co cac phuong phap kiem tra vi sinh trong thuc pham1

aureus - Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn Hệ thống MPN/gml... Ưu điểm: xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu Nhược điểm:  Không phân b

CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA

VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Vì sao phải kiểm tra vs trong

 Trả lời cho câu hỏi: “Hàm lượng vi sinh vật

trong mẫu là baonhiêu ?”

Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu

Không sử dụng nước cất và nướcmuối sinh

lý để pha loãngmẫu thực phẩm

Các dung dịch pha loãng mẫu

 Saline peptone water (SPW)

Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

 Xđ tế bào sống

 Thạch agar hoặc môi trường lỏng

 MT sử dụng tùy thuộc vào từng nhóm

◦ MT không chọn lọc (mt dinh dưỡng)

 Tổng số vk (ưa nhiệt trung bình, hiếu khí)

1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

Qui trình cho việc phân lập các vsv mục tiêu

1 Đồng hóa mẫu (Stomacher) (1-25g)

◦ Chuẩn bị mt pha loãng 1/10 (ví dụ: 1ml sữa + 9ml dd peptone hay

◦ Qua đêm, 1 CFU/25g có thể phát triển đến 10 5 -10 6 CFU/ml

4 Đỗ đĩa trên mt chọn lọc hoặc khẳng định

◦ Qua đêm

5 +/- MT không chọn lọc

◦ Qua đêm

6 Kiểm tra khẳng định

◦ Hóa sinh hoặc huyết thanh

1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

 Điều kiện nuôi cấy

 Tiết kiệm đĩa

1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

 MPN – most probable number

(Phương pháp số có xác xuất cao nhất)

◦ MT lỏng

◦ Tiêm mẫu vào các ống(3,4 or 5) với lượng mẫu khác

nhau hoặc độ pha loãng khác nhau (10-1, 10-2& 10-3

or 10g, 1g, & 0.1g)

◦ Nuôi cấy và ghi lại hiện tượng (+/-) như khả năng

1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu

hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như

 Sự tạo hơi: Coliforms…

 Sự đổi màu: S aureus

- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong

thể tích mẫu lớn

Hệ thống MPN/g(ml)

Hệ thống MPN/g(ml)

Chuẩn bị cácống nghiệm cóchứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng

Hệ thống MPN/g(ml)

 Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng

bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng

Ưu điểm: xác định nhanh chóng mật độ vi sinh

vật chứa trong mẫu

Nhược điểm:

 Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

 Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu

 Phương pháp lai phân tử

Phương pháp phát quang sinh học ATP

 Dựa vào sự phát quang sinh học

 Cho kết quả rất nhanh: 1minute - <1h

 Ước lượng kết quả tổng

lượng vsv có mặt trong mẫu

Phương pháp phát quang sinh học ATP

Sự phát quang sinh học

- Được thấy rộng rãi trong tự nhiên: đom

đóm, các sinh vật biển (bọt biển, trai )

 Tất cả tế bào sống chứaA

 ATP được phát hiện trong những

sản phẩm này phải có nguồn gốc từ

 Việc phân tích ATP này là một chỉ thị tốt cho

sự có mặt của vsv còn sống

 Phản ứng có tính đặc hiệu cao cho ATP

 Nồng độ ATP trong trong tế bào vsv tương

đối giống nhau (~ 1 fentogram [10-15 g] đối

với tế bào vi khuẩn, ~ 100 fentograms đối với

tế bào nấm men)

Phương pháp phát quang sinh học ATP

 Mối quan hệ đường thẳng giữa ánh sáng

phát ra và nồng độ ATP

 Lượng ATP tỉ lệ thuận với lượng vsv

 Thông thường, mối quan hệ đường thẳng

Phát quang sinh học ATP – Ưu điểm

giá chất lượng vs của tp

Phát quang sinh học ATP – Ưu điểm

 Thiếu tính đặc trưng

◦ Không có sự phân biệt giữa tb vi

khuẩn, nấm men hay nấm mốc

 Kết quả có thể bị nhiễu từ

ATP của cây trồng hay động

vật

◦ Lượng ATP còn lại đôi khi lớn

hơn lượng ATP trong vsv

Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm

 Bị nhiễu từ thực phẩm hoặc các chất trong

chế ATPaza

Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm

 Sự thay đổi của nồng độ ATP trong tế bào sv

◦ Thay đổi trong suốt chu kì sống

 Cần phải có đường chuẩn

◦ Phải được xây dựng cho mỗi sản phẩm

Phát quang sinh học ATP –Nhược điểm

 Kiểm tra độ vô trùng

◦ Sữa UHT milk

 Bước 1: Hỗn hợp được nâng nhiệt đến 95°C để biến tính (denature) ("unzip")

sợi đôi của DNA thành 2 sợi đơn

Picture by Dr Pranee LeechanachaiPCR

 Bước 2: Hỗn hợp được hạ nhiệt độ đến ~55°C (<Tm) để cho phép các mồi

bắt cặp với mạch khuôn

PCR

 Bước 3: Hỗn hợp được nâng nhiệt trở lại đến ~75°C để cho phép TAQ

polymerase tổng hợp những bản sao của mỗi mạch

 http://www.dnai.org/b/index.html (xem phần PCR animation)

Picture by Dr Pranee Leechanachai modifiedPCR

PCR

Độ phân giải thấp trên gel

agarose

Nhuộm Ethidium bromide

không nhạy và không định

lượng được

Chỉ phân biệt kích cỡ của gene

Không định lượng được

 Dựa vào quá trình phát hiện

của huỳnh quang được tạo

ra bởi phân tử báo cáo mà

sẽ tăng khi phản ứng được

báo cáo là huỳnh quang

hoặc thuốc nhuộm liên

kết với DNA (ví dụ:

SYBR green)

Real Time PCR

 Không cần thực hiện

các bước sau PCR nên

tiết kiệm thời gian, hóa

 Thí nghiệm được thực hiện

trong tuyp đóng kín – giảm

sự tạp nhiễm cho sản phẩm

PCR

 Mối quan hệ nghịch đảo giữa

Ct và lượng mẫu ban đầu

-lượng mẫu càng cao, thời

gian để nó bắt cặp với huỳnh

27 th February 2012 MICR3860 Food Microbiology II

 Xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ sở sử

dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc

hiệu với một kháng nguyên và được gắn với

một loại enzym nhất định

ELISA

 Khai thác sự tương tác đặc hiệu giữa

các kháng nguyên (Antigens-Ag) với

một kháng thể (Antibody – Ab) để

hình thành một hệ có thể phát hiện

được

 Quá trình phát hiện dựa vào phản

ứng của các enzym trong thể tiếp

hợp tạo ra các sản phẩm cos màu

ELISA

 Qui trình ELISA sandwich được sử dụng để

phát hiện vi sinh trong thực phẩm

ELISA

Qui trình ELISA Sandwich

 Gắn kháng thể (Ab) đặc hiệu với

chất cần tìm kiếm vào chất mang,

đáy ống nghiệm hoặc khuôn lõm,

rữa những vật liệu không liên kết

 Cho dung dịch chứa chất nghi ngờ

vào (kháng nguyên, Ag)

 Nếu chất cần tìm có mặt trong

dung dịch, Ag sẽ liên kết với kháng

thể, rửa các chất không liên kết

 Cho kháng thể đánh dấu với enzym (E-Ab) đặc hiệu với Ag

đang tìm kiếm

 E-Ab sẽ liên kết với Ag được bắt cặp, rửa

Qui trình ELISA Sandwich

 Cho cơ chất enzym vào

 Đo sự thay đổi màu sắc

 Được sử dụng trong hệ thống đảm bảo

chất lượng (QA) để kiểm tra tình trạng của:

◦ Nguyên liệu thô (sữa)

◦ Môi trường

◦ Sản phẩm cuối cùng (kem)

ELISA - Ứng dụng

ELISA – Ưu điểm

◦ c= Số lượng lớn nhất của đơn vị mẫu bị nhiễm cho

phép (vdu: những mẫu với số lượng >m)

◦ m = số lượng vi sinh lớn nhất có thể chấp nhận

trong 1 đơn vị mẫu

◦ M= Tất cả các mẫu phải có số lượng thấp hơn số

này (nếu 1 hoặc nhiều mẫu trên số này  mẫu bị

loại bỏ)

Giới hạn vi sinh trong thực phẩm

 Do đó lô hàng sẽ bị loại bỏ nếu:

1 Số đơn vị mẫu bị nhiễm vượt quá c

2 Bất kì đơn vị mẫu nào có số lượng vượt quá M

Giới hạn vi sinh trong thực phẩm