Báo cáo phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm mẫu nước mía

Báo cáo phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm mẫu nước mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM



BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM

VI SINH TRONG THỰC PHẨM

MẪU NƯỚC MÍA

GVHD: ThS Nguyễn Minh Hiền

SVTH: nhóm 2

Bài báo cáo đếm số vsv hiếu khí và định lượng coliform

Yêu cầu chung: tất cả các thiết bị, dụng cụ đều vô trùng, khu vực tiến hành thí nghiệm phải được lau cồn để vô trùng, thực hiện các tham tác bên ngọn lửa đèn cồn tiến hành nhanh, chính xác

1 Định lượng tổng số vsv hiếu khí bằng pp đếm khuẩn lạc

Mục đích: nhằm xác định số lượng vsv hiếu khí trong mẫu nước mía

NaCl 0.85%

Bước 4: lắc đều mẫu

Pha loãng với nồng độ 10-2Bước 1: lắc đều và lấy 1ml dd mẫu

ở nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm

Bước 3: cho 9ml NaCl 0.85% vt vào ống nghiệm có chứa dịch mẫu vừa lấy.sau đó lắc đều mẫu

Làm tương tự cho các nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6

Chú ý: mỗi lần pha loãng ở các nồng độ khác nhau đều phải thay đầu ống lấy dịch mẫu

Nuôi cấy 6 đĩa petri

chứa môi trường

PCA Lấy 0.1-1ml dd nước mía ở các

nồng độ -4, -5, -6 cho vào 6 đĩa petri có sẵn môi trường nuôi cấy

nuôi cấy, mẫu pha loãng, pipet, que cấy trang, đèn cồn…

Mỗi nồng độ 2 đĩa Nuôi cấy bằng cách đổ đĩa hoặc cấy trang (chú ý: nếu nuôi cấy bằng cách đỗ đĩa thì cấy ở thể tích 1ml và nhiệt độ MT

là 40-45oC Còn cách cấy trang thì cấy ở thể tích 0.1ml và bề mặt MT phải khô, sau khi cấy để khô bề mặt15-20’ rồi mới ủ

Bút long Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250

Dặt đĩa lên máy đếm, dùng bút đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môitrường sau đó đọc kết quả trên máyđếm

2 Định lượng vsv bằng pp MPN (Coliform)

Mục đích: định lượng tổng số coliform trong mẫu

Cách tiến hành:

Các bước đồng nhất mẫu, pha loãng mẫu tương tự như bài định lượng vsv hiếu khí

Các bước Dụng cụ Môi trường Cách tiến hành

B1:Nuôi cấy 9 ống

nghiệm, pipette, đèn cồn, bút viết

Lauryl tryptose (LT)

Lấy 9 ống nghiệm mt LT có sẵn các ống durham

Cho 1ml dd nước mía nồng độ -3, -4,-5 vào các ống nghiệm mỗi nồng độ

3 ống nghiệm

Ghi rõ tên mẫu, môi trường, nồng độlên các ống nghiệm

sau 24h/370C quan sát và đọc kết quả

Đọc kết quả:

-3 ống chuông nổi, mt đục Dương tính 1

-4 ống chuông chìm, mt

không có biến đổi nhiều

-5 ống chuông chưa nổi

nhưng có bọt khí xuất hiện trong ống chuông(>=1/10),

BGBL Lấy 4 ống nghiệm mt BGBL có sẵn

các ống durhamCho 1ml dd mẫu ở 4 ống dương tính vào 4 ống nghiệm môi trường (mỗi mẫu 1 ống nghiệm)

Sau 24h/370C quan sát và đọc kết quả

Kết quả:

-3 ống chuông chưa nổi

nhưng có bọt khí xuất hiện trong ống chuông, mt đục

-4 ống chuông không nổi,

không xuất hiện bọt khí, mtđục

Báo cáo: Định tính vi khuẩn E.coli

Viết báo cáo: Phan Thị Thục Quyên

1 Mẫu thực phẩm : Nước mía

2 Mục đích :Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn E.coli trong mẫu thực phẩm.

3 Cách tiến hành : Sơ đồ các bước tiến hành:

Nhận diện khuẩn lạc điển hình

Cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA

Nghiệm pháp IMvic

Kết luận

 Bước 1: chuẩn bị các môi trường sau:

