Báo cáo phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm mẫu nước mía

Báo cáo phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm mẫu nước mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM  BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM MẪU NƯỚC MÍA GVHD: ThS Nguyễn Minh Hiền SVTH: nhóm Bài báo cáo đếm số vsv hiếu khí định lượng coliform Yêu cầu chung: tất thiết bị, dụng cụ vô trùng, khu vực tiến hành thí nghiệm phải lau cồn để vô trùng, thực tham tác bên lửa đèn cồn tiến hành nhanh, xác Định lượng tổng số vsv hiếu khí pp đếm khuẩn lạc Mục đích: nhằm xác định số lượng vsv hiếu khí mẫu nước mía Xác định tổng số vsv hiếu khí Các Thiết bị bước Đồng mẫu Pha Máy loãng rung mẫu Dụng cụ Nuôi cấy đĩa petri chứa môi trường Môi trường Pipet, ống NaCl nghiệm, 0.85% bình tam vô trùng giác 250ml, đèn cồn… PCA Cách tiến hành Đây môi trường lỏng nên bỏ qua bước đồng Pha loãng với nồng độ 10-1 Bước 1: lắc mẫu Bước 2: lấy 10ml dd từ mẫu ban đầu cho vào bình tam giác Bước 3: cho 90ml NaCl 0.85% vt vào bình tam giác có chứa dịch mẫu vừa lấy Bước 4: lắc mẫu Pha loãng với nồng độ 10-2 Bước 1: lắc lấy 1ml dd mẫu nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm Bước 3: cho 9ml NaCl 0.85% vt vào ống nghiệm có chứa dịch mẫu vừa lấy.sau lắc mẫu Làm tương tự cho nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Chú ý: lần pha loãng nồng độ khác phải thay đầu ống lấy dịch mẫu Lấy 0.1-1ml dd nước mía nồng độ -4, -5, -6 cho vào đĩa petri có sẵn môi trường nuôi cấy nuôi cấy, mẫu pha loãng, pipet, que cấy trang, đèn cồn… Ủ Tủ ủ Incubator Đếm khuẩn lạc Máy đếm Bút long khuẩn lạc bán tự động Tính kết nồng độ Mỗi nồng độ đĩa Nuôi cấy cách đổ đĩa cấy trang (chú ý: nuôi cấy cách đỗ đĩa cấy thể tích 1ml nhiệt độ MT 40-45oC Còn cách cấy trang cấy thể tích 0.1ml bề mặt MT phải khô, sau cấy để khô bề mặt 15-20’ ủ Gói gọn số đĩa cấy vào giấy báo, lật ngược đĩa ủ ủ 24h/37oC Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 Dặt đĩa lên máy đếm, dùng bút đếm tất khuẩn lạc đơn lẻ mọc môi trường sau đọc kết máy đếm -4 -5 Đếm 123 93 Đếm 106 94 =98*104 (cfu/ml) Tổng số VSHK: Với: A: Tổng số vsv đếm nồng độ liên tiếp n1: số lần đếm nồng độ n2: số lần đếm nồng độ d: nồng độ nuôi cấy lớn Định lượng vsv pp MPN (Coliform) Mục đích: định lượng tổng số coliform mẫu Cách tiến hành: Các bước đồng mẫu, pha loãng mẫu tương tự định lượng vsv hiếu khí Các bước B1:Nuôi cấy Dụng cụ ống nghiệm, pipette, đèn cồn, bút viết Môi trường Lauryl tryptose (LT) Cách tiến hành Lấy ống nghiệm mt LT có sẵn ống durham Cho 1ml dd nước mía nồng độ -3, -4, -5 vào ống nghiệm nồng độ ống nghiệm Ghi rõ tên mẫu, môi trường, nồng độ lên ống nghiệm sau 24h/370C quan sát đọc kết Đọc kết quả: Nồng độ -3 -4 -5 Hiện tượng ống chuông nổi, mt đục ống chuông chìm, mt biến đổi nhiều ống chuông chưa có bọt khí xuất ống chuông(>=1/10), mt đục Các bước B2: Nuôi cấy Dụng cụ ống nghiệm, piptte, đèn cồn, bút viết Kết luận Dương tính Âm tính Số ống đạt Dương tính Môi trường Cách tiến hành BGBL Lấy ống nghiệm mt BGBL có sẵn ống durham Cho 1ml dd mẫu ống dương tính vào ống nghiệm môi trường (mỗi mẫu ống nghiệm) Sau 24h/370C quan sát đọc kết Kết quả: Nồng độ -3 -4 -5 Hiện tượng Kết luận ống chuông chưa Dương tính có bọt khí xuất ống chuông, mt đục ống chuông không nổi, Âm tính không xuất bọt khí, mt đục ống chuông nổi, mt đục Dương tính Bước 3: lập tỉ lệ BGBL : coliform Nước mía : 10-3 : 10-4 : 10-5 = 1: : Tra bảng Mac Crady ta có : :1 =7.2 Tổng số Coliform = MPN* 10n =7.2*103 MPN/g ( với n nồng độ nuôi cấy lấy nguyên dương) Số ống đạt 1 Báo cáo: Định tính vi khuẩn E.coli Viết báo cáo: Phan Thị Thục Quyên Mẫu thực phẩm: Nước mía Mục đích:Kiểm tra diện vi khuẩn E.coli mẫu thực phẩm Cách tiến hành: Sơ đồ bước tiến hành: 10-1 10-3 …… 10-4 10-5 Lauryl Tryptose ↓24h/27oC ↓ ↓ ↓ EC ↓24h/44oC Nuôi cấy EMB agar,Endo agar Nhận diện khuẩn lạc điển hình Cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA Nghiệm pháp IMvic Kết luận • Bước 1: chuẩn bị môi trường sau: Nước muối sinh lý vô trùng 0,85% Môi trường Lauryl Tryptose (LT) Môi trường Enrichment coli (EC) Môi trường Eosin Methylene Blue Agar (EMB) • Bước 2:chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ vô trùng như: pipet, ống nghiệm, ống Durham, que cấy vòng, bình nón tích 250ml, đĩa petri Tủ ủ,nồi hấp tiệt trùng,máy rung ống nghiệm,đèn cồn, nút dùng để đậy ống nghiệm phải đảm bảo mặt bàn làm thí nghiệm phải • Bước 3: pha loãng mẫu Tất thao tác lấy mẫu, dịch mẫu cấy thực bên lửa đèn cồn tất dụng cụ vô trùng Dùng pipet hút 10 ml nước mía vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí nồng độ 0,85% Thu dịch mẫu nồng độ 10 -1 Chuẩn bị ống nghiệm, ống chứa ml nước muối sinh lí nồng độ 0,85% Dùng pipet hút ml dịch mẫu nồng độ 10-1 từ bình tam giác vào ống nghiệm chuẩn bị Thu dịch mẫu nồng độ 10-2 Sử dụng máy rung ống nghiệm để làm dịch mẫu Tiếp tục thực thao tác để pha loãng dịch mẫu sang nồng độ kết tiếp Khi chuyển sang nồng độ khác cần thay đầu pipet khác Khi lấy mẫu nồng độ ta dùng chung đầu pipet Hoàn thành bước ta có dịch mẫu nồng độ : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Ghi rõ nồng độ môi trường lên ống nghiệm • Bước : giai đoạn tiền tăng sinh Ta chọn môi trường có nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 để nuôi cấy vào môi trường LT Mỗi nồng độ nuôi cấy vào ống nghiệm Dùng ống pipet hút ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa ml môi trường LT có kèm ống Durham Không lắc để tránh tượng dương tính giả Thực tương tự với ống nghiệm lại Mỗi cấy sang nồng độ khác cần thay đầu pipet mới.Ghi rõ môi trường nồng độ nuôi cấy cho ống nghiệm Dùng giấy bọc tất ống nghiệm lại cho vào tủ ủ 27 0C 24h E coli thuộc nhóm vi khuẩn có khả sử dụng đường lactose môi trường LT sinh khí Dựa vào đặc điểm xác định số ống dương tính (nghi ngờ có E coli) nồng độ pha loãng Ống xác định dương tính môi trường ống đục ống Durham môi trường đục có bọt khí ống Durham với thể tích bọt khí lớn 1/10 thể tích ống chuông • Bước : giai đoạn tăng sinh Sau xác định ống dương tính,ta bắt đầu cấy vào môi trường EC Do thành phần môi trường EC so với môi trường LT có thêm muối mật nên ức chế vi khuẩn gram dương vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Cấy truyền ml dịch mẫu từ tất ống dương tính vào ống nghiệm có chứa ml môi trường EC kèm theo ống Durham Gói tất ống nghiệm vào giấy cho vào tủ ủ 24h 44oC Xác định ống nghiệm dương tính tương tự bước • Bước : cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc nhận diện khuẩn lạc điển hình Dùng que cấy vòng vô trùng cấy phân lập dịch mẫu từ ống dương tính nghi ngờ có E coli sang đĩa petri có môi trường EMB agar Endo agar Lật úp đĩa gói vào giấy cho vào tủ ủ 24h 37oC Nhận diện khuẩn lạc điển hình E coli môi trường (nếu có) : Khuẩn lạc điển hình E coli môi trường EMB agar: Mặt đĩa: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại, mặt đĩa: thấy tâm đen khuẩn lạc Khuẩn lạc điển hình E coli môi trường Endo agar: khuẩn lạc tròn, màu đỏ, có ánh kim loại • Bước : cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA Sau xác định khuẩn lạc điển hình ta cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường thạch nghiêng NA Dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc từ đĩa petri lên môi trường thạch nghiêng.Tất phải làm điều kiện môi trường vô trùng(làm gần lửa đèn cồn) dụng cụ phải vô trùng • Bước : nghiệm pháp IMVic Dùng để phân biệt E.coli với vi khuẩn đường ruột khác, gồm có phản ứng: -Phản ứng sinh indol (I): E coli có indol (+) -Phản ứng đỏ metyl (M): E coli có phản ứng đỏ metyl (+) -Phản ứng Voges Proskauer (V ): Phản ứng dùng để kiểm tra khả sinh acetyl - metyl cacbinol E.coli có pbản ứng Voges Proskauer âm tính -Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trong thực tế không làm -Phản ứng tìm khả sử dụng cacbon citrat (c) E.coli phản ứng citrat âm tính Ngoài E.coli không phân giải ure, không sinh H2S sau 48 Kết : Trong ống LT có ống dương tính Nồng độ 10-3 10-4 10-5 Số ống dương tính 1 Biểu Nổi,môi trường đục Nổi,môi trường đục Có khí chuông(chưa thể tích bọt khí lớn 1/10 thể tích ống chuông),môi trường đục Trong ống EC có ống dương tính Nồng độ Số ống dương tính -3 10 -4 10 -5 10 Nhóm em không nhận diện khuẩn lạc điển hình : có tâm đen, có ánh kim Vì nhóm em dừng bước Kết luận : Vì nuôi cấy môi trường EMB agar endo agar mà không nhận diện khuẩn lạc điển hình nên mẫu nước mía vi khuẩn E.coli Kiểm tra định tính vi khuẩn Samonella  Giới thiệu: Salmonella trực trùng gram âm, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả di động không tạo bào tử, lên men glucose mannitol sinh acide không lên men saccharose lactose, không sinh Indole, không phân giải ure Không có khả tách nhóm amine, hầu hết chủng sinh H2S  Nguyên tắc: phương pháp định tính dùng để kiểm tra có hay diện Salmonella 10 phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS H2S ion Fe2+ thị ammonium citrate diện môi trường 12.Thử nghiệm tính di động - Vi sinh vật di động thường vi sinh vật có tiêm mao phân bố vi trí khác tế bào vi sinh vật Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát dễ dàng vị trí diện tế bào vi sinh vật môi trường hợp chất vào bên tế bào bị khử thành formazan có màu đỏ 13.Thử nghiệm decarboxylase - Thử nghiệm giúp xác định khả vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl Các enzyme carboxylase cảm ứng tổng hợp môi trường có tính acid chứa chất cảm ứng đặc hiệu Phản ứng tạo CO2 điều kiện kỵ khí, CO2 sinh làm giảm pH môi trường ghi nhận qua đổi màu thị pH IV Chuẩn bị cách tiến hành Đĩa giấy oxidase (OXI): thực thử nghiệm oxidase - Nhỏ giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame - Dùng kẹp giấy lấy đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt đặt lên lame - Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase - Đọc kết sau 10 giây: phản ứng dương tính đĩa giấy oxidase xuất màu tím đen; âm tính đĩa giấy oxidase màu tím đen Bảng nhựa có 10 giếng chứa 10 loại đĩa giấy sinh hóa 22 - Dùng tăm vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng để làm thành huyền dịch có độ đục McFarland 2,0 - Cho vào giếng 200 μl huyền dịch, đậy nắp - Ủ 35-37oC/12-24 Môi trường Lysin decarboxylase (LDC) thực thử nghiệm Lysindecarboxylase - Dùng pipet pasteur hay micropiper lấy 2-3 giọt huyền phù cho vào môi trường LDC, xuyên pha lớp parafilm - Ủ 35-37oC/12-24 - Đọc kết quả: dương tính môi trường có vi khuẩn mọc có màu tím; âm tính môi trường có màu vàng có vàng tím Môi trường mobility (MOB) thực thử nghiệm di động - Dùng que cấy vô trùng lấy khúm khuẩn cắm kim cấy cách 2/3 đáy ampule chứa môi trường MOB, rút que cấy theo chiều thẳng đứng, cấy ria bề mặt thạch - Ủ 35-37oC/12-24 - Đọc kết quả: vi khuẩn có khả di động màu đỏ lan rộng khỏi đường cấy Hướng dẫn đọc kết phản ứng sinh hóa IDS14 GNR Giếng Ký hiệu GLU NIT ONPG URE Thử nghiệm sinh hóa Lên men Glucose Khử Nitrate thành Nitrite Thủy giải ONPG Thuốc thử thêm vào Tìm Nitrite Kết thử nghiệm (+) (-) Vàng Tím Đỏ/hồng (xuất vòng phút) Vàng nhạt Vàng nhạt Sinh Urease Đỏ cánh sen 23 Vàng/đỏ nhạt PAD Phenyl Alanine Deaminase CIT Sử dụng Citrate ESC Thủy giải Esculine H2S Sinh H2S IND Sinh indol Kovac VP Voges Proskauer KOH + Napthtol 10 MLO Sử dụng malonate FeCl3 Xanh (xuất bỏ thuốc thử, để lâu màu) Xanh biển (chỉ cần có ánh xanh biển) Đen (có màu từ đen nhạt qua đen đậm Đen (xuất đáy giếng, màu nhỏ Kovac vào) Đỏ bề mặt (đọc sau phút, không đọc sau 10 phút) Đỏ (xuất sau phút, không đọc kết sau 2h) Xanh biển 24 Vàng nhạt Xanh lá/vàng Không đen Không đen Vàng bề mặt Vàng nhạt Xanh lá/vàng - Sau có kết phản ứng sinh hóa số điểm tương ứng với nhóm, ta có mã định danh Từ ta tra cứu hệ thống mã định danh IDS14 GNR để xác định vi khuẩn cần định danh V Kết kết luận Giếng 10 Phản ứng Lên men Glucose Khử Nitrate β-Galactosidase (với ONPG) Urease Phenylalanin Deaminase (PAD) Sử dụng CIT Thủy phân Esculin Sinh H2S Sinh Indol (IND) Voges – Proskauer (VP) Sử dụng Malonate 25 Kết + + + + - - Đĩa giấy Oxidase: Môi trường LDC:Môi trường MOB: Tra theo bảng định danh vi khuẩn Gram âm nhờ hóa chất IDS 14 GNR Tên: Phạm Phước Toàn MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHANH ĐỂ XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT Sinh viên viết bài: Phan Nguyễn Đình Khang Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề Kiểm tra vi sinh vật cách nhanh chóng, xác chìa khóa giúp nâng cao hiệu công tác phòng thí nghiệm Nhằm rút ngắn thời gian 26 kiểm tra, số phương pháp nhanh đời, phải kể đến phương pháp xác định vi sinh vật cách sử dụng đĩa Petrifilm Đĩa Petrifilm giúp tiết kiệm công lao động, có nhiều thời gian giám sát trình sản xuất thường xuyên Kết việc quản lý tốt hơn, kiểm soát quy trình tốt hơn, chất lượng sản phẩm nâng cao, tiết kiệm chi phí Tất yếu tố yếu tố quan trọng giúp đạt lợi nhuận cao Trong báo cáo xin giới thiệu phương pháp xác định Staphylococcus aureus đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates Đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates phần sản phẩm công nghiệp hàng đầu Petrifilm, sản phẩm độc lập với nhau, đĩa làm sẵn, tiết kiệm không gian chi phí Cách kiểm tra cần ủ nhiệt độ giống phương pháp đĩa agar Baird-Parker & ống coagulase (BAM) đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates 1.2 Mục đích Khi xác định S aureus thực phẩm môi trường, đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates giúp người sản xuất nhận biết đánh giá rủi ro chất lượng sản phẩm ảnh hưởng điều kiện vệ sinh Đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates cho kết nhanh giúp tiết kiệm thời gian nguồn lực Kết nhanh có nghĩa định nhanh thời điểm cần loại bỏ hay xuất hàng Nội dung 27 2.1 Cách thực Kiểm tra S.aureus nhanh chóng, xác, kết tin cậy với bước đơn giản: Bước 1: Cấy trải ml mẫu đĩa Bước 2: Ủ nhiệt độ thích hợp Bước 3: Đếm số khuẩn lạc 2.2 Đọc kết Khuẩn lạc có màu tím đỏ xuất Sau ủ khoảng từ từ 22 đến 29 giờ, chất thị đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates giúp xác định S aureus khuẩn lạc màu tím đỏ, đĩa có kẻ ô thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc Vì đĩa Petrifilm làm đồng dễ dàng sử dụng nên xảy sai sót so với phương pháp khác Đĩa có kẻ ô thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc Cho kết nhanh, xác quán Kết luận Phương pháp xác định S aureus đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates phương pháp xác định vi sinh vật nhanh chóng đáng tin cậy Nhờ vậy, rút ngắn nhiều thời gian so với phương 28 pháp truyền thống Việc nghiên cứu, phát triển phương pháp kiểm tra nhanh hiệu cao xúc tiến thực nghiệm MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT VỆ SINH Sinh viên viết bài: Phan Nguyễn Đình Khang Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề Kiếm soát vệ sinh công việc cần thiết nhằm đảm bảo chất lượng môi trường sống, vệ sinh an toàn thực phẩm nhiều lĩnh vực khác, có ảnh hưởng quan trọng đến sống sức khỏe người Vậy làm ta kiểm soát hết mối nguy xung quanh, câu trả lời việc phải xem xét mối nguy đến từ đâu ngăn chặn xâm nhiễm Có nhiều phương pháp kiểm soát đo lường vệ sinh, nhiên báo cáo này, xin nêu phương pháp kiểm tra vệ sinh bề mặt gói Contact Slide Contact Slide thiết kế để sử dụng sàn lọc, xác định số vi khuẩn bề mặt chất lỏng Vật chứa đựng dạng ống tròn suốt với hướng mở phía khóa khớp thuần, hai mặt Slides với loại thạch khác nhau, phù hợp với việc đếm vi sinh vật toàn diện, thử nghiệm cho nấm men khuôn mẫu 29 Contact Slides 1.2 Mục đích Trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm, Slides sàng lọc nghiên cứu vi khuẩn thực loạt sản phẩm thực phẩm nước, chẳng hạn sản phẩm sữa, sản phẩm thịt, thực phẩm đông lạnh, thực phẩm nấu chín, nước sử dụng quy trình công nghiệp, nước xử lý nhà máy lọc, nước uống nước bể bơi Sử dụng để xác định tổng số vi sinh vật toàn diện, nhận biết vi khuẩn coliform, staphylococcus aureus, phân Streptococcus, Pseudomonas thuộc địa khác vi khuẩn Nội dung 2.1 Cách thực Sử dụng Contact Slide dễ dàng, thực theo bước: Bước 1: Mở khớp với điểm tách đúc Bước 2: Contact Slide lấy nhấn thẳng lên bề mặt để thử nghiệm, dù bề mặt gồ ghề, ẩm ướt… Bước 3: Sau Contact Slide chèn ngược trở lại vào gói Bước 4: Lưu trữ nhiệt độ phòng đọc kết (theo tài liệu đính kèm gói) 2.2 Ưu điểm Vô trùng đôi gói Contact Slide qua chiếu xạ gamma An toàn dẫn truyền trình thử nghiệm sau sử dụng Dễ đóng chặt lại Chi phí làm giảm cách khả tạo số lượng cần sử dụng 30 Chất lượng đảm bảo điều kiện không đổi Kết luận Nhìn chung, Contact Slide sử dụng để đếm vi khuẩn, nấm men nấm mốc bề mặt Các thùng chứa thạch đóng gói riêng lẻ hoàn toàn kín, loại trừ ô nhiễm thứ cấp Các định dạng slide ngày