báo cáo quy trình phân tích kháng sinh trong tôm

báo cáo quy trình phân tích kháng sinh trong tôm

Bộ Giáo Dục và Đào Tạo



Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học

BÁO CÁO QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

KHÁNG SINH TRONG TÔM

Nguyễn Thanh Duy Đặng Quốc Thái Phạm Anh Thư Trần Nhật Trường

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 02/2012

Muc lục

A ĐẶT VẤN ĐỀ 3

B KHÁNG SINH 3

I ĐỊNH NGHĨA 3

II DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH? 4

C GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG SINH TRONG TÔM 5

I Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm 7

II Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong thực nghiệm 7

D PHƯƠNG PHÁP ELISA 8

I GIỚI THIỆU CHUNG 8

II NGUYÊN TẮC 9

III ỨNG DỤNG 9

IV ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA ĐỂ PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG TÔM 10

E KẾT LUẬN 14

A Đ T V N Đ ẶT VẤN ĐỀ ẤN ĐỀ Ề

Hiện nay ngành chăn nuôi thủy sản nước ta phát triển rất mạnh nhất là lĩnh vực nuôi tôm sú ở các tỉnh ven biển, tôm càng xanh ở các tỉnh dồng bằng sông cửu long Tuy nhiên hiện trạng đang xảy ra là dư lượng thuốc kháng sinh được các nhà máy thức ăn bổ sung vào thức ăn công nghiệp quá nhiều, hậu quả chắc ai cũng biết

Sử dụng thuốc và hóa chất trong nghề nuôi tôm ngày càng tăng do chuyển đổi nhanh chóng từ nuôi quảng canh sang thâm canh Kết quả điều tra

60 hộ nuôi tôm và người phân phối thuốc và hóa chất ở tỉnh Bạc Liêu và Sóc Trăng thấy có 74 loại thuốc và hóa chất trong đó có 19 loại đang đựơc sử dụng trong nghề nuôi tôm

Một vấn đề lớn còn lại cần phải giải quyết là các nhà sản xuất và người bán lẻ các sản phẩm kháng sinh thường không chú ý tới việc cung cấp cho người nuôi tôm những thông tin chính xác về những sản phẩm của họ Họ cần phải được bắt buộc cung cấp cho người nuôi những thông tin tốt hơn về hàm lượng, độ an toàn và hiệu quả sử dụng sản phẩm

B KHÁNG SINH

I Đ NH NGHĨA ỊNH NGHĨA

Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên

vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn

Bảng: Một số loại thuốc kháng sinh thường sử dụng trong nuôi tôm

Sulphamethoxazole + Trimethoprim (4) Dai-Trim và Vi- trim

Sulfamid + Trimethoprim (4) Cotrim-Fort, Trimesul và Sulfa-Prim 01 Enrofloxacin + Metronidazole + Colistin (3) Enro DC

Enrofloxacin + Gentamycin + Colistin (2) Genrodexacol và EGC-mycine

Norfloxacin + Sulfamid + Trimethoprim (2) Anti –V

Norfloxacin + Colistin + Gentamycin (2) Norlp-Septryl

Ampicillin + Furaltadone + Sulfachlorpuridazin (2) Bioxide for shrimp

Sơ đồ cơ chế tác động của chất kháng sinh

II D L Ư LƯỢNG KHÁNG SINH? Ư LƯỢNG KHÁNG SINH? ỢNG KHÁNG SINH? NG KHÁNG SINH?

vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ quan

kiểm soát thực phẩm trên thế giới Một số loại kháng sinh bản thân nó (chloramphenicol,

cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại

quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống Chính vì vậy những kháng sinh này đã bị cấm sử dụng hoàn toàn trong nuôi trồng và bảo quản thực phẩmTồn dư kháng sinh trong thực phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây những bệnh hiểm nghèo như ung thư, đột biến gen, quái thai, dị ứng và tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh

Enrofloxacin là chất kháng sinh kháng vi khuẩn ảnh hưởng đến mắt dễ gây khiếm thị

Khi vi khuẩn có được sức đề kháng, người ta khó có khả năng tống khứ được chúng

đi bằng thuốc kháng sinh Hơn nữa, một số thuốc kháng sinh có thể làm cho vi khuẩn tăng sức đề kháng không chỉ với loại kháng sinh đó mà còn với nhiều loại kháng sinh khác nhau Thêm vào đó, các nguyên tố mã hoá có sức đề kháng có thể di chuyển từ một loài vi khuẩn này sang các loài vi khuẩn khác Vi khuẩn này có thể gián tiếp trở nên kháng lại một loại kháng sinh mà không cần phải đưa trực tiếp kháng sinh đó vào

nó

Một vấn đề quan trọng khác đó là nhiều loại kháng sinh là có hại cho sức khoẻ nghề nghiệp Hiện nay khi người lao động và nhiều người khác khi xử lý nhiều loại kháng sinh thì phần da để lộ ra ngoài và bụi hít vào từ thuốc bột kháng sinh có thể dẫn đến các vấn đề về sức khoẻ đối với họ

