các phương pháp định lượng protein

Phương pháp xác định acid amin đầu N, CViệc xác định được amino acid đầu N và đầu C cho phép xác định số lượngsợi polypeptide tạo nên phân tử protein và đánh giá mức độ đồng nhất của mẫu

Seminar GVHD: ThS Nguyễn Thị Thu Sang

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 2 TỔNG QUAN 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ACID AMIN 7

II C ÁC PHẢN ỨNG NHẬN BIẾT CÁC ACIDAMIN ĐẶC TRƯNG 12

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH PROTEIN 28

III P HƯƠNG PHÁP TẠO TỦA VỚI TCA ( ACID TRICLOACETIC ) 32

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN 34

II Đ ỊNH LƯỢNG P ROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU : [4] 41 III Đ ỊNH LƯỢNG P ROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG B ICINCHONINIC A CID (BCA) [10] 49

IV Đ ỊNH LƯỢNG P ROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ :[4] 50

LỜI NÓI ĐẦU

Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sinh vật, nó đượccấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hôpvới nhau bằng các liên kết peptid Tỉ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố nàytrong phân tử Protein như sau: C 50-55; O 21-24;N 15-18; H 6,5 - 7,3; S 0 – 0.24.Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tốkhác như P,Fe,Zn,Cu, Mn,Ca…

Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng mộtcá thể Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống

Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chấtđạm) tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein(comoniac hoặc muối amonium) Để xác định được chúng hiện nay có nhiềuphương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác,người ta áp dụng từng phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp

Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để định tính và định lượngProtein, cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể

PHAÀN I

TOÅNG QUAN

CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN

Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C,O,N,H, một số còn chứa mộtlượng nhỏ S Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử proteinnhư sau: C 50-55; O 21-24;N 15-18; H 6,5 - 7,3; S 0 – 0.24 Ngoài các nguyên tốtrên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P,Fe,Zn,Cu,Mn,Ca…

Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, mổi bậtcấu trúc có cấu trúc và chức năng khác nhau và giử vai trò rất quan trọng dối vớitất cả các cơ thể sinh vật

Để thuận tiện người ta thường cấu trúc thành 4 bậc 1,2,3,4

Cấu trúc bậc 1: là trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong mạch polypeptide

cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết peptide(liên kết cộng hoá trị)

Cấu trúc bậc 2:

Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạchpolypeptide Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạchpolypeptide Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thànhgiữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác định

Cấu trúc bậc 3:

Tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở xa nhau trong mạchpolypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của mạch polypeptide (hình dạngchung của chuỗi polypeptide) Trong nhiều protein hình cầu có chứa các gốc Cys,sự tạo thành các liên kết disunfua giữa các gốc Cys ở xa nhau trong mạchpolypeptide, làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể Các liên kết khác như liên kếtVandecvan,liên kết tĩnh điện, lk hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin …đều tham gia làm bền cấu trúc bậc 3 Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấychính trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thôngtin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc 3.

Cấu trúc bậc 4:

Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu,tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4 Mỗi chuỗipolypeptide gọi là”phần dưới đơn vị ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lựcVandecvan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vị”

PHẦN II

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

ACID AMIN

I Phương pháp xác định acid amin đầu N, C

Việc xác định được amino acid đầu N và đầu C cho phép xác định số lượngsợi polypeptide tạo nên phân tử protein và đánh giá mức độ đồng nhất của mẫuprotein Ngoài ra biết được amino acid đầu N cho phép kiểm soát quá trình táchphân đoạn đối với phân tử protein

I.1 Xác định amino acid đầu N:

Phương pháp Sanger:

Xác định amino acid đầu N được Sanger đề xuất vào năm 1945 gồm các bướcchủ yếu sau:

Dựa vào phản ứng của nhóm ∝ - NH2 của amino acid đầu N với 2,4dinitroftorbenzol tạo ra dẫn xuất dinitrophenyl (DNP) của amino acid cần xác địnhcó màu vàng

Sau đó tiến hành thuỷ phân bằng acid HCl 5,7N cắt toàn bộ amino acid cómặt trong sợi polypeptide và dẫn xuất màu vàng của DNP – aminoacid đầu N.Tách dẫn xuất trên bằng cách chiết suất eter và xác định dẫn xuất trên là củaamino acid nào bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

Sơ đồ phương pháp Sanger

Phương pháp Dansyl:

Do harly đề ra vào năm 1963, bản chất của phương pháp này cũng tương tựphương pháp Sanger gồm các bước:

Đầu tiên cho dansylchloride tác dụng với nhóm NH2 của amino acid đầu N tạo

ra dansyl-peptide Tiến hành thủy phân sợi polypeptide bằng acid HCl 5,7N ởù

105°C trong khoảng 12- 16 h sẽ giải phóng phức dansyl-amino acid đầu N pháthuỳnh quang ở λ = 365 nm Sau đó xác định dansyl- amino acid là phương pháp sắcký bản mỏng 2 chiều hoặc gần đây người ta sử dụng phương pháp sắc ký cột lỏngngược pha có độ phân giải cao sử dụng detector huỳnh quang

As p

Le u

Ar g

Th r

O2N

NO2

Al a

Gl y

As p

Le u

Ar g

Th r

O2N

NO2

Al a

Gl y

As p Le u

Ar g Th

r

HCl

Sơ đồ phương pháp Dansyl

Phương pháp Edman:

Phương pháp này cho phép xác định lần lượt thứ tụ amino acid từ đầu N nhờphản ứng của nhóm NH2 của amino acid đầu N với phenyllisothiocyanate (PITC ) Gồm hai giai đoạn:

HH

R1

R2

R3

OO

H3C CH3

NS

HCl

amino acid đầu N, tách và xác định dẫn xuất bằng phương pháp sác ký bản mỏng ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp enzyme aminopeptidase.

I.2 Xác định amino acid đầu C:

Phương pháp hydrazyl hoá :

Do giáo sư Akabori đề xuất Bản chất của phương pháp này là người ta chohydrazine tác động với nhóm cacbonyl của amino acid đầu C tách phức trên bằngphương pháp sắc ký bản mỏng và xác định tên của amino acid Tuy nhiên phươngpháp này có hạn chế là một số amino acid bị phân hủy khi tạo phức hợp vớihydrazine ở nhiệt độ khá cao 100 = 120oC

Phương pháp oxazolone:

Do nhà khoa học người Nhật Matsuo đề xuất Bản chất của phương pháp nàylà: cho nhóm COOH của amino acid đầu C tác động với acetate anhydride tạo racấu trúc mạch vòng oxazolone Trong môi trường kiềm cho một nguyên tử H củamạch vòng này trao đổi với đông vị H3 tạo ra dẩn xuát phóng xạ Tiến hành sắc kýđể tách và xác định amino acid đầu C trên nhờ phương pháp chụp phóng xạ

Ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp thủy phân nhờ enzymcarboxypeptidase để cắt riêng và xác định amino acid đầu C

R1

II Các phản ứng nhận biết các acidamin đặc trưng

II.1 Phản ứng ninhydrin :[4]

Nguyên tắc:

Tất cả các α-acid amin của protein đều phản ứng với ninhydrin tạo thành hợpchất màu xanh tím(hấp thụ cực đại ở bước sóng 570nm) Phản ứng này rất nhạy cóthể phát hiện đến microgram acid amin,vì vậy được dùng nhiều trong phân tíchđịnh tính và định lượng acid amin(trong phương pháp sắc kí và điện di) Cơ chếphản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất Có thể nêu một số phảnứng chính như sau:

Dưới tác dụng của ninhydrin ở nhiệt độ cao,acid amin tạo thành NH3,CO2 vàandehit tương ứng có mạch carbon ngắn hơn acid amin 1 carbon;ninhydrin chuyểnthành aminodixetohydrinden

O

O

OH OH

O

O

O OH

O

Đặc biệt riêng aminoacid như prolin khi tạo phức chất với ninhydrin sẽ cómàu vàng, khác biệt hẳn với màu do acid amin khác tạo nên trong phản ứng Dovậy,ninhydrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưng để phát hiện prolin

O

O

HN COOH

Nguyên liệu và hóa chất: dung dịch lòng trắng trứng 1%,prolin 1%,dung dịch

ninhydrin 0.1% pha trong axeton 95%

Lấy 2 ống nghiệm cho vào ống 1 : 1ml dung dịch lòng trắng trứng 1%,ống 2:1ml prolin 1%,thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch ninhydrin đun sôi trong 1-2 phút.Quan sát màu trong 2 ống,giải thích kết qủa nhận được

Có thể làm phản ứng trên giấy lọc như sau: nhỏ 1 giọt dung dịch prolin hoặcprotein (lòng trắng trứng 1%) lên giấy,sấy khô cho thêm 1 giọt thuốc thửninhydrin,sấy khô bằng máy sấy.Quan sát màu tạo thành

II.2 Phản ứng Xantoprotein với acid amin vòng:[4]

II.3 Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin.[4]

Nguyên tắc:

Thuốc thử Millon là hỗn hợp các muối Nitrat và nitric thủy ngân được hòa tantrong HNO3 Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol của tyrozin sẽ tạo nên hợpchất nitrotyrozin thuỷ ngân có màu đỏ

Phản ứng Millon được dùng để phát hiện tyrozin và các hợp chất phenol

CH2

NH2C

O N

Thực hành:

Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 1%, gelatin 1%.