phát triển Đây phương giúp kiểm soát vệ sinh bề mặt cách nhanh chóng hiệu Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA Nguyên tắc: gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1542 bp với nhiều trình tự bảo tồn, có đoạn trình tự chiều dài khoảng 550 bp đặc hiệu cho giống loài vi khuẩn Giải trình tự đoạn đặc hiệu giúp định danh xác loài vi khuẩn Các bước tiến hành 31 1.Tách chiết DNA vi khuẩn Phương pháp: DNA vi khuẩn tách chiết phương pháp sốc nhiệt với qui trình sau: - Lấy khúm khuẩn cho vào tube eppendorf có chứa sẵn 200 μl dung dịch TE, trộn để tạo huyền dịch vi khuẩn - Đun sôi mẫu 100oC 10 phút sau chuyển sang khay đá phút - Ly tâm 14000 RPM 10 phút - Hút dịch chứa DNA vi khuẩn sang eppendorf 2.Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA 32 Phương pháp: sử dụng hóa chất NK16S-PCR công ty Nam Khoa với thành phần bảng Bảng Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA Chương trình luân nhiệt phản ứng PCR 16S rRNA chu kỳ 40oC 10 phút chu kỳ 95oC 10 phút 40 chu kỳ 94oC 30 giây 60oC 30 giây 72oC phút chu kỳ 72oC 10 phút Tinh sản phẩm PCR Mục đích: loại bỏ mồi dư, dNTP thành phần khác, đảm bảo độ tinh cao DNA trước tiến hành giải trình tự Phương pháp: sử dụng hóa chất QIAquick PCR Purification Kits 33 (QUIAGEN, Mỹ) Bộ kit chế tạo dựa khả bám DNA lên silica có mặt nồng độ muối cao pH thích hợp (pH ≤ 7) Các chất không mong muốn mồi dư, muối, enzyme, nucleotit không bắt cặp,… không bám vào màng silica mà qua cột nhờ ly tâm Muối rửa khỏi cột dung dịch đệm chứa ethanol Dung dịch đệm rửa lại cột ảnh hưởng đến phản ứng enzyme sau bị loại khỏi cột nhờ ly tâm Dung dịch ly giải EB có nồng độ muối thấp pH cao (pH 8,5) giúp DNA ly giải khỏi cột Cuối trình ly tâm để thu dịch chứa DNA tinh Cách sử dụng hóa chất QIAquick PCR Purification Kits Vật liệu - Hóa chất - QUIAquick Spin columns - Buffer PB (guanidine hydrochloride, isopropanol) - Buffer PE (bổ sung ethanol 100%) - Buffer EB (10 nM TrisCl, pH 8,5) - pH indicator - Sodium acetate M , pH - Collection Tube Qui trình: - Hòa dung dịch PB vào tube chứa sản phẩm khuếch đại DNA theo tỉ lệ 1:5 - Chuyển dung dịch qua hệ thống QUIAquick Spin columns đặt vào collection tube, ủ 1,5 phút nhiệt độ phòng để DNA bám lên màng, sau ly tâm 16000 RPM phút - Loại bỏ dịch collection tube, rửa cột 700 μl dung dịch PE (đã pha loãng với ethanol 95%), ly tâm 16000 RPM 1,5 phút - Loại bỏ dịch collection tube, ly tâm khô 16000 RPM trog phút - Đặt QUIAquick Spin columns vào tube mới, cho vào 20-35 μl EB, để yên nhiệt độ phòng 1-2 phút, sau ly tâm 16000 RPM phút Dịch thu chứa DNA tinh Xác định nồng độ DNA sau tinh Mục đích: kiểm tra nồng độ DNA tinh nhằm bổ sung thể tích thích hợp vào phản ứng PCR giải trình tự để thu hiệu khuyếch đại tốt Phương pháp: Dùng máy phân tích tự động Aligent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Mỹ) xác định nhanh chóng nồng độ tương đối DNA sau tinh nhằm xác định thể tích cẩn bổ sung vào phản ứng PCR giải trình tự Qui trình: - Cho μl Gel-dye vào giếng G, dùng piston ép gel phút để gel theo ống mao quản vào giếng khác 34 - Bổ sung μl maker vào giếng - Cho μl ladder vào giếng L μl mẫu vào cẩn kiềm tra vào giếng lại - Vortex hỗn hợp vòng phút, đặt vào máy Agilent 2100 Bioanalyser PCR giải trình tự Các mẫu DNA tinh cho kết điện di tốt đưa vào chu trình nhiệt phản ứng PCR giải trình tự nhằm tạo đoạn DNA có gắn ddNTP đánh dấu huỳnh quang Phản ứng PCR giải trình tự thực phản ứng với cặp mồi NK16s-F NK16s-R nhằm thu đoạn trình tự có độ dài mong muốn Thành phần phản ứng PCR giải trình tự Big dye Terminator μl Big Dye buffer 3,5 μl Mồi (5 pmol/μl) 0,7 μl DNA mẫu từ 13-18 ng Nước khử ion thêm vào cho đủ 20 μl Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR giải trình tự chu kỳ 96oC phút 25 chu kỳ 96oC 10 giây 50oC giây 60oC phút chu kỳ 4OC 10 phút Tủa tinh sản phẩm PCR giải trình tự Mục đích: loại bỏ Bigdye terminators dư thành phần dư khác buffer trước tiến hành điện di mao quản nhằm thu tín hiệu tốt máy giải trình tự tự động Phương pháp: sử dụng nồng độ muối cao ethanol tuyệt đối để tủa DNA Qui trình - Cho μl EDTA 0,125 M; μl sodium acetate M, 50 μl ethanol 100% 20 μl sản phẩm sau chạy PCR sequecing, ủ 10 phút nhiệt độ phòng - Ly tâm 17000 RPM 20 phút - Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM phút - Thêm 50 μl ethanol 75%, ly tâm 17000 RPM 20 phút - Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM phút - Đổ bỏ ethanol dư sấy khô bồn hút chân không 10 phút - Cho 20 μl Hi-di, để 10 phút nhiệt độ phòng sau đặt vào hệ thống máy giải trình tự tự động ABI 3130 XL Genetic Analyser 35 Điện di mao quản DNA Nguyên tắc: đoạn DNA mạch đơn đánh dấu màu huỳnh quang khác đầu 5’ di chuyển gel polyacriamide trình điện di Các vạch điện di mắt cảm quang phát qua chùm tia laser phát sáng lên Tín hiệu mắt cảm quang truyền máy tính để hiển thị thành đỉnh cường độ sáng biểu đồ Tử biểu đồ đỉnh cường độ sáng này, máy so dòng đỉnh tương ứng với màu để cuối phân tích thành trình tự đoạn DNA [10] Phương pháp: thực điện máy giải trình tự ABI 3130 XL Genetic Analyser (Applied Biosystem, Mỹ) với gel POP-7 Xử lý kết giải trình tự Kết phân tích phần mầm Sequencing analysis, lưu định dạng fasta xử lý phần mềm Bioedit nhằm đưa chuỗi trình tự tốt Chuỗi trình tự so sánh với trình tự tham khảo ngân hàng NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) thông qua công cụ BLAST nhằm xác định xác tên vi khuẩn 36 [...]... so với các phương 28 pháp truyền thống Vi c nghiên cứu, phát triển các phương pháp kiểm tra nhanh và hiệu quả cao hơn luôn được xúc tiến và thực nghiệm MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT VỆ SINH Sinh vi n vi t bài: Phan Nguyễn Đình Khang 1 Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề Kiếm soát vệ sinh là một trong những công vi c rất cần thiết nhằm đảm bảo chất lượng môi trường sống, vệ sinh an toàn trong thực phẩm cùng nhiều... tròn trong suốt với hướng mở phía trên khóa bằng khớp thuần, hai mặt Slides với các loại thạch khác nhau, phù hợp với vi c đếm vi sinh vật toàn diện, thử nghiệm cho nấm men và khuôn mẫu 29 Contact Slides 1.2 Mục đích Trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm, các Slides sàng lọc và nghiên cứu vi khuẩn thực hiện trên một loạt các sản phẩm thực phẩm và nước, chẳng hạn như các sản phẩm sữa, các sản phẩm thịt, thực. .. định danh vi khuẩn Gram âm nhờ bộ hóa chất IDS 14 GNR Tên: Phạm Phước Toàn MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHANH ĐỂ XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT Sinh vi n vi t bài: Phan Nguyễn Đình Khang 1 Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề Kiểm tra vi sinh vật một cách nhanh chóng, chính xác là chìa khóa giúp nâng cao hiệu quả trong công tác ở phòng thí nghiệm Nhằm rút ngắn thời gian 26 kiểm tra, một số phương pháp nhanh đã ra đời, trong đó phải... cách thực hiện: Bước 1: Tiền tăng sinh  Mở ngọn lữa đèn cồn, cho 225ml dung dịch peptone đệm vào túi ni lông  Lấy mẫu: lấy 25ml mẫu nước mía Dùng pipet hút 25ml mẫu nước mía cho vào túi ni lông đã đựng sẵn 225ml peptone đệm Trộn 25ml mẫu với 225ml peptone đệm, đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất khoảng 30 giây Ghi tên mẫu vào trên thành ống nghiệm Sau đó đem ủ ở 370C trong vòng 24h 11 Bước 2: Tăng sinh. .. thịt, thực phẩm đông lạnh, thực phẩm nấu chín, nước được sử dụng trong các quy trình công nghiệp, nước được xử lý trong các nhà máy lọc, nước uống và nước bể bơi Sử dụng để xác định tổng số vi sinh vật toàn diện, nhận biết vi khuẩn coliform, staphylococcus aureus, phân Streptococcus, Pseudomonas và các thuộc địa khác của vi khuẩn 2 Nội dung 2.1 Cách thực hiện Sử dụng Contact Slide dễ dàng, thực hiện... luận trong mẫu nước mía mang đi kiểm tra định tính Salmonella, ta nhận thấy không có sự xuất hiện của Salmonella 12 SV vi t bài: Đặng Thị Hoài Bắc PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN STAP AUREUS Sinh vi n vi t bài: Nguyễn Thị Bảo Châu GIỚI THIỆU: Staphylococcus aureus hay Tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram-dương kỵ khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong. .. thế nào ta có thể kiểm soát hết được cái mối nguy xung quanh, câu trả lời chính là vi c phải xem xét mối nguy đó đến từ đâu và ngăn chặn sự xâm nhiễm Có nhiều phương pháp kiểm soát và đo lường vệ sinh, tuy nhiên ở bài báo cáo này, xin chỉ nêu phương pháp kiểm tra vệ sinh bề mặt bằng gói Contact Slide Contact Slide được thiết kế để sử dụng sàn lọc, xác định số vi khuẩn trên bề mặt và trong chất lỏng Vật... tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ 13.Thử nghiệm decarboxylase - Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase... tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ 10.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate - Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy nhất trong môi trường Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sử dụng... Sau khi tăng sinh trong môi trường RV ( có màu xanh nước biển vì chứa Malachite green) ta thấy ống nghiệm chuyển sang màu xanh nhạt hơn với màu xanh của môi trường RV ban đầu chứng tỏ trong mẫu nước mía nghi ngờ có Salmonella Dùng que cấy vòng, đốt nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, lấy mẫu cấy vào trong đĩa chứa môi trường thạch XLD ( có màu đỏ vì chứa Phenol red) Ta mở nút bông của ống nghiệm sau đó ... với vi c đếm vi sinh vật toàn diện, thử nghiệm cho nấm men khuôn mẫu 29 Contact Slides 1.2 Mục đích Trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm, Slides sàng lọc nghiên cứu vi khuẩn thực loạt sản phẩm thực. .. ống đạt 1 Báo cáo: Định tính vi khuẩn E.coli Vi t báo cáo: Phan Thị Thục Quyên Mẫu thực phẩm: Nước mía Mục đích :Kiểm tra diện vi khuẩn E.coli mẫu thực phẩm Cách tiến hành: Sơ đồ bước tiến hành:... loạt sản phẩm thực phẩm nước, chẳng hạn sản phẩm sữa, sản phẩm thịt, thực phẩm đông lạnh, thực phẩm nấu chín, nước sử dụng quy trình công nghiệp, nước xử lý nhà máy lọc, nước uống nước bể bơi Sử