Các phương pháp định lượng protein

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Mục lục LỜI NÓI ĐẦU .3 I TOÅNG QUAN: .4 CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN: 1.1 Cấu trúc bậc 1: 1.2 Cấu trúc bậc 2: 1.3 Cấu trúc baäc 3: 1.4 Cấu trúc bậc 4: II CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN ĐỊNH LƯNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 1.1 Định lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 1.2 Định lượng nitơ phi Protein: 12 1.3 Định lượng Protein nguyên liệu: 13 ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 13 2.1 Định lượng Protein theo phương pháp Biure 13 2.2 Định lượng Protein phương pháp Lowry (Biure cải tiến): 16 2.3 Định lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G - 250): 19 ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID (BCA): 22 3.1 Nguyên tắc: 22 3.2 Cách tiến hành: 22 3.3 Tính kết quả: 22 3.4 Độ nhạy khả ứng dụng: 22 ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 23 4.1 Nguyên tắc: 23 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam 4.2 Cách tiến hành: 23 4.3 Tính kết quả: 24 4.4 Độ nhạy khả ứng dụng: 24 PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): 25 5.1 Nguyên tắc: 25 5.2 Độ nhạy khả ứng dụng: 25 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG AMONIAC 25 6.1 Nguyên tắc: 25 6.2 Cách tiến hành: 26 6.3 Tính kết quả: 27 6.4 Khả öùng duïng: 27 PHƯƠNG PHÁP DUMAS: 27 7.1 Nguyên tắc: 28 7.2 Thiết bị: 28 7.3 Cách tiến hành: 29 PHƯƠNG PHÁP PRM (PYROGALLOL RED MOLYBDATE): 31 8.1 Nguyên tắc: 31 8.2 Duïng cuï: 32 8.3 Tiến hành: 32 III SO SÁNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN 33 SO SÁNH MẪU BIA CÓ VÀ KHÔNG QUA THẨM TÍCH 33 KẾT LUẬN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam LỜI NÓI ĐẦU Protein thành phần thiếu tất thể sinh vật, cấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm L-axit amin kết hợp với liên kết peptid Tỉ lệ phần trăm khối lượng nguyên tố phân tử Protein sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: – 0.24% Ngoài nguyên tố số protein chứa lượng nguyên tố khác P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… (Sách Hóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc Tú- NXB khoa học kó thuật HN, trang 94) Protein có đặc tính đặc thù cao cho loài, quan mô cá thể Protein đa dạng cấu trúc chức thể sống Trong mô tế bào sinh vật thành phần Protein (chất đạm) tồn nhiều dạng khác như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein (comoniac muối amonium) Để xác định chúng có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác tùy theo chiều hướng muốn khảo xác, người ta áp dụng phương pháp thích hợp trục tiếp gián tiếp Seminar trình bày số phương pháp dùng để định lượng Protein, với số lưu ý sử dụng phương pháp cụ thể Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam I Tổng quan: Cấu tạo phân tử Protein: Tất protein chứa nguyên tố C, O, N, H, số chứa lượng nhỏ S Tỉ lệ phần trăm khối lương nguyên tố phân tử protein sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: – 0.24% Ngoài nguyên tố số protein chứa lượng nguyên tố khác P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… Protein có thành phần phức tạp có nhiều bật cấu trúc khác nhau, bật cấu trúc có cấu trúc chức khác giữ vai trò quan trọng tất thể sinh vật Cấu trúc protein chia thành bậc: 1, 2, 3, 1.1 Cấu trúc bậc 1: Là trình tự xếp gốc acid amin mạch polypeptide Cấu trúc giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hoá trò) O + O + +H3N – CH – C H3N – CH – C O- R1 R2 O O + O H3N – CH – C – NH – CH – C R1 + H2O O– R2 Liên kết peptide H H H O H H H O H – HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – R1 O R2 H R3 O R4 H R5 Caùc phương pháp định lượng protein 1.2 GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Cấu trúc bậc 2: Là tương tác không gian gốc acid amin gần mạch polypeptide Nói cách khác không gian cục phần mạch polypeptide Cấu trúc làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro tạo thành liên kết peptide gần cách khoảng xác định Các phương pháp định lượng protein 1.3 GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Cấu trúc bậc 3: Tương tác không gian gốc acid amin xa mạch polypeptide, dạng cuộn lại không gian mạch polypeptide (hình dạng chung chuỗi polypeptide) Trong nhiều protein hình cầu có chứa gốc Cys, tạo thành liên kết disunfua gốc Cys xa mạch polypeptide, làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể Các liên kết khác liên kết Vandecvan,liên kết tónh điện, liên kết hidro mạch bên gốc acid amin … tham gia làm bền cấu trúc bậc Kết nguyên cứu nhiều protein cho thấy trình tự xếp gốc acid amin chuỗi polypeptide chứa thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc 1.4 Cấu trúc bậc 4: Đối với phân tử protein bao gồm hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu, tương tác không gian chuỗi phân tử gọi cấu trúc bậc Mỗi chuỗi Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam polypeptide gọi là”phần đơn vị ” chúng gắn với nhờ liên kết hidro, lực Vandecvan nhóm phân bố bề mặt “phần đơn vị” II Các phương pháp định lượng protein Định lượng nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl Theo nguyên tắc Protein định lượng cách xác định lượng nitơ tổng số kết nhân với 6.25, nghóa coi Protein chứa 16% nitơ (vì phân tử Protein hàm lượng nitơ tương đối cao ổn định khoảng 15 – 17%) Trong thực tế bên cạnh Protein thật có chất hữu khác có chứa nitơ như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric….Các chất gọi nitơ phi Protein Vì trường hợp cần phải xác định nitơ tổng số nitơ phi Protein sau xác định nitơ Protein Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein  Nitơ protein = Nitơ tổng số – Nitơ phi protein 1.1 Định lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl Nguyên tắc: Quá trình gồm giai đoạn:  Giai đoạn vô hóa: (quá trình tiến hành tủ hotte) nhiệt độ cao tác dụng H2SO4 hợp chất có chứa nitơ bị phân hủy bị oxi hóa đến CO2 H2O , nitơ chuyển thành amoniac (NH3) kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate  Giai đoạn cất đạm: (quá trình xảy máy cất đạm) Sau vô hóa ta đuổi NH3 khỏi dunh dịch NaOH (NH4)2SO4 + NaOH  Na2SO4 + NH3 + H2O Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Lượng NH3 sinh lôi máy Parmas dẫn đến erlen có chứa lượng thừa H2SO4 biết xác nồng độ Lúc NH3 tác dụng với H2SO4 chuyển thành (NH4)2SO4 NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 + H2SO4 dư Sau chuẩn độ lượng H2SO4 lại dung dịch NaOH qua tính lượng nitơ có mẫu NaOH + H2SO4  Na2SO4 + H2O Cách tiến hành: Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị:  Nguyên liệu: mẫu cần xác định hàm lượng Protein, nguyên liệu khô cần sấy khô tuyệt đối (105oC, 30 phút)  Hóa chất: hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (9:1), H2SO4 đặc, H2SO4 0,01N, H3PO3 2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96o, acid tricloacetic (TCA), thuốc thử đỏ metyl  Thiết bị: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger (chen hình vào) Quá trình thực qua bước  Bước 1: vô hóa mẫu (được tiến hành tử hotte để tránh khí độc SO 2, CO2) Nếu mẫu khô cân 0,1 -0,3g mẫu dùng ống giấy (không tro) cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào vài giọt nước cất vô đạm để thấm ước bột Nếu mẫu chất lỏng dùng pipet lấy – ml,nếu nước hộp nên lấy 10 – 20ml tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK2SO4/CuSO4 (hoặc selen, hay H2O2 30%, hay HCLO4 70%) 10ml H2SO4 đặc Để bình Kjeldahl bếp điện đặt tủ hotte đun dung dịch trở nên suốt có màu xanh da trời nhạt Lấy để nguội Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần nước cất vô đạm định mức đến vạch định mức  Bước 2: Cất đạm Sơ đồ máy cất đạm Rửa máy: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình mở nước vào ống làm lạnh D, khóa điều đóng, sau cho lên phiểu C nước cất (khoảng 10 ml) cho chảy xuống bình B khóa van lại Hơi nước bình A từ từ qua erlen E, để E có khoảng 5ml nước Ngắt điện bình A, nước máy nguội lại,làm giảm áp xuất A B nước bình B rút qua G nước rút hết, thêm nước vào phiễu C mở van cho nước chảy vào B, kế nước rút qua G ta làm vài lần Nếu nước bình G đầy mở van cho nước rút Khóa van lại Cất đạm: lấy vào erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dòch H2SO4 0,01N giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dịch có màu tím đỏ Đặt bình hứng cho đầu mút ốngsinh hàn D ngập dung dịch H2SO4 0,01N erlen E Hút 10ml dung dịch vô hóa pha loãng cho lên phiễu C đun sôi bình A, mở van để dung dịch chảy từ từ xuống B, đóng van lại Đổ nước cất vào tráng C, mở van thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam giọt mực nước C xuống gần sát tới van khóa van lại Rửa C lần với thao tác tương tự Thêm vào phiễu C 10ml NaOH đậm đặc Mở van từ từ NaOH chảy xuống C giọt Nếu nước B trào mạnh khóa van lại, tiếp tục cho chảy từ từ đến NaOH chảy gần hết xuống B Tráng phiễu C hai lần với nước cất, cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp mà Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau hạ erlen E xuống cho đầu mút ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp phút Rửa đầu nhọn ống làm lạnh D tia nước bình xịt Lấy erlen E rửa lại máy vài lần chuẩn độ lượng H2SO4 thừa dung dịch chuẩn NaOH 0,01N  Bước 3: chuẩn độ Lượng H2SO4 dư bình E chuẩn độ NaOH 0,01N trình chuẩn độ kết thúc dung dịch chuyển từ đỏ sang màu nhạt Xác định hệ số hiệu chỉnh x: lấy erlen cho vào erlen 20ml H2SO4 0,01N vài giọt đỏ metyl Sau chuẩn độ NaOH 0,01N lấy giá trị trung bình lần chuẩn độ Tính kết quả: Hệ số chỉnh x tính theo công thức sau: x tỉ số thể tích H2SO4 0,01N thể tích NaOH tiêu tốn chuẩn độ Hay tỉ số nồng độ thực tế nồng độ tinh toán cuả NaOH Hàm lượng nitơ mẫu đượctinh1 theo công thức: X=  v0  v1 * x  *0, 0014*100*100 10* m Trong đó: X: % khối lượng nitơ mẫu Vo: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 V1: số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa 10 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Tiến hành: Hóa chất: Chuẩn bị dung dịch mẫu Protein cần xác định Dung dịch Albumin chuẩn 1mg/ml Cách pha dung dịch Albumin: Cân xác 10mg Albumin pha 1ml nước cất lắc cho tan hết giữ 20oC Khi dùng pha loãng 100 lần để dung dịch Albumin 0,1mg/ml Pha thuốc thử Bradford: Cân 0,001g Coomassie Brilliant Blue 4,7g Ethanol 99o 8,5g Acid Phosphoric 85%, định mức tới 100ml nước cất Đựng chai có nút đậy kín Thiết bị: máy đo màu quang điện Tiến hành: Lập đồ thị chuẩn: Lấy ống nghiệm đánh số từ đến cho vào chất theo bảng sau: Thuốc thử