Nhiều loại kháng sinh được sử dụng trong các trại nuôi tôm là có sức sức bền khá cao trong môi trường và có thể lan ra các vùng nước xung quanh qua đường thoát nước, nước thải Trong môi trường xung quanh chúng có thể thay đổi hệ sinh thái bằng cách thay đổi cấu trúc thông thường của vi khuẩn, và cũng có những ảnh hưởng độc tính rất lớn đối với động vật và thực vật dưới nước Chúng cũng có thể được các sinh vật hấp thụ, ví dụ như những con vẹm loài thủy sản được nhiều địa phương khai thác và

ăn Ðiều đó có nghĩa là, dư lượng kháng sinh trong thực phẩm không chỉ là một mối

đe doạ đối với người tiêu dùng tôm ở những nước nhập khẩu mà còn là một mối đe dọa đối với những người sống trong những vùng nuôi tôm

C GI I THI U S L ỚI THIỆU SƠ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG ỆU SƠ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG Ơ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG Ư LƯỢNG KHÁNG SINH? ỢNG KHÁNG SINH? C M T S PH ỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG Ố PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG Ư LƯỢNG KHÁNG SINH? Ơ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG NG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG SINH TRONG TÔM

Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như

GC-MS, GC-MS/GC-MS, LC- GC-MS, LC-MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các

cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng

và trình độ của kiểm nghiệm viên Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method) Liên minh châu Âu (Chỉ thị

657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm

Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú

y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ tiêu CAP, AOZ và AMOZ Tất cả các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định trên LC-MS/MS

2.2.1 Tóm t t ắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm

a Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB.

b Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích

bằng 6ml ethyl acetate Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ Cặn khô được hoà tan trong 1ml đệm và làm sạch bằng 1ml hexan Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA

c Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lượng CAP

trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm

d Giới hạn phát hiện: 0,1ppb

Các mẫu phát hiện

dương tính trên ELISA (phần

2.2.1) được phân tích khẳng

định trên LC- MS/MS theo

qui trình tóm tắt như sau:

a Thiết bị:

Hệ thống LC-MS/MS: Waters

Quattro-micro API (tripple

quadrupole, ESI(-)

b Qui trình chuẩn bị mẫu:

Dư lượng CAP trong 3g mẫu

đuợc ly trích bằng 6ml ethyl

acetate Dịch chiết đuợc cô

đến khô

ở 50oC dưới dòng nitơ Cặn khô được hoà tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch

sơ bộ bằng 1ml hexan và sau đó được làm tinh sạch bằng cột C18 Hàm luợng CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích trên

LC-MS/MS

c Phân tích trên LC-MS/MS:

Các thông số chính:

LC: Pha động: ACN:

H20 (80:20) Tốc độ

dòng: 0,3ml

Thể tích tiêm:10ul

MS/MS: ESI (-)

6

MRM : 321->152

321->194 321->256 326->157 Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương

để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm Nội chuẩn CAP-d5 được sử dụng

để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền mẫu (biological maxtrices) đối với kết quả phân tích Ngoài ra, hàng năm phòng kiểm nghiệm đều tham gia các chương trình thử nghiệm thành thạo do FAPAS tổ chức (thuộc Phòng Thí nghiệm Trung tâm của Vương quốc Anh - Central Science Laboratory, UK) và đạt kết quả tốt (Z score < 2)

Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method) Liên minh châu Âu (Chỉ thị

657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe

về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và

âm tính giả của xét nghiệm

D PH Ư LƯỢNG KHÁNG SINH? Ơ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG NG PHÁP ELISA

I GI I THI U CHUNG ỚI THIỆU SƠ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG ỆU SƠ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG

ELISA (Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp

thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa

trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Trong đó tính chất họat hóa của enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi

Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB

7

II NGUYÊN T C ẮC

Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu,KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do

có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo

ra các sản phẩm có màu hay phát sáng

III NG D NG ỨNG DỤNG ỤNG

Trong thực phẩm

►Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh

►Phát hiện độc tố trong tảo

►Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực phẩm

►Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản khác)

►Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu…

Trong y học

►Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát hiện kháng nguyên p24

►Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C,bệnh ung thư

8

►Ứng dụng để phát hiện bệnh A cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại

giun kí sinh ở phổi chuột gây ra

►Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên

IV NG D NG PH ỨNG DỤNG ỤNG Ư LƯỢNG KHÁNG SINH? Ơ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG NG PHÁP ELISA Đ PHÂN TÍCH T N D KHÁNG Ể PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG ỒN DƯ KHÁNG Ư LƯỢNG KHÁNG SINH? SINH TRONG TÔM

Nhóm QUINOLONE trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc

Dung dịch kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được

sử dụng trong nghiên cứu này gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, Ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)

Dung dịch gốc 1 mg/ml: hoà tan trong methanol với sự có mặt của NH 4

OH 2M

Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất

Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2HO và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất)

Kít ELISA phân tích quinolone: 10 bộ kít thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí nghiệm Hormonologie - CER, Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp

Cách lấy mẫu

Chín mươi mẫu tôm được lấy ngẫu nhiên 6 đợt độc lập vào 6 tháng khác nhau trong năm (tháng 5, 6, 7, 10, 11 và 12 năm 2006) tại các chợ 4 địa phương đại diện gồm Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định và Nghệ An Mỗi địa phương, mỗi đợt lấy 3 mẫu tại các quầy ở các chợ khác nhau Riêng Hà Nội, ngoài chợ mẫu còn được lấy ở ba siêu thị Các mẫu đều có nguồn gốc từ các đầm nuôi ở các địa phương đại diện, riêng mẫu được lấy tại Hà Nội được xác định nguồn gốc từ Quảng Ninh, Hải Phòng và Nam Định Mẫu sau khi lấy được bảo quản lạnh chuyển về phòng thí nghiệm loại bỏ đầu và vỏ Sau khi nghiền đồng nhất bằng máy moulinex, mẫu được lưu giữ ở âm 80°C

Tính ổn định của kít được đánh giá qua kết quả phân tích đường chuẩn của 10

bộ kít thuộc 5 lô vào các ngày khác nhau, mỗi nồng độ khi thử trên một bộ kít được lặp lại 2 lần Đường chuẩn được xây dựng trên cơ sở phân tích 6 dung dịch chuẩn sarafloxacin có nồng độ tương ứng là 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0 ng/ml

Để đánh giá khả năng phát hiện và khả năng ứng dụng của kít trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, các tham số liên quan đến khả năng phát hiện của phương pháp được đánh giá theo tiêu chuẩn châu Âu Mỗi kháng sinh

9

thử 20 mẫu trắng (được xem như mẫu thực sự âm tính) và 20 mẫu củng cố các quinolone đại diện ở nồng độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện (0,7 ppb) Các tham số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính toán theo các công thức sau:

Trong đó :

N là tổng số mẫu phân tích = N+ + N

-N+ là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố)

N- là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng)

PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu

FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu

FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu

NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu

10

Độ đặc hiệu, tính chọn lọc và độ xác thực của phương pháp

Kết quả phân tích mẫu tôm trên thị trường một số địa phương phía Bắc

12

Kít ELISA của hãng CER Vương quốc Bỉ có khả năng phát hiện tốt các kháng sinh thuộc nhóm quinolone trong tôm ở nồng độ lớn hơn hoặc bằng 0,7 ppb

Khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện phòng thí nghiêm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002) Tuy nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolone và xác định nồng độ chính xác cần phải khẳng định lại bằng các phương pháp khẳng định lý hoá khác Tất cả các địa phương nghiên cứu đều phát hiện mẫu bị nhiễm quinolone với nồng độ dư lượng cao nhất là 145 ppb và thấp nhất là 0,4 ppb (tỷ lệ nhiễm 10%) Trong đó có 4 mẫu không đạt yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm theo qui định của Việt Nam và Uỷ ban Châu Âu

E K T LU N ẾT LUẬN ẬN

Để có thể hạn chế được các chất kháng sinh thì ta phải áp dụng tối đa các biện pháp phòng tránh các chất kháng sinh, mà đặc biệt nhất là cấm sử dụng dư chất kháng sinh trong nuôi trồng gia súc, gia cẩm, thủy hải sản Ngoài ra, phải tăng cường phổ biến thông tin, nâng cao năng lực của người nông dân trong vấn đề chăn nuôi, cũng như ý thức của người nông dân và doanh nghiệp nhằm phòng tránh trường hợp thực phẩm bị nhiễm quá nhiều thuốc kháng sinh, gây hại cho người tiêu dùng

13