Đánh giá và xác định quy trình phân tích kháng sinh trong thủy sản, đại học nông lâm tp HCM

Đánh giá xác định quy trình phân tích kháng sinh thủy sản GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng Nhóm 6: Đào Trần Mỹ Phương Trần Hoàng Phượng Trần Thị Kim Ngân Liên Thanh Nhã Nguyễn Thanh Phú MỤC LỤC I Mở đầu II Nguyên nhân tồn đọng kháng sinh thủy sản III Tác hại kháng sinh thủy sản IV Giới thiệu phương pháp Elisa Nguyên tắc Phương pháp Ứng dụng V Ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích tồn dư kháng sinh Nhóm QUINOLONE tơm số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc Đánh giá kết thử nghiệm dư lượng Chloraphenicol thủy sản thông qu phân tích khẳng định LC – MS/MS I Mở đầu • Dư lượng kháng sinh tình trạng kháng sinh chứa thực phẩm (thịt, cá, trứng, sữa, ) cịn dạng ngun chất hay bị chuyển hóa mà việc sử dụng loại thực phẩm gây tác hại không ngờ người tiêu dùng • Tồn dư kháng sinh thực phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng môi trường, nguyên nhân gây bệnh hiểm nghèo ung thư, đột biến gen, quái thai, dị ứng tăng nguy xuất nguồn gen kháng thuốc chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh II Nguyên nhân tồn đọng kháng sinh thủy sản - Do thiÕu hiÓu biết tiết kiệm đá đà sử dụng kháng sinh hoá chất độc hại, nh: Chloramphenicol, Nitrofurans, hàn the, urê, sunfit để bảo quản thuỷ sản - Do nhiễm từ kem bôi tay công nhân (trong thành phần có chứa kháng sinh cấm Chloramphenicol) - Do cố tình sử dụng trình sơ chế (công đoạn ngâm nhúng, tẩy trắng, ) III Tỏc hi ca khỏng sinh thủy sản Ho¸ chÊt, kh¸ng sinh Chloramphenicol Nitrofuran Sunfit Hàn the Urê Tác hại Gây suy tuỷ, còi cọc, ung th máu, nhờn thuốc Gây độc gen di chuyền, gây ung th, nhờn thuốc Gây dị ứng Gây rối loạn tiêu hóa, suy dinh dưỡng, giảm trí nhớ, tổn thương hư hại tế bào gan, … Gây ảnh hưởng đến hệ thần kinh IV Giới thiệu phương pháp ELISA ELISA ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa kết hợp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Trong tính chất họat hóa enzyme độ đặc hiệu kháng thể không đổi Nguyên tắc Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt đĩa giếng Nếu có diện KN mẫu,KN tạo phức hợp với KT cố định giếng KT tự có gắn enzyme tạo thành phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA Độ đặc hiệu, tính chọn lọc độ xác thực phương pháp Kết phân tích mẫu tơm thị trường số địa phương phía Bắc Kết luận • Kít ELISA hãng CER Vương quốc Bỉ có khả phát tốt kháng sinh thuộc nhóm quinolone tôm nồng độ lớn 0,7 ppb • Khả phát hiện, hiệu lực kít điều kiện phịng thí nghiêm Việt Nam đáp ứng yêu cầu phương pháp bán định lượng qui định Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002) Tuy nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolone xác định nồng độ xác cần phải khẳng định lại phương pháp khẳng định lý hoá khác Tất địa phương nghiên cứu phát mẫu bị nhiễm quinolone với nồng độ dư lượng cao 145 ppb thấp 0,4 ppb (tỷ lệ nhiễm 10%) Trong có mẫu khơng đạt u cầu vệ sinh an toàn thực phẩm theo qui định Việt Nam Uỷ ban Châu Âu 2/ Đánh giá kết thử nghiệm dư lượng Chloraphenicol thủy sản thông qu phân tích khẳng định LC – MS/MS Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng thực nghiệm Kít thử Elisa: Kit thử hãng R-Biopharm TAPB Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP 3g mẫu đuợc ly trích 6ml ethyl acetate Dịch chiết đuợc đến khơ 50oC dịng nitơ Cặn khơ hồ tan 1ml đệm làm 1ml hexan Hàm luợng CAP dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lượng CAP dịch chiết Elisa tuân thủ theo hướng dẫn nhà sản xuất Mỗi loạt thử nghiệm có kèm theo mẫu chứng âm chứng dương để kiểm soát chất lượng kết thử nghiệm Giới hạn phát hiện: 0,1ppb Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng thực nghiệm c Phân tích LC-MS/MS: Các thơng số chính: LC: Pha động: ACN: H20 (80:20) Tốc độ dịng: 0,3ml Thể tích tiêm:10ul MS/MS: ESI (-) MRM : 321->152 321->194 321->256 326->157 Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng thực nghiệm • Các mẫu phát dương tính ELISA phân tích khẳng định LC-MS/MS theo qui trình tóm tắt sau: a Thiết bị: Hệ thống LC-MS/MS: Waters Quattromicro API (tripple quadrupole, ESI(-) b Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP 3g mẫu đuợc ly trích 6ml ethyl acetate Dịch chiết đuợc cô đến khô 50oC dịng nitơ Cặn khơ hồ tan 1ml NaCl 4%, làm sơ 1ml hexan sau làm tinh cột C18 Hàm luợng CAP dịch giải hấp đuợc phân tích LC-MS/MS Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng thực nghiệm • Mỗi loạt thử nghiệm có kèm theo mẫu chứng âm chứng dương để kiểm soát chất lượng kết thử nghiệm Nội chuẩn CAP-d5 sử dụng để hạn chế tối đa ảnh hưởng mẫu (biological maxtrices) kết phân tích Ngồi ra, hàng năm phịng kiểm nghiệm tham gia chương trình thử nghiệm thành thạo FAPAS tổ chức (thuộc Phịng Thí nghiệm Trung tâm Vương quốc Anh - Central Science Laboratory, UK) đạt kết tốt (Z score < 2) Kết đánh giá Tỷ lệ dương tính giả ELISA TT Loại thuỷ sản Cá loại Tôm loại Cua, ghẹ Nhuyễn thể loại Thủy sản tẩm bột Thủy sản khơ loại Chả giị, há cảo Mắm hải sản loại Tổng số: Số mẫu phân tích 7255 4253 606 600 302 242 125 35 13.418 Dương tính giả (Không phát với LC_MS/MS Số lượng 42 19 36 33 13 13 167 Tỷ lệ (%) 0.6 0.5 1.5 0.5 12.2 18.2 13.8 43.3 1.3 Dương tính thật (phát > 0,5ppb với LCMS/MS) Số Tỷ lệ lượng (%) 76 1,0 63 1,5 62 10,2 0,5 2,6 61 25,2 31 24,8 14,3 309 2,3 Bảng Tổng hợp kết phân tích sàng lọc CAP ELISA khẳng định LC-MS/MS Tương quan nồng độ CAP xác định ELISA tỷ lệ dương giả Lọai thủy sản Số mẫu phân tích Giá trị hàm lượng CAP xác định ELISA ≥0.3 ppb ≥0.5 ≥1 ppb Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ lượng (%) lượng (%) lượng (%) Cá loại 7255 15 0.21 0.10 0.03 Tôm loại 4253 0.17 0.02 0.02 Cua, ghẹ 606 0.55 0.37 0.18 Nhuyễn thể 600 - 0.00 - 0.00 - 0.00 Thủy sản tẩm bột 302 1.36 0.34 0.00 Thủy sản khơ loại Chả giị, há cảo 242 13 7.18 11 6.08 4.42 125 4.26 3.19 1.06 35 13.33 3.33 0.00 Mắm hải sản loại Bảng Tương quan nồng độ CAP xác định ELISA tỷ lệ dương giả Kết luận Tỷ lệ dương tính giả nói chung khơng cao cho dạng mẫu thủy sản tươi chưa qua chế biến (0.5 – 1.5%) điều cho thấy ELISA công cụ hữu hiệu cho việc sàng lọc CAP với đối tượng mẫu Tuy nhiên nhóm thực phẩm thủy sản phối chế, tỷ lệ dương tính giả đáng kể (12.5 – 43.3%) nên cần lưu ý tiến hành phân tích, đồng thời gây tăng số lượng mẫu cần phải kiểm khẳng định LC-MS/MS Với kết nêu trên, phân tích khẳng định LC-MS/MS cho mẫu dương tính ELISA cần thiết Hiện tượng âm tính giả tiêu chí quan trọng xét nghiệm ELISA, nhiên phạm vi nghiên cứu chúng tơi chưa có điều kiện đánh giá cụ thể ... bán định lượng qui định Quy? ??t định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002) Tuy nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolone xác định nồng độ xác cần phải khẳng định lại phương pháp khẳng định. .. kết phân tích số N+ mẫu FN số mẫu âm tính theo kết phân tích số N+ mẫu FP số mẫu dương tính theo kết phân tích số N- mẫu NA số mẫu âm tính theo kết phân tích số N- mẫu Kết đánh giá Tính ổn định. .. Bảng Tổng hợp kết phân tích sàng lọc CAP ELISA khẳng định LC-MS/MS Tương quan nồng độ CAP xác định ELISA tỷ lệ dương giả Lọai thủy sản Số mẫu phân tích Giá trị hàm lượng CAP xác định ELISA ≥0.3