Nước muối sinh lý vô trùng 0,85%

Môi trường Lauryl Tryptose (LT)

Môi trường Enrichment coli (EC)

Môi trường Eosin Methylene Blue Agar (EMB)

 Bước 3: pha loãng mẫu

Tất cả các thao tác lấy mẫu, dịch mẫu và cấy được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn

và tất cả dụng cụ đều được vô trùng

Dùng pipet hút 10 ml nước mía vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh línồng độ 0,85% Thu được dịch mẫu nồng độ 10-1 Chuẩn bị 5 ống nghiệm, mỗi ốngchứa 9 ml nước muối sinh lí nồng độ 0,85% Dùng pipet hút 1 ml dịch mẫu nồng

độ 10-1 từ bình tam giác vào một ống nghiệm đã chuẩn bị như trên Thu được dịch

mẫu nồng độ 10-2 Sử dụng máy rung ống nghiệm để làm đều dịch mẫu Tiếp tụcthực hiện thao tác này để pha loãng dịch mẫu sang các nồng độ kết tiếp Khichuyển sang nồng độ khác cần thay đầu pipet khác Khi lấy mẫu ở cùng nồng độ ta

có thể dùng chung đầu pipet Hoàn thành bước này ta có các dịch mẫu ở các nồng

độ : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Ghi rõ nồng độ môi trường lên các ống nghiệm

 Bước 4 : giai đoạn tiền tăng sinh

Ta chọn ra 3 môi trường có nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 để nuôi cấy vào môi trường LT.Mỗi nồng độ nuôi cấy vào 3 ống nghiệm Dùng ống pipet hút 1 ml dịch mẫu chovào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LT có kèm ống Durham Không lắc đểtránh hiện tượng dương tính giả Thực hiện tương tự với các ống nghiệm còn lại.Mỗi khi cấy sang nồng độ khác cần thay đầu pipet mới.Ghi rõ môi trường và nồng

độ nuôi cấy cho mỗi ống nghiệm

Dùng giấy bọc tất cả các ống nghiệm lại và cho vào tủ ủ ở 270C trong 24h E coli

thuộc nhóm vi khuẩn có khả năng sử dụng đường lactose trong môi trường LT vàsinh khí Dựa vào đặc điểm này là xác định được số ống dương tính (nghi ngờ có

E coli) ở từng nồng độ pha loãng Ống được xác định là dương tính khi môi

trường trong ống đục và ống Durham nổi hoặc môi trường đục và có bọt khí trongống Durham với thể tích bọt khí lớn hơn hoặc bằng 1/10 thể tích ống chuông

 Bước 5 : giai đoạn tăng sinh

Sau khi xác định được các ống dương tính,ta bắt đầu cấy vào môi trường EC Dothành phần môi trường EC so với môi trường LT có thêm muối mật nên ức chếđược các vi khuẩn gram dương và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đườngruột

Cấy truyền 1 ml dịch mẫu từ tất cả các ống dương tính lần lượt vào các ốngnghiệm có chứa 5 ml môi trường EC kèm theo một ống Durham Gói tất cả ốngnghiệm vào giấy và cho vào tủ ủ trong 24h ở 44oC

Xác định ống nghiệm dương tính tương tự như bước trên.

 Bước 6 : cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc và nhận diện khuẩn lạc điểnhình

Dùng que cấy vòng vô trùng cấy phân lập dịch mẫu từ các ống dương tính nghi

ngờ có E coli sang các đĩa petri có môi trường EMB agar và Endo agar Lật úp các

đĩa và gói vào giấy cho vào tủ ủ 24h ở 37oC

Nhận diện khuẩn lạc điển hình của E coli trên các môi trường (nếu có) : Khuẩn lạc điển hình của E coli trên môi trường EMB agar: Mặt trên đĩa: khuẩn lạc tròn,

bóng, có ánh kim loại, mặt dưới đĩa: thấy tâm đen của khuẩn lạc Khuẩn lạc điển

hình của E coli trên môi trường Endo agar: khuẩn lạc tròn, màu đỏ, có hoặc không

có ánh kim loại

 Bước 7 : cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA

Sau khi xác định được khuẩn lạc điển hình ta cấy khuẩn lạc điển hình vào môitrường thạch nghiêng NA Dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc từ đĩa petri và lênmôi trường thạch nghiêng.Tất cả phải được làm trong điều kiện môi trường vôtrùng(làm gần ngọn lửa đèn cồn) và dụng cụ cũng phải được vô trùng

 Bước 8 : nghiệm pháp IMVic

Dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác, gồm có các phản ứng:-Phản ứng sinh indol (I): E coli có indol (+)

-Phản ứng đỏ metyl (M): E coli có phản ứng đỏ metyl (+)

-Phản ứng Voges Proskauer (V ): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả năng sinh ra

acetyl - metyl cacbinol E.coli có pbản ứng Voges Proskauer âm tính

-Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trong thực tế không làm

-Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (c) E.coli phản ứng citrat âm

tính

Ngoài ra E.coli không phân giải được ure, không sinh H2S sau 48 giờ

4 Kết quả :

Nhóm em không nhận diện được khuẩn lạc điển hình : có tâm đen, có ánh kim.

Vì vậy nhóm em dừng tại bước 6

5 Kết luận :

Vì nuôi cấy trên môi trường EMB agar và endo agar mà không nhận diện được

khuẩn lạc điển hình nên trong mẫu nước mía không có vi khuẩn E.coli

Kiểm tra định tính vi khuẩn Samonella

 Giới thiệu: Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, cókhả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acidenhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, và khôngphân giải ure Không có khả năng tách nhóm amine, hầu hết các chủng đềusinh H2S

 Nguyên tắc: là phương pháp định tính dùng để kiểm tra có hay không có sựhiện diện của Salmonella

 Quy trình đầy đủ: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập (nhận diện vàchọn khuẩn lạc điển hình), nhuộm gram, cấy khuẩn lạc vào NA, phản ứngsinh hóa, kết luận.

1 Dụng cụ và môi trường:

 Mẫu nước mía ép siêu sạch

 Canh Peptone đệm (BPW)

 Canh Rappaport-Vassiliadis soy peptone (RV)

 Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD Agar)

 Lam kính, kính hiển vi, bộ thuốc nhuộm gram (thuốc nhuộm: fucshin loảng,crystal violet, cồn 900, dung dịch lugol)

 Nutrient agar (NA)

 Tủ ấm có thể duy trì ở 370C và 420C

 Túi ni lông tiệt trùng

 Máy đồng nhất mẫu Stomacher

 Pipet, micropipet, đầu hút micropipet tất cả đã được tiệt trùng

 Đèn cồn, ống nghiệm đã được tiệt trùng và có nút bông, giá để ống nghiệm,que cấy vòng, bút lông, nồi hấp tiệt trùng

 Tất cả các thao tác phải được thực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn

 Sau khi tiến hành kiểm tra xong, các mẫu và các dụng cụ phải được hấp tiệttrùng, đem bỏ mẫu và rửa lại sạch sẽ

3 Quy trình và cách thực hiện:

Bước 1: Tiền tăng sinh.

 Mở ngọn lữa đèn cồn, cho 225ml dung dịch peptone đệm vào túi ni lông

 Lấy mẫu: lấy 25ml mẫu nước mía Dùng pipet hút 25ml mẫu nước mía chovào túi ni lông đã đựng sẵn 225ml peptone đệm Trộn 25ml mẫu với 225mlpeptone đệm, đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất khoảng 30 giây Ghi tênmẫu vào trên thành ống nghiệm Sau đó đem ủ ở 370C trong vòng 24h.

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc:

 Dùng pipet khác hút 9,9ml dung dịch môi trường RV (mở nút bông của ốngnghiệm, hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn) cho vào ống nghiệm(hơ tiếp miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông lại).Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa RV

 Thay đầu hút của micropipet, chỉnh micropipet về vạch 0,1ml Hút 0,1mldung dịch mẫu sau khi được ủ 24h, cho vào 2 ống nghiệm chứa môi trường

RV ( làm tương tự trên) Đem ủ trong tủ ấm khoảng 420C và trong 24h

Bước 3: Phân lập:

 Sau khi tăng sinh trong môi trường RV ( có màu xanh nước biển vì chứaMalachite green) ta thấy ống nghiệm chuyển sang màu xanh nhạt hơn vớimàu xanh của môi trường RV ban đầu chứng tỏ trong mẫu nước mía nghingờ có Salmonella

 Dùng que cấy vòng, đốt nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, lấy mẫu cấy vàotrong đĩa chứa môi trường thạch XLD ( có màu đỏ vì chứa Phenol red) Ta

mở nút bông của ống nghiệm sau đó (cà nhẹ que lấy mẫu trên thành ống đểlàm nguội que cấy) lấy mẫu bằng cách nhúng que cấy vào trong dung dịch,rút nhẹ ra ngoài, hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn Đậy nút bônglại Cấy mẫu và đĩa, ta mở hờ nắp đĩa bằng 1 tay, phía được mở hướng vềphía ngọn lửa đèn cồn, tay còn lại cấy mẫu bằng cách kéo theo hình zíc zắcđều từ gần thành đĩa ra tới giữa đĩa, xoay đĩa đi qua góc khác và làm tương

tự nhưng bây giờ ta cấy thành hang song song

 Làm tương tự với đĩa thứ 2 Ghi tên mẫu lên thành của đĩa

 Lật ngược các đĩa lại và đem đi ủ trong tủ ấm 370C trong 24h

Bước 4: Nhận diện khuẩn lạc điển hình:

 Khuẩn lạc điển hình của Salmonella trên môi trường XLD: đỏ cùng màu vớimôi trường, trong, đôi khi có tâm đen do Salmonella sinh khí H2S kết hợpvới Fe2+ tạo ra hợp chất FeS kết tủa có màu đen

 Quan sát đĩa XLD sau khi ủ 24h ta không thấy khuẩn lạc điển hình củaSalmonella trên môi trường XLD.

Bước 5: khẳng định:

 Kết luận trong mẫu nước mía mang đi kiểm tra định tính Salmonella, ta nhậnthấy không có sự xuất hiện của Salmonella

SV viết bài: Đặng Thị Hoài Bắc

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN STAP AUREUS

Sinh viên viết bài: Nguyễn Thị Bảo Châu

GIỚI THIỆU:

Staphylococcus aureus hay Tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram-dương kỵ

khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các

loài tụ cầu Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở

cả mũi và da Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài của S aureus.

Phương pháp kiểm tra định tính nhằm xác định có hay không sự hiện diện củaS.aureus

1 Đồng nhất, pha loãng mẫu

a Dụng cụ, thiết bị

Pipet, bình tam giác 250ml, đèn cồn, máy rung

b Hóa chất, môi trường

Dịch mẫu nguyên chất Dung dịch nước muối vô trùng (0,85%)

c Cách thực hiện

Đong 90ml dd nước muối vô trùng cho vào bình tam giác Dùng pipet hút10ml dịch mẫu cho vào bình tam giác giác chứa nước muối vô trùng Đểbình vào máy rung để đồng nhất mẫu Ta thu được dung dịch mẫu vớinồng độ 10-1

2 Tăng sinh Stap.aureus

a Dụng cụ, thiết bị

Micropipette, đèn cồn, tủ ủ Incubator

b Hóa chất, môi trường

2 ống nghiệm chứa môi trường MSB Dung dịch mẫu nồng độ 10-1

c Cách thực hiện

Dùng micropipet hút 1ml dịch mẫu nồng độ 10-1 lần lượt cho vào 2 ốngnghiệm chứa môi trường MSB (mỗi ống 1ml) Gói cẩn thận 2 ống trênvào giấy báo sau đó cho vào tủ ủ để ở 37oC trong 24h

b Hóa chất, môi trường

2 ống tăng sinh MSB+, 4 đĩa petri chứ môi trường Baird Parter Agar (BPAgar), tủ ủ

c Cách thực hiện

Dùng que cấy trang cấy phân lập 2 ống MSB+ trên các đĩa petri chứa môitrường BP Agar, mỗi ống 2 đĩa Gói gọn số đĩa đã cấy vào giấy báo,mang đi ủ ở 37oC trong 24h, lật ngược đĩa khi ủ

d Kết quả

Nhận dạng khuẩn lạc điển hình: khuẩn lạc điển hình của Stap.aureus trên

BP Agar có đường kính từ 2-5 mm, tròn, bóng, lồi, màu đen, có viền sángxung quanh khuẩn lạc Một số dòng có thể xuất hiện các vòng mờ đục(khi kéo dài thời gian ủ) ở bên trong của viền sáng trong (do tác động củalipase)

Sau khi ủ, có 3 đĩa có các khuẩn lạc điển hình, dùng bút lông khoanh trònđánh dấu các khuẩn lạc

4 Nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi

a Dụng cụ, thiết bị

Kính hiển vi, tiêu bản, đèn cồn, giấy lọc, que cấy trang

b Hóa chất, môi trường

Thuốc nhuộm crystal violet, dung dịch lugol, cồn 96o, thuốc nhuộmfuchsin kiềm loãng, nước rửa

c Cách tiến hành

- Dùng que cấy trang lấy khuẩn lạc điển hình cho lên mặt trên phiếnkính, cho thêm vào 1 giọt nước ( phạm vi được đánh dấu)

- Dàn đều vi khuẩn trên khu vực đã đánh dấu

- Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn

- Đặt mảnh giấy lọc lên vết bôi

- Nhỏ thuốc nhuộm crystal violet lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấmxuống vết bôi, để 1-2 phút Rửa nước

- Nhỏ dung dịch lugol lên vết bôi vừa được nhuộm, để khoảng 1 phút.Rửa nước

- Tẩy màu bằng cồn 96o khoảng 15-30 giây Rửa nước

- Đặt 1 mảnh giấy lọc khác lên vết bôi

- Nhỏ thuốc nhuộm fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc sao cho đủthấm xuống vết bôi, để khoảng 1 phút Rửa nước

- Thấm khô tiêu bản để xem dưới kính hiển vi

d Kết quả

Quan sát dưới kính hiển vi vi khuẩn Stap aureus là các tụ cầu khuẩn bắt

màu tím của thuốc nhuộm crystal violet

5 Cấy khuẩn lạc điển hình vào NA

a Dụng cụ, thiết bị

Que cấy trang, đèn cồn, tủ ủ

b Hóa chất, môi trường

2 ống môi trường thạch nghiêng NA

Các khuẩn lạc màu vàng mọc theo đường cấy trên thạch nghiêng NA

6 Phản ứng sinh hóa tiến hành với huyết tương thỏ có cho thêm lòng đỏ

Micropipette, 2 ống nghiệm, đèn cồn, que cấy

b Hóa chất, môi trường

Nước muối sinh lý vô trùng, tube huyết tương thỏ đông khô

c Cách thực hiện

- Làm tan huyết tương thỏ đông khô: dùng micropipette hút 1ml nướcmuối sinh lý vô trùng cho vào tube huyết tương thỏ đông khô Sau đólăn nhẹ tube trong long bàn tay cho huyết tương tan hoàn toàn Khôngđược lắc mạnh

- Làm huyền dịch vi khuẩn: hút 1ml nước muối sinh lý vô trùng vàoống nghiệm, dùng que cấy trang cấy chuyển vi khuẩn từ ống chứa môitrường thạch nghiêng NA sang ống chứa nước muối sinh lý, đến khihuyền dịch đục là được

- Chỉnh micropipette xuống vạc chia 0,5ml Hút 0,5ml dung dịch huyếttương thỏ cho vào ống nghiệm, bỏ đầu hút pipet Tiếp tục hút 0,5mlhuyền dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm trên, trộn đều bằng cách lănnhẹ trong long bàn tay

- Ủ trong tủ ấm khoảng 37oC

d Kết quả

Đọc kết quả bằng cách quan sát sự đông tụ sau 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 12 giờtrong quá trình ủ.

Nghiêng nhẹ tube lần lượt sau các khoảng thời gian như trên thì ta thấykhông có hiện tượng huyết tương thỏ đông tụ vì vậy không có

Stap.aureus trong mẫu nước mía đem kiểm tra.

Phản ứng sinh hóa IDS14 GNR

I Mục đích

III Cơ chế của các phản ứng sinh hóa

1 Thử nghiệm khả năng lên men