Dung dịch Albumin Nước cất Nồng độ Albumin 0.1mg/ml (ml) (ml) (µg) 1 0,1 0,9 10 0,2 0,8 20 0,3 0,7 30 5 0,4 0,6 40 0,5 0,5 50 ng số Bradford (ml) Bảng 2: lập đồ thị chuẩn dung dịch Albumin Lắc điều để yên lúc sau đem đo độ hấp thu ống bước sóng 595nm Từ xây dựng đồ thị chuẩn 20 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Chuẩn bị ống thí nghiệm: Ống thí nghiệm: 0,1ml dd Protein + 5ml dd Bradford Ống đối chứng: 0,1ml nước cất + 5ml dd Bradford (Có thể thay nước cất NaCl 0,15M) Đem đo độ hấp thu bước sóng 595nm ghi nhận mật độ quang (mật độ quang phải nằm khoảng đường chuẩn) Tính toán Từ bảng ống ống đối chứng ,vì lập đồá thị ta lấy trị số mật độ quang ống từ – trừ mật độ quang ống Đó độ hấp thu thực dung dịch Protein chuẩn,từ ta lập đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn Với trục hoành nồng độ Protein trục tung mật độ quang Tương tự độ hấp thu thật Protein có ống thí nghiệm trị số mật độ quang ống thí nghiệm trừ ống đối chứng Sau đối chiếu vào đường cong mẫu suy lượng Protein có mẫu thí nghiệm Độ nhạy khả ứng dụng Phương pháp dùng cho Protein tan nước, phản ứng xảy nhiệt độ phòng Phương pháp nhạy 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh đơn giản nhiều cho phép xác định tới vài µg protein/ml đồng thời làm giảm ảnh hưởng muối, đệm, chất khử…Tuy nhiên phương pháp không dùng với chất có chứa surfactants gây kết tủa chất phản ứng Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết Màu Coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ quang 21 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Định lượng Protein phương pháp dùng Bicinchoninic Acid (BCA): 3.1 Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng Protein thuốc thử BCA môi trường kiềm tạo màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại bước sóng 562nm Hình : Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA) Đầu tiên Protein khử Cu2+ thành Cu+ tạo thành phức có màu xanh môi trường kiềm Sau hai phân tử BCA kết hợp với Cu+ tạo cho màu đỏ tía (tím) có độ hấp thu bước sóng 562nm 3.2 Cách tiến hành: Cách tiến hành tương tự phương pháp Biure thay thuốc thử Biure thành thuốc thử BCA 3.3 Tính kết quả: Cách tính kết tương tự phương pháp Biure 3.4 Độ nhạy khả ứng dụng: Phương pháp nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure Nó phát Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg Nhưng tạp chất có hàm lượng Cu 22 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam dù bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết hợp chất hữu phân tử có aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết Định lượng Protein phương pháp quang phổ 4.1 Nguyên tắc: Dựa vào hấp thụ tia cực tím bước sóng 280nm Protein Các Protein hấp thụ tia cực tím cực đại bước sóng 280nm acidamin Tryptophan, Tyrosin phần Phenylalanin Sự hấp thu bước sóng 280nm chúng thay đổi tùy loại Protein hệ số tắc đo cho Protein cho phép tính nồng độ Protein tinh (hệ số tắc độ hấp thụ dd Protein 1% với đường truyền sóng qua 1cm) Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt IgG 13,6 Chuỗi γ 13,7 Oncanavalin A 120 IgM 11,8 Chuỗi µ 13,9 IgA 13,2 Chuỗi  12,3 IgD 15,3 Chuỗi nhẹ 12,3 Lactin Lens Calinaris BSA 12.5 6.7 Bảng 3: Hệ số tắt loại Protein liên quan với hệ miễn dịch bước sóng 280nm 4.2 Cách tiến hành: Nguyên liệu: Dung dịch Protein để đo, đệm hòa tan Protein Thiết bị: Máy đo quang phổ UV có Cuvet thạch anh đường truyền sóng 1cm Quá trình gồm bước sau: 23 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ phân tử phức hợp khác có thể huyền phù Lấy dịch để xác định mật độ quang học Bước 2: Chỉnh máy quang phổ bước sóng 280nm điều chỉnh độ hấp thụ với cuvet chứa đệm Bước 3: Đo mẫu đọc độ hấp thụ mẫu Nếu giá trị thu > 2,0 pha loãng mẫu (1/5 1/10) đường sáng truyền ngắn (2mm) số đọc nằm khoảng 0,5 đến 1,5 Bước 4: Lặp lại bước bước sóng 260nm Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm Tỉ số nên nhỏ 0,6 Nếu lớn 0,6 Protein không có lẫn tạp chất khác đặc biệt với acid nucleic 4.3 Tính kết quả: Nồng độ Protein = độ hấp thụ 280nm hệ số tắt 280nm Với hỗn hợp Protein với loại Protein mà hệ số tắc tính sau: Nồng độ Protein = (1,55 x Độ hấp thụ 280nm) – (0,77 x Độ hấp thụ 260nm) Đơn vị: mg/ml Có thể đoán lượng acid nucleic dựa vào (độ hấp thu 280nm/độ hấp thu 260nm) 4.4 Độ nhạy khả ứng dụng: Đây phương pháp đơn giản để đo nồng độ Protein dung dịch Phương pháp không dùng cho dung dịch có nồng độ Protein thấp (dưới 0,05- 0,1 mg/ml) có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ vùng cực tím (ví dụ: đệm, acid nucleic số chất béo) Protein dung dịch huyền phù 24 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam So với phương pháp so màu phương pháp đơn giản hơn, nhanh hơn, mẫu dùng lại thường ổn định hóa phần lớn Protein Phương pháp huỳnh quang O-Phthalaldehyde (OPA): 5.1 Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng O-Phthalaldehyde (OPA) với amin có mặt chuỗi polypeptide (từ đầu đến cuối mạch kể phụ) Phản ứng xảy nhanh có mặt mercaptoethanol tạo sản phẩm huỳnh quang có màu xanh hấp thụ cực đại bước sóng 340nm -450nm 5.2 Độ nhạy khả ứng dụng: Độ nhạy cao đạt tới 50ng/ml Có thể phát đắn peptide chí nhỏ Phương pháp sử dụng cho chất không chứa amin khác với amin chuỗi polypeptide Phương pháp định lượng amoniac 6.1 Nguyên tắc: Trong nguyên liệu chứa nitơ thường chứa loại nitơ nằm dạng vô (muối ammonium hay amin dễ bay ) Đây dạng nitơ tạo thành phân hủy protein (bị lên men thối trình khử carbonxyl amino acid) Những loại nitơ thường có tính kiềm yếu, cho tác dụng với MgO loại nitơ nói bị đuổi khỏi dung dịch, nên chúng lôi theo nước qua bình đựng lượng thừa axit Sau đem định phân lượng axit dư, cho phép ta xác định loại nitơ 2(NH4)+ + Mg(OH)2 2NH3 + H2SO4 2NH3 + 2H20 + Mg2+ (NH4)2SO4 25 Caùc phương pháp định lượng protein 6.2 GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Cách tiến hành: Hoá chất :  Dung dòch H2SO4 0,1N  DD NaOH 0,1N  DD alizarin natri sunfonat 1% nước  Dầu parafin hay cồn octylic  Thiết bị : máy cấy ammoniac Tiến hành : Bước : Rửa máy Cho nước cất vào bình A khoảng 2/3 thể tích bình, giọt thị alizarin natri sunfonat, cho H2SO4 0,1N giọt đến dung dịch chuyển sang vàng Cho nước bình B khoảng ½ thể tích bình, lắp nguồn nước làm lạnh vào ống sinh hàn, đun sôi bình A B cất kéo nước nước chảy trung tính Bước : Cất đạm Cân lấy lượng xác m(g) hay Vmẫu(ml) thực phẩm, cho vào bình B với nước trung tính cất kéo nước để rửa máy trên, sau cho thêm 0,5ml thị màu Cho MgO bột vào tới có phản ứng kiềm rõ rệt (màu tím) Để tránh bọt sủi phồng lên, cho thêm vào giọt dầu paraffin hay cồn octylic Đun sôi, nước từ 26 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam bình A qua bình B kéo NH3 theo qua ống sinh hàn đọng lại, rơi xuống, bình chuẩn độ D đựng sẵn nước trung tính, thị màu V(ml) H2SO4 thành (NH4)2SO4.H2SO4 thừa chuẩn độ NaOH 0,1N 6.3 Tính kết quả: Hàm lượng NH3 100g thực phẩm 1, 7*(v  vx )*100 1000* m Hoặc 1000ml thực phẩm: 1, *(v  vx ) vm Trong đó: V : thể tích H2SO4 0,1N