thiết bò - Máy say gel : - Máy hút chân không: 33 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký - Bộ điện di đứng (vertical electronphoresis): - Bộ nguồn chạy điện di (electronphoresis power supply): - Pipetteman 1000µl : - Pipetteman 200 µl : - Pipetteman 10 µl : - Tip xanh : hộp - Típ vàng : hộp - Giấy lọc : miếng - Giấy thấm: cuộn - Hộp đựng gel : hộp - Giấy Whatman 3MM (11x11cm): miếng - Giấy selophan (11x11cm):1 miếng - Ống Falcon (25x120mm): ống - Beaker 50ml: - Bình xòt đựng nước cất: - Bình xòt đựng cồn : - Găng tay cao su : cặp - Phao để Eppendorf (20epp./phao): - Eppendorf 1,5ml : 10 - Máy đo pH (pH meter): - Đũa thủy tinh: - Ống đong 25,100,1000ml: laoi5 - Giá để Eppendorf : - Ống hút nước : ống - Viết marker nhỏ: 34 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký + Hóa chất: - Dung dòch Acrylamind 30% (w/v) - Dung dòch EDTA 500mM - Tris (hydroxymethyl) aminomethane - Coomasie Brilliant Blue - Bromophenol Blue - Glycerol - Ethanol tuyệt đối - Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) - N,N,N’,N’ – tetramethylethylennediamine (TEMED) - Dithiothreitol (DTT) - Acid acetid băng (glacial acetic acid) - Ammonium persulfate (APS) - Glycine - HCl 6N - Dung dòch đệm Tris – HCl 1,5M pH 8,8 (dung dòch đệm gel phân tách – separating gel buffer): can 3,36g Tris pha 100ml nước cất Thêm dần HCl 6N khuấy dung dòch pH kế 8,8 thêm nước cất cho đủ 200ml Lắc đều, giữ nhiệt độ 4oC - Ammoniumsulfate 10% (chỉ pha trước dùng): cân 0,01g APS cho vào eppendolf, hòa tan 100µl nước cất - Dung dòch đệm Tris – HCl 0,5M pH 6,8 (dung dòch đệm gel gom – stacking gel buffer): cân 6,05g Tris pha 30ml nước cất Thêm dần HCl 6N khuấy pH đạt 6,8 Thêm nước cất 100ml, gi7u4 nhiệt độ 4oC 35 Các phương pháp phân tích protein - Điện di sắc ký Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%: cân 5g SDS pha 50ml nước cất Lấc cho tan Giữ chai nhựa (thủy tinh) có nắp, nhiệt độ thường - Dung dòch đệm điện di Tris – glycine buffer pH 8,3 (25mM Tris, 250mM glycine, 0,1% SDS: pha dung dòch mẹ 5X chúa 15,1g Tris, 94g glycine 5g SDS 1000ml với nước cất Giữ chai nhựa (thủy tinh) có nắp nhiệt độ thường Khi dung pha loãng lần - Dung dòch nạp mẫu (2X): chuổn bò 1ml hỗn hợp gồm 0,2ml Tris – HCl pH 6,8; 30mg dithiothreitol (DTT); 0,4ml SDS 10%; phẩm màu bromophenol Blue 0,2ml nước cất; 0,2ml glycerol Dung dòch nạp mẫu chứa eppendorf giữ 20oC - Dung dòch nhuộm gel: chuổn bò 250ml dung dòch nhuộm gel chứa 0,625g màu Coomassie Blue, 112,5 ml nước cất 25ml acid acetic băng (glacial acetic acid) Lắc đều, chứa chai màu tối có nắp, giữ nhiệt độ thường - Dung dòch giải nhuộm: chuộn bò lít dung dòch giải nhuộm có thành phần gồm 100ml acid acetic băng, 100ml ethanol tuyệt đối, 800ml nước cất, lắc giữ chai có nắp nhiệt độ thường + Nguyên liệu: Là mẫu thu thông qua trình tách chiết giữ – 20 oC Phương pháp • + Đổ gel: Chú ý :polyacrylamide chất độc cho thần kinh Vì không hít uống Khi dính vào tay nên rửa tay ngay, tốt hết mang bao tay tiếp xuc với chúng 36 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Chuổn bò độ gel Polyacrylamide kích thước 100x100x0,75mm có nồng độ Acrylamide 12,5% sau: - Gel phân tách Chuổn bò dung dòch gel phân tích có tổng thể tích 6,7ml có thành phần bổ sung theo thứ tự sau vào ống Faleon có ghi nhãn “gel phân tách”: Nước cất : 2,186ml (542µlx4) Tris – HCl 1,5M pH 8,8: 1,67ml (835µlx2) 30% Acrylamide 0,8% bisacrylamide: 2,78ml (695µlx4) SDS 10%: 67µl Ammonium persulfate 10%: 33,5µl TEMED: 2µl Sau cho TEMED vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipette Pasteur pipetteman bơm dung dòch gel vào khuôn đổ gel cho mức dung dòch gel cao 7cm (tránh tạo bọt khí khuôn gel) Sau nhẹ nhàng đặt lớp nước cất lean lớp gel vừa đổ để trình polymer hóa xảy Chờ gel đông (khoảng 20 – 30 phút) - Gel gom Chuẩn bò dung dòch gel gom tổng thể tích 2ml có thành phần bổ sung theo thứ tự sau vào ống Falcon có nhãn “Gel gom”: Nước cất: 1,17ml (585 µlx2) Tris – HCl 0,5M pH 6,8 : 0,5ml 30%Acrylamide 0,8% bisacrylamide: 0,3ml SDS 10%: 20 µl Ammonium persulfate 10%: 10 µl TEMED: µl 37 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Sau gel phân tách trùng ngưng hoàn toàn, đổ bên Dùng giấy lọc thấm khô mặt hai kiếng làm khuôn đổ gel nước lại bề mặt gel Tiến hành đổ lớp gel gom cách dùng pipette Pasteur pipetteman bơm dung dòch gel gom vào khuôn Đồng thời đưa lược vào gel để tạo giếng mẫu (tránh tạo bọt khí khuôn gel) Sau gel trung ngưng, lấy lược tháo phận bòt đáy khuôn gel (để gel tiếp xúc dung dòch chạy điện di) Lắp đóa gel vào điện di Cho dung dòch điên di vao buồng Chuẩn bò mẫu chạy điện di • - Xử lý mẫu: Búng đáy eppendorf đựng dung dòch nạp mẫu, hút 10 µl dung dòch nạp mẫu cho vào eppendorf cho vào eppendorf ký hiệu mẫu thu Búng eppendorf đựng mẫu vài lần, hút 10 µl mẫu cho vào eppendorf có ký hiệu tương ứng (hút lean bơm xuống vài lần để trộn mẫu, thay típ hút mẫu khác) Láp eppendorf vào phao, đun sôi cách thủy phút Mẫu nạp vào giếng (20 µl) pipetteman - Tiến hành chạy điện di ổn đònh dòng: 2mA/giếng mẫu - Dau điện di, tiến hành nhuộm gel với dung dòch nhuộm chuổn bò (2 - Sau tiến hành giải nhuộm cách ngâm gel dung deich5 – giờ) giải nhuộm gel trở nên suốt không màu Thay dung dòch giải nhuộm dung dòch có màu tương đương với màu gel - Sấy khô gel chân không c) Kết quả: Kết chiết tách tửa phân đoạn enzyme urease nồng độ (NH 4)2SO4 bão hòa khác 38 Các phương pháp phân tích protein Phân đoạn Điện di sắc ký Tổng Tổng Tổng Hoạt tính Độ Hiệu thể tích lượng protein riêng suất thu thu hoạt (mg) (m/g/m/m d/ hồi (%) tính b/ g protein) (ml) (m/g/m e/ c/ ) a/ Chiết thô 45% Dòch 60 60 (NH4)2SO4 Tủa 55% Dòch 60 (NH4)2SO4 Tủa bão hòa 65% Dòch 60 (NH4)2SO4 Tủa bão hòa 75% Dòch 60 (NH4)2SO4 Tủa bão hòa 100 a/ giá trò xác đònh tách chiết b/ giá trò xác đònh đònh lượng c/ xác đònh cách lấy tổng hoạt tính chia cho tổng Protein mẫu d/ độ hoạt tính riêng tương đối phân đoạn xét so với dòch chiết thô ban đầu Độ phân đoạn xét xác đònh cách xem độ dung dòch chiết thô 1, sau hoạt tính riêng phân đoạn xét chia cho hoạt tính riêng dòch chiết thô 39 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký e/ hiệu suất thu hồi Urease phần trăm tương đối hoạt tính urease phân đoạn xét so với hoạt tính enzyme dòch chiết thô ban đầu xác đònh cách xem dòch chiết thô có hiệu suất thu hồi 100% lấy giá trò tổng hoạt tính phân đoạn xét chia cho tổng hoạt tính dòch chiết thô nhân 100%, Đònh lượng acid amin sắc ký giấy a) Nguyên tắc Sắc khí trình tách liên tục chất phân bố không đồng chúng pha tónh pha động cho pha động qua pha tónh pha tónh giấy nước, pha động dung môi hữu Dung môi hữu tác dụng lực mau quản chay qua phần giấy có chứa dung dòch nghiên cứu theo acid amin chuyển chúng vào pha động Những acid amin khác dung dòch vận chuyển với vận tốc khác ảnh hưởng dòng lưu chất Vì sau thời gian thí nghiệm acid amin nằm vùng khác giấy sắc ký Trong sắc ký phân bố, chuyển động chất hỗn hợp tách đặc trưng giá trò Rf tỉ số khoảng cách từ tuyến xuất phất tới tâm vệt sắc ký (a) khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi (b) Nếu acid amin hòa tan nước, hòa tan tốt dung môi hữu dòch chuyển nhanh theo tuyến dung môi R f lớn Ngược lại acid amin hòa tan tốt nước, hòa tan dung môi hữu dòch chuyển chậm có Rf nhỏ Từng acid amin hỗn hơp có tốc độ dòch chuyển khác nên trình tách chúng xảy 40 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký b) Dụng cụ – hóa chất Dụng cụ: • - Máy quang phổ so màu - Micropipette - Tủ sấy - Pipette vạch 1ml, 10ml - Kim chỉ, thước kẻ, bút chì - Becher 50ml - Bình xòt thuốc màu - Ống nghiệm 5lớn, nhỏ - Giấy sắc ký 17x1,2cm - Nút cao su, giấy bạc Hóa chất; • - Dung môi Butanol : acid acetic : nước = 4:1:1 - Ninhydrin 0,2% acetone - CuSO4 0,02 ethanol - Dung dòch acid amin chuẩn: hòa tan vài chục mg acid amin 10 ml nưiớc gồm Valin, Histidin, Alanin - Dung dòch nghiên cứu chứa acid amin cần xác đònh c) Thực hành Chuẩn bò giấy sắc ký: • - Chuẩn bò tờ giấy sắc ký dài 16cm, rộng 1.2 cm - đầu giấy, cách mép giấy 1.5 cm, kẻ đường bút chì theo bề rộng giấy Vẽ vòng tròn đường kính 2-3mm điểm đọan vẽ chì Cố gắng giữ đầu cho thẳng - Vẽ đường bút chì song song cách đường xuất phát 10 cm dùng kim xỏ đầu giấy vqaò cm, gút lại , cắt đọan dài khỏang 10 cm - Cân micropipette có chứa acid amin chuẩn Dùng micropipette chấm giọt vào vòng tròn, sấy để giọt nước không loang khỏi vòng 41 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký tròn Chấm khỏang -10 lần Cân micropipette lại để biết xác lượng acid amin chấm lên giấy Làm với mẫu chuẩn mẫu nghiên cứu Chạy sắc ký: • - lấy ống nghiệm khô, dùng pipette cho vào 1ml dung môi - treo băng giấy lơ lửng ống nghiệm nhờ sợi nắp hình cho mé nhúng vào dung môi băng giấy không chạm vào thành ống nghiệm, đặt ống nghiệm vào giá Chú ý: không dòch chuyển ống nghiệm mạnh sau đặt vào giá, (có thể cho giá ống nghiệm vào tủ ấm 37 – 38oC giấy sắc ký giày) - Cho đến lúc dung môi chạy đến vạch bút chì đầu lấy băng giấy khỏi ống nghiệm, cho vào tủ Hotte 10 – 15 phút để đuổi dung môi - Phun nhúng băng giấy vào dung dòch Ninhydrin, phải phun không nên phun nhiều, vệt màu bò loang lổ Cho vàoo tủ sấy 100 oC -2 phút để xuất vệt màu giấy - Đònh tính acid amin mẫu cách so sánh vò trí vết màu sắc ký đồ dung dòch mẫu với vết màu sắc ký đồ dung dòch chuẩn - Đònh lượng: cắt rời vệt màu acid amin bà chỗ không chứa vệt màu (có dung môi chạy qua) làm mẫu trắng Cắt nhỏ vệt cho vào ống khác có nắp đậy Cho vào ống nghiệm 7ml dung dòch CUSO4 0,02% Ngâm, lắc chiết hết chất màu giấy trở nên trắng Sau đổ dung dòch có màu cam đỏ vào cuvet, đo bước sóng 540nm hay 525nm so với cuvet chứa mẫu trắng d) Tính kết quả: 42 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Hàm lượng acid amin mẫu nghiên cứu tính toán theo độ hấp thu quang học acid amin mẫu ngiên cứu mẫu chuẩn Ví dụ : - Lượng lysine mẫu chuẩn x(mg/ml) - Lượng lysine mẫu nghiên cứu chấm lên giấy y(g) - Cho ml dung dòch nặng 1g lượng lysine chấm lên giấy x.y(mg) - Mật độ quang dung dòch lysine chuẩn A c, lysine mẫu Am lượng lysine mẫu nghiên cứu (x.y.Am) / Ac(mg) 43 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký Phụ lục MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ ĐIỆN DI , SẮC KÝ 44 Các phương pháp phân tích protein Điện di sắc ký ~Kết thúc~ 45 [...]... một protein Vì thế, điện di không những chỉ để nghiên cứu các đặc tính hóa học của các protein nguyên chất mà còn dùng để phân chia và tách một hỗn hợp protein Có các phương pháp điện di sau : - Phương pháp điện di nhờ kính hiển vi - Phương pháp điện di trong dung dòch tự do hoặc các phương pháp giớ hạn linh động - Phương pháp điện di trên các chất mang hoặc phương pháp điện di vùng Trong ba phương pháp. .. nhanh qua cột gel; (C) sự phân tách những phân tử lớn Đo OD từng phân đoạn ở bước sóng 280 nm (đònh lượng protein bằng phương pháp quang phổ) và vẽ đồ thò mối liên quan giữa các phân đoạn và giá trò OD OD Peak Các phân đoạn (ml) Mối liên quan giữa mật độ quang học và cá phân 19 Các phương pháp phân tích protein Điện di và sắc ký Tương ứng với mỗi peak là phân đoạn của một phân tử protein b) Thực hành:... chuyển của các phân tử tích điện, đặc biệt là protein và nucleacid Nguyên tắc của kó thuật điên di 31 Các phương pháp phân tích protein Điện di và sắc ký là dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển vè cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường Sự di chuyển này phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, điện tích, thành phần hóa học của phân tử... tử nho Kết quả là tách được các hợp cha6t1 phân tử có trong lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: cá phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn sẽ ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ sẽ ra sau (A) (B) (C) Hình : Phân tách các phân tử bằng phương pháp lọc gel (A) Mẫu được đưa vào có chứa những phân tử có kích thước lớn và nhỏ; (B) những phân tử những phân tử có kích thước lớn không... thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiothretiol (DTT) Với các tác nhân này protein từ cấu trúc 2,3,4 được biến đổi thành chuỗi 32 Các phương pháp phân tích protein Điện di và sắc ký polypeptide (bậc 1) và tất cả protein đều được tích điện âm Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc kích thước: những phân tử... = C x100 t 22 Các phương pháp phân tích protein Điện di và sắc ký Trong đó: %Hpr: hiệu suất thu nhận protein sau khi qua lọc gel (%) ΣC : nồng độ protein của dung dòch enzyme sau khi lọc gel (mg/ml dung dòch enzyme) Ct : nồng độ protein của dung dòch enzyme trước khi qua lọc gel (mg/ml dung dòch enzyme) C PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI 1 Nguyên tắc và phương pháp điện di Sự chuyển động các phân tử huyền phu øhoặc... ỨNG DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRÊN 1 Phân tích protein bằng điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS – Page) Để kiểm tra mức độ tinh sạch của protein đích sau khi qua quá trình tách chiết và tinh chế người ta sử dụng phương pháp điện di (electrophoresis) Kỹ thuật điện di còn để xác đònh mộtt cách gián tiếp trọng lượng phân tử của phân tử nghiên cứu và có thể tinh chế chúng Điện di là phương pháp nghiên... acid glutamic 17 Các phương pháp phân tích protein Điện di và sắc ký Vẽ đường cong biểu diên của các peak trong sự dung ly, với trục hoành là thứ tự của các ống và trục tung là mật độ quang các ống Từ đường cong này, tính màu ninhydrin tổng cộngcủa peak, nghóa là cộng các mật độ quang của tất cả các ống ấy đem nhân cho 2, ta co màu ninhydrin tổng cộng các phần được dung ly (vì thể tích mỗi phần dung... tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua một cột gel Nhưng phânm tử có kích thước nhỏ sẽ lọt vao bên trong lỗ gel và do đó sẽ di chuyển chậm qua cột, trong khi những 18 Các phương pháp phân tích protein Điện di và sắc ký phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài các hật gel (pha loãng) nên sẽ di chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phần... hơn phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất đònh Trong thực tế để xác đònh phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết Với mục đích đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp