Đánh giá và xác định quy trình phân tích kháng sinh trong thủy sản, đại học nông lâm tp HCM

Đánh giá và xác định quy trình phân tích kháng sinh trong thủy sản GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng Nhóm 6: Đào Trần Mỹ Phương Trần Hoàng Phượng Trần Thị Kim Ngân Liên Thanh Nhã Nguyễn Thanh Ph

Đánh giá và xác định quy trình phân

tích kháng sinh trong thủy sản

GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng

Nhóm 6:

Đào Trần Mỹ Phương Trần Hoàng Phượng Trần Thị Kim Ngân Liên Thanh Nhã

Nguyễn Thanh Phú

Nhóm 6:

Đào Trần Mỹ Phương Trần Hoàng Phượng Trần Thị Kim Ngân Liên Thanh Nhã

Nguyễn Thanh Phú

MỤC LỤC

I Mở đầu

II Nguyên nhân tồn đọng kháng sinh trong thủy sản

III Tác hại của kháng sinh trong thủy sản

IV Giới thiệu phương pháp Elisa

I Mở đầu

• Dư lượng kháng sinh là tình trạng kháng sinh chứa trong thực phẩm (thịt, cá, trứng, sữa, ) còn ở dạng nguyên chất hay đã bị chuyển hóa mà việc sử dụng những loại thực phẩm này có thể gây ra những tác hại không ngờ đối với người tiêu dùng.

• Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây những bệnh hiểm nghèo như ung thư, đột biến gen, quái thai, dị ứng và tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh

- Do thiếu hiểu biết hoặc do tiết kiệm đá đã sử

dụng kháng sinh hoá chất độc hại, nh :

Chloramphenicol, Nitrofurans, hàn the, urê,

sunfit … để bảo quản thuỷ sản để bảo quản thuỷ sản.

- Do nhiễm từ kem bôi tay của công nhân

(trong thành phần có chứa kháng sinh cấm

Chloramphenicol)

- Do cố tình sử dụng trong quá trình sơ chế

(công đoạn ngâm nhúng, tẩy trắng, … để bảo quản thuỷ sản )

II Nguyờn nhõn tồn đọng khỏng sinh trong thủy sản

Hoá chất, kháng

Chloramphenicol Gây suy tuỷ, còi cọc, ung th máu, nhờn thuốc

Nitrofuran Gây độc trên gen di chuyền, gây ung th , nhờn thuốc

Hàn the

Gõy rối loạn tiờu húa, suy dinh dưỡng, giảm trớ nhớ, tổn

thương và hư hại tế bào gan, …

kinh

III Tỏc hại của khỏng sinh trong thủy sản

IV Giới thiệu phương pháp ELISA

ELISA ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét

nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa

trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Trong đó tính chất họat hóa của enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi

Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu,KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do

có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng

1 Nguyên tắc

Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA

Có 2 phương pháp xét nghiệm ELISA:

Phương pháp ELISA gián tiếp(indirect ELISA):

dùng để phát hiện kháng thể chuyên biệt trong huyết thanh

Phương pháp ELISA trực tiếp( direct ELISA): dùng

để phát hiện kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

3 Ứng dụng

Trong thực phẩm

Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh

Phát hiện độc tố trong tảo

Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực phẩm

Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép

có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản khác)

Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu…

Ứng dụng để phát hiện bệnh A cantonensis (bệnh viêm

màng não) do loại giun kí sinh ở phổi chuột gây ra

Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Tây Nguyên

Trung-IV Ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích tồn

2/ Đánh giá kết quả thử nghiệm dư lượng Chloraphenicol trong thủy sản thông qu phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS

1/ Nhóm QUINOLONE trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc

1/ Nhóm QUINOLONE trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc

1/ Một số khái niệm

4/ Kết quả và đánh giá

3/ Phương pháp

2/ Cách lấy mẫu

Mẫu trắng: là mẫu tôm không chứa nhóm kháng sinh

quinolone đã được khẳng định bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối (LC-MS/MS) tại phòng thí nghiệm phân tích thực phẩm - Bộ môn Khoa học thực phẩm- Khoa Thú y - Đại học

Liège, Vương quốc Bỉ

Dung dịch kháng sinh chuẩn: Kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được sử dụng trong nghiên cứu này gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, Ciprofloxacin và

sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)

Dung dịch gốc 1 mg/ml: hoà tan trong methanol với sự

có mặt của NH 4 OH 2M

Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất

Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam

Na2HPO4.2HO và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất)

Kít ELISA phân tích quinolone: 10 bộ kít thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí nghiệm Hormonologie - CER,

Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp

Cách lấy mẫu

Chín mươi mẫu tôm được lấy ngẫu nhiên 6 đợt độc lập vào

6 tháng khác nhau trong năm (tháng 5, 6, 7, 10, 11 và

12 năm 2006) tại các chợ 4 địa phương đại diện gồm

Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định và Nghệ An Mỗi địa

phương, mỗi đợt lấy 3 mẫu tại các quầy ở các chợ

khác nhau Riêng Hà Nội, ngoài chợ mẫu còn được lấy ở

ba siêu thị Các mẫu đều có nguồn gốc từ các đầm nuôi ở các địa phương đại diện, riêng mẫu được lấy tại Hà Nội được xác định nguồn gốc từ Quảng Ninh, Hải Phòng

và Nam Định Mẫu sau khi lấy được bảo quản lạnh chuyển

về phòng thí nghiệm loại bỏ đầu và vỏ Sau khi nghiền đồng nhất bằng máy moulinex, mẫu được lưu giữ ở âm 80°C

Tính ổn định của kít được đánh giá qua kết quả phân tích đường chuẩn của 10 bộ kít thuộc 5 lô vào các ngày khác

nhau, mỗi nồng độ khi thử trên một bộ kít được lặp lại 2

lần Đường chuẩn được xây dựng trên cơ sở phân tích 6

dung dịch chuẩn sarafloxacin có nồng độ tương ứng là 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0 ng/ml

Để đánh giá khả năng phát hiện và khả năng ứng dụng của kít trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, các tham số liên quan đến khả năng phát hiện của phương pháp được đánh giá theo tiêu chuẩn châu Âu Mỗi kháng sinh thử 20 mẫu trắng (được xem như mẫu thực sự âm

tính) và 20 mẫu củng cố các quinolone đại diện ở nồng

độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện (0,7 ppb) Các tham

số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính toán theo các công thức sau:

Trong đó :

N là tổng số mẫu phân tích = N + + N

-N + là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố)

N - là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng)

PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N + mẫu

FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N + mẫu

FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N - mẫu

NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N - mẫu

Kết quả và đánh giá

Tính ổn định và khả năng phát hiện

Độ đặc hiệu, tính chọn lọc và độ xác thực của phương pháp

Kết quả phân tích mẫu tôm trên thị trường một số địa phương phía Bắc

Kết quả phân tích mẫu tôm trên thị trường một số địa phương phía Bắc

Kết luận

• Kít ELISA của hãng CER Vương quốc Bỉ có khả

năng phát hiện tốt các kháng sinh thuộc nhóm

quinolone trong tôm ở nồng độ lớn hơn hoặc bằng 0,7 ppb.

• Khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện phòng thí nghiêm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002)

Tuy nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolone và xác định nồng độ chính xác cần phải khẳng định lại bằng các phương pháp khẳng định lý hoá khác.

Tất cả các địa phương nghiên cứu đều phát hiện mẫu bị nhiễm quinolone với nồng độ dư lượng cao nhất là 145 ppb và thấp nhất là 0,4 ppb (tỷ lệ nhiễm 10%) Trong đó

có 4 mẫu không đạt yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm

theo qui định

của Việt Nam và Uỷ ban Châu Âu

2/ Đánh giá kết quả thử nghiệm dư lượng Chloraphenicol trong thủy sản thông qu phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS

2/ Đánh giá kết quả thử nghiệm dư lượng Chloraphenicol trong thủy sản thông qu phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS

Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực

Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm

lượng CAP trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm

Giới hạn phát hiện: 0,1ppb

thực nghiệm

Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong

thực nghiệm

Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong

thực nghiệm

• Các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được phân

tích khẳng định trên LC-MS/MS theo qui trình tóm

tắt như sau:

a Thiết bị: Hệ thống LC-MS/MS: Waters

Quattro-micro API (tripple quadrupole, ESI(-)

b Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu

đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate Dịch chiết đuợc

cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ Cặn khô được hoà tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch sơ bộ bằng 1ml

hexan và sau đó được làm tinh sạch bằng cột C18

Hàm luợng CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích

trên LC-MS/MS

• Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng

âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết

quả thử nghiệm Nội chuẩn CAP-d5 được sử dụng

để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền mẫu

(biological maxtrices) đối với kết quả phân tích

Ngoài ra, hàng năm phòng kiểm nghiệm đều tham gia các chương trình thử nghiệm thành thạo do

FAPAS tổ chức (thuộc Phòng Thí nghiệm Trung

tâm của Vương quốc Anh - Central Science

Laboratory, UK) và đạt kết quả tốt (Z score < 2).

Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong

thực nghiệm Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong

thực nghiệm

Kết quả đánh giá

Tỷ lệ dương tính giả trên ELISA

Bảng 1 Tổng hợp kết quả phân tích sàng lọc CAP trên ELISA và khẳng định trên LC-MS/MS

với LC_MS/MS

Dương tính thật (phát hiện > 0,5ppb với LC- MS/MS)

Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả

Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả

phân tích

Giá trị hàm lượng CAP xác định bằng ELISA

Tỷ lệ dương tính giả nói chung không cao cho các dạng mẫu thủy sản tươi chưa qua chế biến (0.5 – 1.5%) điều này cho thấy ELISA là một công cụ hữu hiệu cho việc sàng lọc CAP với các đối tượng mẫu này Tuy nhiên đối với nhóm

thực phẩm thủy sản phối chế, tỷ lệ dương tính giả là rất đáng

kể (12.5 – 43.3%) nên cần lưu ý khi tiến hành phân tích, đồng thời nó gây tăng số lượng mẫu cần phải kiểm khẳng định

bằng LC-MS/MS

Với những kết quả nêu trên, phân tích khẳng định trên

LC-MS/MS cho các mẫu dương tính trên ELISA vẫn rất cần thiết Hiện tượng âm tính giả cũng là một tiêu chí quan trọng trong xét nghiệm bằng ELISA, tuy nhiên trong phạm vi

nghiên cứu này chúng tôi chưa có điều kiện đánh giá cụ thể

Kết luận