Thuốc thử Millon được điều chế như sau: hòa tan 40g thủy ngân trong 57 mlHNO3 đậm đặc, sau đó đun nhẹ (50 oC) trong nồi cách thủy đến khi thủy ngân tanhoàn toàn Dung dịch được pha loãng gấp đôi bằng nước cất, thêm 1ml KNO2 hoặcNaNO2 1%, khuấy đều, để lắng, gạn lấy dịch trong

Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống 1 : 1ml dung dịch lòng trắng trứng 1%,ống 2:1ml gelatin 1% Thêm vào mỗi ống 1ml (hoặc 6 giọt) thuốc thử Millon,lắc đều, đunnhẹ cho đến khi xuất hiên màu trong ống 1 So sánh kết quả trong 2 ống giải thích

Chú ý: Không cho quá nhiều thuốc thư ûMillon vì HNO3 có trong thuốc thử sẽtác dụng với protein cho màu vàng

II.4 Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho tryptophan.[4]

O C H H

+

H2 N

CH2CH COOH

N H

H2SO4

- H2 O 2

Thực hành:

Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch lòng trắng trứng 1%, gelatin 1%, acid

acetic đặc, H2SO4 đặc, CuSO4 đặc, formaldehid,saccharose 1%

 Phản ứng với acid glioxilic

Lấy 2 ống nghiệm,cho vào ống 1: 1ml dung dịch lòng rắng trứng 1%,ống 2 :gelatin 1%,thêm vào cả 2 ống 1 ml axit axetic đặc(có chứa acid glioxylic ở dạngvết),lắc đều thêm vài giọt CuSO4 rồi tiếp tục lắc.Cầm nghiêng ống nghiệm,nhỏtheo thành ống 1ml H2SO4,cho chảy xuống từ từ.Quan sát sự xuất hiện vòng tím ởmặt phân cách hai chất lỏng ở ống 1 Giải thích sự sai khác giữa hai ống.

Phản ứng với oximetylfucrurol(được hình thành do saccharose bị thủy phânmất nước dưới tác dụng của CuSO4 đặc)

Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch lòng trắng trứng 1%,thêm vài giọtsaccharose 1% và CuSO4 5%,lắc đều.nhỏ theo thành ống nghiệm 1ml H2SO4

đặc.Quan sát sự hình thành sản phẩm có màu

 Phản ứng formaldehid:

Cho vào ống nghiệm 2 ml dung dịch lòng trắng trứng 1% thêm vài giọt

formaldehid loãng và CuSO4 5%,lắc đều.Nhỏ theo thành ống nghiệm 1ml H2SO4

đặc.Quan sát sự hình thành sản phẩm có màu.CuSO4 có tác dụng làm tăng độ nhạycủa phản ứng

II.5 Phản ứng Sakagichi đặc trưng cho arginin [4]

Nguyên tắc:

Đây là phản ứng phát hiện arginin : khi tác dụng với hypobromit(NaBrO) và

α-naphtol,arginin sẽ tạo sản phẩm màu đỏ cam

N H

O

O H

Thực hành:

Nguyên liệu và hóa chất : arginin 1%,α-naphtol 2% pha trong etanol 96%(trước khi dùng pha loãng 10 lần bằng cùng loại dung môi) NaOH 10% và 5%Dung dịch hypobromit (NaBrO) được chuẩn bị như sau: hòa tan 1g Brom trong50ml NaOH 5% ( thao tác trong điều kiện lạnh) Bảo quản thuốc thử trong tủlạnh,thời gian sử dụng 2 tuần

Cho vào ống nghiệm 2ml arginin, 2ml NaOH 10%,vài giọt α-naphtol, lắc đềuthêm 0,5 ml hypobromit, lắc, màu đỏ xuất hiện

II.6 Phản ứng của các acid amin chứa lưu hùynh( phản ứng Folia).[4]

Nguyên tắc

Các acid amin chứa lưu hùynh như cystin, cystein, methionin dưới tác dụngcủa kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfua( Na2S):

RSH + 2 NaOH Na2S + ROH + H2OThêm chì acetat và Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sulfua( PbS):

Na2S + Pb(CH3COO)2 2(CH3COO)Na + PbS

(kết tủa màu đen)

Thực hành

Nguyên liệu và hóa chất:

Dung dịch lòng trắng trứng 1%, NaOH 10%, chì acetat 1%, cho vào ốngnghiệm 2ml dung dịnh lòng trắng trứng 1% và 2ml NaOH 10% Đun sôi trong baphút Lắc đều thêm vài giọt Pb(CH3COO)2 1% Quan sát sự tạo thành kết tủa,

II.7 Phản ứng của prolin với thuốc thử Isatine [4]

Nguyên liệu và hóa chất:

Dung dịnh prolin và exiprolin 0,1% pha trong acid đặc Thuốc thử isatine gồmhỗn hợp các dung dịnh : Isatin 0,2 %, CdCl 0,06 % và acid acetid 4% trong aceton.Cũng có thể chuẩn bị một cách đơn giản hơn bằng cách pha dung dịnh Isatin 0,2 %trong acid acetic đặc

Chấm dung dịnh prolin lên giấy lọc Hơ nhẹ cho tới khô Sau đó phun thuốcnhư Isatine lên giấy, sấy nhẹ, sẽ xuất hiện màu xanh lơ đậm Nếu chấm oxiprolinthì sẽ hiện ra màu xanh nhạt

II.8 Phản ứng Pauli để phát hiện histidin và tyrozin [4]

Nguyên tắc

Khi tác dụng với acid diazobenzosunfonic ( thuốc thử diazo), histidin tạothành phức chất màu da cam

Công thức của phản ứng như sau:

Sự tạo thành aciddiazobenzosunfonic:

N

H

O N

H

N H

N H

N H

N H

COOH O

Phản ứng của histidin:

Phản ứng của tyrozin:

Nguyên liệu và hóa chất : dung dịnh histidin và tyrozin chuẩn 0,1%, Na2CO3

10% , thuốc thử Pauli: hòa tan 1g acid sunfanilic trong 100ml HCL 1N, sau đó trộnvới 10ml dung dịnh nitrit natri 0,7% trong nước cất

Nhỏ dung dịnh histidin hoặc tyrozin lên giấy lọc, sấy nhẹ cho khô, sau đóphun thuốc thử Pauli lên, làm khô giấy Cuối cùng phun lên giấy dung dịnh Na2CO3

10% quan sát, so sánh và giải thích các kết quả nhận được

II.9 Phản ứng với acid nitơ (HNO2) (phương phápVan Slyke) [4]

Nguyên tắc

Dưới tác dụng của HNO2 , acid amin bị dezamin dezamin hóa tạo thành nitow

ở dạng khí Phản ứng này được sử dụng để định lượng các α-acid amin( phươngpháp Van Slyke)

Phản ứng xảy ra như sau:

II.10 Phản ứng với nitơ pruxit đặc trưng cho các acid amin, protein chứa lưu huỳnh [4]

Nguyên tắc

Phản ứng diễn ra tương tự như phản ứng Folia, nhưng ở phản ứng này, natrinitropruxit thay thế vị trí của chì axetat

Nguyên liệu và hóa chất : cystein 0,1 % , albumin 1% , NaOH 30 % , natri

nitropruxit 10% : chỉ pha trước khi dùng

Lấy hai ống nghiệm , cho vào ống 1: 1ml cystein 0,1%, ống 2 : 1ml albumin1% thêm vào mỗi ống 1ml NaOH 30%, đun sôi trong vài phút , để nguội , cho vàovài giọt thuốc thử natri nitropruxit 10%, lắc đều , quan sát sự sự xuất hiện màu ởống 1 và ống 2, so sánh và giải thích kết quả

III Phương pháp định lượng acid amin

III.1 Phương pháp Formol

Nguyên tắc:

Các axit amin, ogligopeptit trong dung dịch nước thì trung tính do hai nhóm axit (-COOH ) và amin (-NH2 ) trung hòa lẫn nhau và do cả hai nhóm chức đều yếu, quá trình điện ly kém Khi gặp formol, nhóm amin kết hợp với formol thành

metylen (-N=CH2) mất tính chất kiềm, nên tính axit của nhóm (–COOH ) nổi bật lên và có thể định lượng bằng một chất kiềm với phenolphtalein làm chỉ thị màu.

Các nhóm carbonxyl tự do bằng số nhóm amin liên kết với formol, khi chuẩnđộ nhóm carbonxyl thì xác định được nhóm amin Vì vậy cho phép định lượng được amino axit trong dung dịch nghiên cứu

Cách tiến hành:

• Chuẩn độ bằng NaOH O,1N đến khi màu vàng xuất hiện trở lại

• Thí nghiệm trên cùng được tiến hành tương tự với các hóa chất trên nhưng thay thế dung dịch amino axit bằng nước cất cùng thể tích

Tính kết quả:

1 ml dd NaOH 0,1N tương đuơng 1,4 mg nitơ Số mg nitơ amin của dd nghiên cứu đuợc tính theo công thức:

N = (A – B) x 1,4 (mg)trong đó A : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm

B : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra

Ngoài ra ta còn có thể tiến hành theo cách khác

Hoá chất:

• Dung dịch NaOH 0,2N

• Dung dịch Ba(OH)2 bão hòa trong cồn metylic

• Dung dich phenolphthalein 1% trong cồn

• BaCl2 tinh thể

• Dung dich dinatriphotphat 0,1N (chức 17,91g Na2HPO4.12H2O trong 1lít nước)

• Dung dịch formol trung tính 30%

Tiến hành

Cân chính xác m(g) mẫu đã xay nhuyễn (hoăc V(ml) mẫu ở dạng lỏng) cho vào bình định mức 100ml với 50ml nước cất,lắc mạnh trong 10 phút để hòa tan.Cho thêm 0,5ml phenolphthalein, 2g BaCl2 tinh thể và từng giọt Ba(OH)2 chođến khi có màu hồng nhạt Sau đó thêm 5ml Ba(OH)2 để kết tủa các muối

phosphate và carbonat Cho nước cất vừa đủ 100 ml Lắc đều và lọc

Lấy 25ml dịch lọc, cho vào bình erlen với 20ml dung dịch formol trung tính Chuẩn độ bằng NaOH 0,2N cho đến khi có màu đỏ tươi

 Ghi chu ù:

Điểm chuyển màu rất khó nhận biết Do đó dùng 100ml dd NaHPO4 0,1N trộng đều với 0,5ml phenolphthalein 1% để có màu đỏ tươi làm mẫu so sánh điểm tương đương

Kết quả:

• Nếu nguyên liệu là chất rắn

Hàm lượng nitơ formol trong 100g mẫu:

N formol (g) = 0,0028.V1.100/25.100/m

• Nếu nguyên liệu là chất lỏng :

N formol (g) = 0,0028.V1.100/25.100/VTrong đó:

0.0028 : số gam nitơ tương ứng với 1 ml NaOH 0,2N

v1 : thể tích NaOH 0,2N dùng cho việc chuẩn độ (ml)

m hay V: khối lượng (g) hay thể tích(ml) mẫu

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:

Độ nhạy:

Phương pháp định lượng bằng chuẩn độ formol có độ nhạy không cao vì không thể sử dụng để định lượng với mẫu có chứa muối amoni Khi gặp formol làmcho dung dịch trở thành axit, do hình thành hexametylen tetramin và HCl theo phảnứng :

4NH4Cl + 6HCHO (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl

Khả năng ứng dụng:

Phương pháp chuẩn độ Sorensen được sử dụng để định lượng amino axit trongdung dịch nghiên cứu Nhưng phương pháp nàykhông cho kết quả chính xác giá trị nitơ amin Vì nếu trong dung dịch có prolin, nó sẽ liên kết không bền với formol nên làm giảm kết quả định lượng Ngược lại nếu dung dịch không có tyrosin, nó lạilàm tăng kết quả định lượng v1 nó có nhóm phenol

III.2 Phương pháp sắc ký giấy [4]

Nguyên tắc

Khi chấm một hỗn hợp các acid amin lên một tờ giấy lọc rồi nhúng đầu tờgiấy vào một dung môi thích hợp (phenol, butanol, …) thì dung môi sẽ thấm trên tờgiấy và kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp trên chiều dài của tờ giấy Mỗi acidamincó một hệ số phân bố riêng giữa pha di động vàpha tĩnh Kết quả là hỗn hợp acidamin được phân tích ra thành từng acid amin riêng biệt

Dùng thuốc thử phun lên giấy, sẽ thể hiện màu tại các vết ứng với các chất

Ta sẽ nhận được vị trí của từng acid amin được tách ra khỏi hỗn hợp Trong nhữngđiều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ, loại giấy, …), tốc độ di chuyển của dungmôi và các cấu tử của hỗn hợp được đặc trưng bởi hệ số Rf

Rf =( khoảng dịch chuyển của cấu tư)û/ (khoảng dịch chuyển của dung môi)

Cách tiến hành

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

Nguyên liệu: Các acid amin chẩn (hỗn hợp MI): dung dịch nguyên cứu

Thiết bị: Bình sắc ký, giấy chạy sắc ký: Whatman – 1

Hóa chất: Dung môi cho sắc ký thường là hỗn hợp nhiều chất khác nhau.

Ví dụ: butanol: acid acetic: H2O với tỉ lệ 5:2:3

100g Isatin trong 50ml n – butanol chứa 5% acidacetic đậm đặc

Thuốc thử Ninhydrin: dung dịch 0,2% ninhydrin trong aceton.

Các bước tiến hành

• Bước 1: Chuẩn bị giấy sắc ký:

Trên giấy vẻ hai vòng tròn đồng tâm có đường kính lần lược là 12,8cm và2cm vẽ đường kính thẳng góc AB cà CD và chấm các amino acid theo như hình vẽ.Cắt bằng dao lam theo đường kính AB một đoạn bằng 2mm về bên này và bên kiatâm O

Cắt một miếng giấy khác kích thước 40 x 12mm, gấp là ba dọc theo chiều dàivà cắt nhọn một đầu ta dược một lưỡi gà

Phần I: để làm hiện ra với thuốc thử Sakaguchi (AC)Phần II: để làm hiện ra với thuốc thử Isatin (CB)

M1: hỗn hợp acid amin (hỗn hợp nguyên cứu)

Phần III: để làm hiện ra với ninhydrin (AB)

• Bước 2: Chấm dung dịch acid amin

Trước khi chấm dung dịch acid amin cần phải rửa giấy sắc ký Dung dịch rửagiấy sắc ký thường sử dụng là 8-oxyquinolin 0,1% trong aceton hay trilon B 0,1%trong nước Sau khi rửa, sấy khô giấy sắc ký, dùng một ống mao quản: chọn đầunhỏ và nhọn, tráng bằng nước cất vài lần, làm khô cẩn thận Lấy dung dịch acidamin và chấm lần lược trên các vị trí đã vẽ trên giấy Mỗi điểm chấm không đượclớn quá 2mm, và sau mổi lần chấm phải hơ khô bằng máy sấy, mổi điểm chấm từ 3– 4 lần Rửa lại ống mao quản bằng nước cất trước khi chấm acid amin khác

• Bước 3: Tiến hành chạy sắc ký

Sau khi chấm xong, đặc lưỡi gà vào đường đã rạch sẵn ở tâm O và để giấysắc ký vào bình sắc ký, cắm miếng lưỡi gà vào cốc sứ nhỏ trong bình sắc ký (cóchứa dung môi sắc ký) Đậy kín bình sắc ký và bắt đầu tính thời gian Sau một giờmức dung môi còn cách bờ giấy sắc ký tứ 1-2cm lấy giấy sắc ký ra, bỏlu7o7i4 gàvà làm khô giấy sắc ký bằng máy sấy.

• Bước 4: Xác định acid amin bằng thuốc thử

Dùng kéo cắt giấy sắc ký ra thành ba phần theo những đường chấm và tiếnhành nhuộm

Phần I được làm hiện bằng thuốc thử Sakaguchi Đầu tiên nhuộm bằng thuốcthử Sakaguchi I, sau đó làm khô và nhuộm lại lần hai bằng thuốc thử Sakaguchi IIvà làm khô bằng máy sấy Arginine sẽ hiện ra với màu đỏ trên nền vàng

Phần II được làm hiện lên bằng thuốc thử Isatin Sau khi sấy khô, Prolin sẽhiện ra với màu xanh đậm trên nền vàng

Phần III được làm hiện bằng ninhydrin Sau khi làm khô các vùng có acidamin sẽ hiện thành màu tím trên nền trắng

Dựa vào các thành phần acid amin xuất hiện trên giấy sắc ký.Xác định thànhphần acid amin có trong dung dịch

PHẦN III

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH

TÍNH PROTEIN