cho vào bình chuẩn độ Vx : thể tích NaOH O,1N dùng để chuẩ độ H2SO4 thừa M : khối lượng mẫu dùng để định lượng Vm : thể tích mẫu lấy để định lượng 6.4 Khả ứng dụng: Khi xác định lượng ammoniac thực phẩm, mặt xác định độ hư hỏng thực phẩm, mặt đánh giá giá trị protein, acid amin thực phẩm Phương pháp Dumas: Dumas phương pháp định lượng để xác định lượng nito chất dựa phương pháp mô tả Jean- Baptiste Dumas 27 Các phương pháp định lượng protein 7.1 GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Nguyên tắc: Phương pháp Dumas dùng để xác định lượng protein thô Quy trình dùng thiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích đến 6000C lò phản ứng bịt kín với diện oxy Hàm lượng Nito khí đốt sau dod cách dùng máy dò dẫn nhiệt Mỗi lần xác định cần khoảng thời gian ngắn (2 phút) 7.2 Thiết bị: Thiết bị phân tích đạm theo phương pháp Dumas sau: 28 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Thông tin thiết bị:  Model: NDA 70 thiết bị Velp- Italy  Thiết nị thiết kế bao gồm lấy mẫu tự động lên tới 116 vị trí, khối lượng mẫu lớn 1g  Detetor: loại Detector độ dẫn TCD tự động chuẩn  Độ lặp RSD: nhỏ 0.1 % mẫu chuẩn EDTA (9.57%)  Recovery: 99.5%  Giới hạn Detector: 0.01 mgN  Khí sử dụng: He O2  Độ tinh khiết khí He: 99.999% (grade 5.0)  Độ tinh khiết khí O2; 99.999% (grade 5.0)  Máy nén khí Nitro gen: không dầu nước, độ tinh khiết: 99.6%  p suất khí He: Bar  p suất khí O2: Bar  p suất khí nén: Bar  Cổ giao diện: USB RS 232  Công suất điện: 1400 W  Nguồn điện sử dụng: 230V/50Hz  Trọng lượng máy: 55kg  Kích thước máy 710x 51x 410mm (710x685x410mm với lấy mẫu tự động) 7.3 Cách tiến hành: Mẫu phân tích kết dạng viên, đốt cháy nhiệt độ cao, thời gian, trình xúc tác diễn việc khí oxy áp suất khí Khí cháy sinh gồm CO2, H2O, NOx, đưa qua lò thấp nơi mà khí NOx chuyển 29 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam thành khí N2 Hơi ẩm H2O CO2 tách riêng phận hấp thụ, thành phần khí N2 đo Detector độ dẫn TCD Tất trình diễn thời gian ngắn Dựa vào hàm lượng Nito ta xác định hàm lượng proten sau: Nito tổng= nito protein+ nito phi protein Trong nguyên liệu sinh hoc hàm lượng nito phi protein nhỏ việc tác riêng phức tạp nên người ta tính hàm lượng protein theo Nito tổng gọi protein thô hay protein tổng Protein (%)= Nito (%) x 6.25 Riêng ngũ cốc đậu có hệ số chuyển đổi 5.7 Sữa 6.15 Kết xét nghiệm theo phương pháp Dumas Kjeldahl cho 21 mẫu thịt cho kết sau: Phương pháp Dumas Trung Mẫu Phương pháp Kjeldahl Hệ số Trung Hệ số bình Độ biến bình Độ biến Dumas (%N lệch thiên (%N lệch thiên vs m/m) chuẩn (%) m/m) chuẩn (%) Kjeldahl 3.184 0.075 2.36 3.176 0.040 1.26 0.008 2.736 0.084 3.07 2.756 0.075 2.72 -0.020 2.402 0.069 2.87 2.419 0.052 2.15 -0.017 1.967 0.094 4.78 2.001 0.040 2.00 -0.034 1.682 0.044 2.62 1.688 0.024 1.42 -0.006 3.365 0.089 2.64 3.360 0.068 2.02 0.005 2.846 0.081 2.85 2.811 0.061 2.17 0.035 2.359 0.067 2.84 2.372 0.068 2.87 -0.013 1.844 0.044 2.39 1.855 0.035 1.89 -0.011 10 1.483 0.078 5.26 1.493 0.031 2.08 -0.010 11 3.958 0.048 1.21 3.924 0.058 1.48 0.034 12 3.442 0.062 1.80 3.432 0.041 1.19 0.010 30 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam 13 2.966 0.067 2.26 2.947 0.047 1.59 0.019 14 2.411 0.055 2.28 2.395 0.032 1.34 0.016 15 2.151 0.051 2.37 2.129 0.029 1.36 0.022 16 3.121 0.079 2.53 3.100 0.052 1.68 0.021 17 2.765 0.063 2.28 2.734 0.074 2.71 0.031 18 2.467 0.070 2.84 2.466 0.049 1.99 0.001 19 2.178 0.064 2.94 2.175 0.089 4.09 0.003 20 1.873 0.049 2.62 1.864 0.051 2.74 0.009 Nguồn: M Thompson et al Meat Science 2004; 68:631-4 Tính trung bình hệ số biến thiên phương pháp Dumas 2.7% Kjeldahl 2.1% Tính trung bình độ khác biệt đo lường hai phương pháp thấp (chỉ khoảng 0.2%) Phương pháp PRM (Pyrogallol Red Molybdate): 8.1 Nguyên tắc: Pyrogallol red kết hợp với molybdate để tạo thành hỗn hợp có màu hồng (pink) hấp thụ bước sóng 470nm Phức Pyrogallol molybdate có hấp thu bước sóng 604nm, chuyển sang màu tím đen phản ứng với Protein tác dụng acid Bằng cách đo độ hấp thụ máy đo 600nm, lượng protein xác định với abumin máu bò chuẩn 31 Các phương pháp định lượng protein 8.2 GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Dụng cụ:  ng nghiệm  Pipet hay micropipet  Quang phổ kế, máy so màu quang phổ, siêu đóa đọc trang bị với phận lọc khoảng 600nm 8.3 Tiến hành:  Dung dich protein pha loãng với hỗn hợp màu PRM (pyrogallol red molybdate) tạo thành dung dịch đệm (điều chỉnh nước) (theo bảng), sau cho vào ống nghiệm siêu đóa lọc để tiến hành thí nghiệm (tiến hành làm mẫu trắng để kiểm nghiệm)  Đặt hỗn hợp nhiệt độ phòng khoảng 20 phút  Đo hỗn hợp bước sóng hấp thụ A600 nm máy quang phổ, máy so màu hay siêu đóa đọc 1h Phương pháp dựa tương tác màu protein với tính chất đặc trưng phức hệ PRM với giới hạn hàm lượng protein Căn vào hình thành phức hệ, màu chuyển từ hồng sang tía đen (dark purple) Phương pháp hữu dụng, đơn giản, rẻ tiền phức màu hấp thụ đặc biệt phản ứng với chất khác ngòai protein, có thao tác đơn giản so với phương pháp khác 32 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam III So sánh số phương pháp định lượng protein So sánh mẫu bia có không qua thẩm tích Hàm lượng Protein bia (mg/ml) Kết luận Các phương pháp khác cho kết không giống Hàng năm giới sản xuất khoảng tỷ tân thực phẩm có protien số lượng thực phẩm cần phải phân tích protein lớn Vì người ta không ngừng nghiên cứu cải thiện phương pháp phân tích protein cho nhanh chóng, xác rẻ 33 Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Thị Trân Châu, Hóa sinh đại cương, NXB Đại Học Sư Phạm [2] Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo Dục (1997) [3] Phạm Thị Trân Châu, tạp chí sinh học, tập 9, 1981 [4] Phạm Thị nh Hồng, kỹ thuật sinh hóa, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM [5] Phạm Thị nh Hồng, Nguyễn Thị Huyên, Trần Mỹ Quang, thực tập sinh hóa sở, tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM [6] TS Lê Thị Thanh Mai, Giáo trình thực tập sinh hóa [7] Nguyễn Văn Mùi, thực hành hóa sinh học, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội (2001) [8] PGS TS Đồng Thị Thanh Thu, Giáo Trình Sinh Hóa Cơ Bản [9] Vaxcrixenxki.P, Kỹ Thuật Phòng Thí Nghiệm – Phần I, NXB Đại Học Và Trung Học Chuyên Nghiệp [10] Các Wedsite www Proteomics-Protein Assays.htm www Page Protein Assays,pg.htm www Biochemistry-Protein-the chemistry of Protein www Biophysical chemistry G4170 Protein Visualization.htm 34 ... protein, acid amin thực phẩm Phương pháp Dumas: Dumas phương pháp định lượng để xác định lượng nito chất dựa phương pháp mô tả Jean- Baptiste Dumas 27 Các phương pháp định lượng protein 7.1 GVHD: TS... II Các phương pháp định lượng protein Định lượng nitơ tổng số phương pháp Kjeldahl Theo nguyên tắc Protein định lượng cách xác định lượng nitơ tổng số kết nhân với 6.25, nghóa coi Protein chứa... ta áp dụng phương pháp thích hợp trục tiếp gián tiếp Seminar trình bày số phương pháp dùng để định lượng Protein, với số lưu ý sử dụng phương pháp cụ thể Các phương pháp định lượng protein GVHD: