Báo cáo môn học kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm bacillus cereus

Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus: 1.1 Giới thiệu chung về độ tố của B.cereus Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là phạm vi ảnh hưở

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Mục lục:

1 Giới tiệu về Bacillus cereus:

Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, theo phân loại quốc tế thuộc giới Bacteria, ngành: firmicutes, lớp: Bacilli, bộ: Bacillales, họ: Bacillaceaem,

chi: Bacillus, loài: Cereus.Trong chi Bacillus này ngoài loài cereus còn có một số loài như: Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus thuringiensis, Bacillus natto,

Paenibacillus larvae

Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955 Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều

1.1 Đặc điểm Bacillus cereus:

Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ Vi khuẩn không tạogiáp mô, không có khả năng di động

Hình 1: Hình ảnh Bacillus cereus trên kính hiển vi

Hình 2: Hình ảnh Bacillus cereus trên môi trường BA

1.2 Đặc điểm nuôi cấy:

 Là loại vi khuẩn dễ mọc

 Hiếu khí và kị khí tùy nghi

 Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC

 pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2 trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì

 Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng

 Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh

Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố

 Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt ,rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruộtgây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng

 Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày

Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn

Triệu chứng trúng độc:

 Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Bệnh

có thể kéo dài 24 giờ

Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt Bắt đầu sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24 giờ

Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80oC trước khi ăn

So sánh độc tố type 1 và type 2:

5 Bền với nhiệt 6 45oC/30 phút 7 120oC/90 phút

8 pH 9 ổn định pH 4-11 10 ổn định pH 2-11

11 Tính nhạy 12 Nhạy với enzym

protease và trysin 13 Kháng pepsin và trypsin

1 Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus:

1.1 Giới thiệu chung về độ tố của B.cereus

Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số các nguyên nhân là do vi rút) ở Norway (1988-1993), 47% ở Iceland (1985-1992) Tỷ lệ thấp hơn nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S

(1.3%) và Canada (2.2%) Ở Anh và xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995 Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó, những ngộ độc khác doB.cer eus gây ra là sự nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễmtrùng mắt Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau Bệnh nôn mửa được mô tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), nguyên nhân gây

ra ngộ độc này là do chuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) đã hình thành trước ở trong thực phẩm (ví dụ như Gạo) Triệu chứng bao gồm sự buồn nôn, sự nôn mửa ra và đau dạ dày

(bảng 1-1) Bệnh tiêu chảy được mô tả với thời kỳ ủ bệnh từ 8 – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, đi tiêu ra nhiều nước và đau thắt trực tràng (bảng 1-2) Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc tố đường ruột trong thời kỳ sinh trưởng củaB.cer eus trong ruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử của vi khuẩn Thông thường

cả hai triệu chứng này là tương đối nhẹ, kéo dài ít nhất là 24h và không phải luôn luôn đòi hỏi phải dùng thuốc Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu chảy có thể xảy

ra, nguyên nhân có lẻ là do các tế bào biểu mô chiếm đa số trong ruột non khi các bào tử củaB.cer eus sinh sôi nảy nở và sản sinh ra độc tố đường ruột

Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B Cereus

Tính chất/ Hoạt động Mô tả

Liều nhiễm độc Số lượng B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm

Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg g/kg Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 - 30oC)

Thời kỳ ủ bệnh ½ đến 5h

Khoảng thời gian mang bệnh 6 - 24h

Triệu chứng Buồn nôn, nôn mửa

Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở

Tên của độc tố Cereulide

Cấu trúc của độc tố Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] Khối lượng phân tử 1.2 kDa

Sinh kháng thể Không (none)

Hoạt động sinh học trên người Gây nôn

Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào

Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121oC

Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không

Việc sản sinh ra độc tố như thế nào Chưa biết, nhưng có thể liên quan đến enzyme 2.2 Cơ chế gây bệnh

2.2.1 Triệu chứng nôn mửa

Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa đã được thể hiện

ở bảng 1-1 Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu biết sâu sắc hơn về triệu chứng này Độc tố emetic có tên là cereulide và là một chuỗi polypeptide

ba lần lặp lại của bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1)

Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do Bacillus cereus sản sinh ra Bài báo này giải quyết được nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13 (13C) liệt kê ra trên 3 loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường

tổng hợp trung gian Sự phân tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI – MS của phương pháp kính quang phổ trên

cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide của nó Sự hợp nhất của nguyên tử cacbon số 13 (13C) là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và L-Val, trong khi đó chỉ có 40%13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide

Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó là triệu chứng nôn mửa và triệu chứng tiêu chảy Phần lớn những ngộ độc do Bacillus cereus gây

ra chỉ mới phát hiện sau này

2.1.1 Triệu chứng tiêu chảy

Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quá

trình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm phục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận Điều này xảy

ra khi, số lượng B.cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày vàenzyme proteolytic của tá tràng Những nhân tố này sẽ làm giảm một cách nhanh chóng hoạt động của độc tố đường ruột thấp ơn 1% sơ với mức độ ban đầu Thời gian tương đối dài giữa việc ăn vào những sinh vật này với việc xuất hiện những triệu chứng của bệnh Đặc điểm của triệu chứng tiêu chảy được thể hiện trong bảng 1-3 Mức độ biến đổi của liều lây nhiễm có lẽ do khả năng sản sinh ra các độc tố đường ruột khác nhau và do tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác nhau

Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B cereus

Đặc tínhLiều gây nhiễm Thông thường là 105/g hoặc /ml

Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non

Loại độc tố Protein

Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h

Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h

Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn

Bào tử của B cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu

mô của người) Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp

đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ

tập trung khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn như đã quan sát

Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm

từ B cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay vẫn còn đang tranh luận

Cả dạng đơn và dạng phức của độc tố đường ruột được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy Có hai sự khác biệt trong ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm B cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp phần với các phân tử trọng lượng khoảng từ 40 – 100 kDa Một số hiểu biết hiện tại về độc tố đường ruột của B cereus được thể hiện ở bảng 1-3

Bảng 1-3 Properties of Enterotoxin Isolated from Bacillus cereus

Enterotoxin/Reference Molecular Weight Biogogical Test Used DNA SequencedOnce main Pro 50 kDa Positive on: rabit loop tests No

and two other pro vascular permeability tests

component and mouse lethality

Three component 38.0 kDa Positive on: rabit loop tests, No

39.5 kDa vascular permeability tests,

43 kDa and Vero call test One component 45 kDa Positive on: rabit loop tests No

vascular permeability tests, and mouse lethality testsOne toxin component 40 kDa Positive on: Vero cell test No

and one non-toxin 48 kDa and Ca-co2 (human intestinal

component epithelial cells) cell tests

One component 41 kDa Positive on: mouse loop tests, Yes

vascular permeability tests and mouse lethality testsNhững nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố chỉ có một hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan

Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp ngăn ngừa các độc tố sinh ra từ B.cereus trong tương lai gần Hoặc có thể đưa ra các phương pháp giúp phát hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên bất cứ lúc nào

3.Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm

Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương pháp khác nhau Dựa vào thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháptruyền thống và phương pháp phân tích nhanh

3.1 Các phương pháp truyền thống:

Đặc điểm và nguyên tắc:

Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau

Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như

độ nhạy không cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa

Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine,tăng trưởng được trong 0.001% lysozyme, được trình bày trong bảng sau:

Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg Yolk- Polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằngmôi trường này Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN Qui trình phân tích:

25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/1 phút để

có độ pha loãng 10-1 -> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:

Phát hiện bằng môi trường chọn lọc:

Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC: MYP: do

B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo thành

MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng

Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định B.cereus

Các phản ứng khẳng định:

Nhuộm Gram:

Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế bào nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu

Các bước nhuộm Gram:

Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí tương

ứn với vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn -> chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng -> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dung dịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô -> đưa phiến kính ở vị trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi (tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa)

Tương tự cho hai chủng vsv đối chứng trong cùng một phiến kính khác: E.coli làm chủngđối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+)

Có hai phương pháp nhuộm Gram:

 Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên 20giây ->dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài giọt KI/I2 lên vệt bôi/ để yên 1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vài giây -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd

safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dư bằng giấy lọc

 Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng dd crystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I2 / 1 phút -> khử màu bằng cách xịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd safranin/2phút

Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+) có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli) B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không có dạng bào tử nang

Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phíasau

Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth -> ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có sự sinh acid glucose trong điều kiện kị khí)

Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth ->

ủ 35oC/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu cam xuất hiện trong 10phút (chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit)

 Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử

 Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid Ống B cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tính với nitrite

Thử nghiệm VP: Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ

glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid Để khôi phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân ở các loài vi sinh vật, sau đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác nhau Họ Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2 Họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhómsinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter) Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi và môi trường có tính kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase Ngược lại acetoin có thể bị khử thành 2,3-

butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase; ngoài ra acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP

Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceace dựa trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành

diacetyl Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naphthol Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong peptone kết tụ thành phức diacetyl-

guanidine có màu đỏ Trong thuốc thử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng

bổ sung nguồn nhân guanidine

 Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH

 Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là

0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH

 Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH

Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau

đó nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetoin Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h

Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như E.Coli (VP -) bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP +) có màu đỏ trên bề mặt môi trường

Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng tyrosine ->

ủ 35oC/48h -> xuất hiện khuẩn lạc ( chứng tỏ tyrosine bị phân hủy)

Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2.5ml môi trường Nutrient

Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường không chứa lysozyme

-> ủ ở 35oC/24h > kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa và không chứa

lysozyme -> những ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không

Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B.cereus hay không

Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm I:

Thử nghiệm tính di động:

 Phương pháp 1: Dùng que cấy vòng cấy thẳng dịch 24h nuôi vào giữa môi trường kiểm tra di động -> ủ 30oC/ 18-24h -> kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc, dọc theo đừơng cấy Kế quả: loài di động mọc khuýêch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy, loài không di động mọc trong và dọc theo đường cấy

 Phương pháp 2: bổ sung 0.2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng ở 30oC/6-8h -> nhỏ nước vô trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động

Hầu hết các chủng B,cereus, B.thuringiensis là di động; B.anthracis và B.mycoides không di động

Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa

Nutrient agar -> ủ ở 30oC/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B.cereus không tạocấu trúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides (cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy)

Bacillus cereus (không có cấu trúc rễ giả)

Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả)

Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy

-> ủ ở 35oC/24h > B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hòan tòan (β) 2-4 mm ) 2-4 mm xung quanh vùng phát triển B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu β) 2-4 mm B.anthracis thường không làm tan máu sau 24h

Sự tạo độc tố protein dạng tinh thế: cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch

nghiêng nutrient agar -> ủ 30oC/ 24h -> để yên ở nhiệt độ phịng /2-3ngày -> nhuộm bằng phẩm màu fuchsin -> quan sát dưới kính hiển vi

Tinh thể độc tố của B.thuringiensis xuất hiện sau 3 đến 4 ngày nuơi cấy, phát hiện được bằng kỹ thuật nhuộm khi bào tử nang vỡ ra (tinh thể độc tố hình tứ giác dạng kim cương được nhuộm màu tối, nhỏ hơn bào tử) Do đĩ nếu khơng quan sát được bào tử tự

do cần để thêm vài ngày rồi kiểm tra lại B.cereus và các Bacillus khác cùng nhĩm khơngtinh thể độc

 Số tế bào B.cereus/1g thực phẩm = 65 x 4/5 x 10000 x 10 = 5200000 (nhân 10 vì

cĩ 0.1 ml mẫu được trải dĩa)

3.2.Các phương pháp phân tích nhanh:

Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật cĩ thể chia phương pháp này thành hai nhĩm nhỏ: nhĩm dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể (phương pháp miễn dịch) và nhĩm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit

3.2.1 Phương pháp miễn dịch:

Nhĩm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt của tế bào vi sinh vật Dựa trên nguyên tắc này cĩ rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật

3.2.2Phương pháp Elisa

3.2.2.1 Giới Thiệu Chung Về Elisa

Elisa (Enzyme linked Immunosorbent Assay) được tạm dịch là

phương pháp phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, là

phương pháp phân tích trong đó sử dụng kháng thể đặc hiệu để

nhận diện kháng nguyên (thường là Protein)

Phương pháp Elisa được phát triển từ kĩ thuật RIA (Radio

Immuno Assay) vào những năm 1960, bởi Rosalyn Sussman Yalow và

3.2.2Phương pháp Elisa

3.2.2.1 Giới Thiệu Chung Về Elisa

Elisa (Enzyme linked Immunosorbent Assay) được tạm dịch là

phương pháp phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, là

phương pháp phân tích trong đó sử dụng kháng thể đặc hiệu để

nhận diện kháng nguyên (thường là Protein)

Phương pháp Elisa được phát triển từ kĩ thuật RIA (Radio

Immuno Assay) vào những năm 1960, bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Kĩ thuật này nhận biết kháng nguyên dựa trên sự

đánh dấu phóng xạ kháng thể

Phương pháp phân tích Elisa được ứng dụng nhiều trong lĩnh

vực y học, dược học hay thực phẩm dựa trên liên kết kháng thể

và kháng nguyên như: chuẩn đoán bệnh ung thư, HIV, các bệnh do

vi sinh vật khác hay trong xét nghiệm nhanh sự nhiễm vi sinh vật

trong thực phẩm

Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ nhạy cao, phát

hiện được liên kết kháng thể-kháng nguyên ở mức độ nhất

nhỏ, thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét nghiệm

hóa sinh, vi sinh truyền thống

Ở đây, khái niệm kháng thể hay kháng nguyên là có tính tương đối vì trong nhiều trường hợp kháng thể này có thể lại là kháng nguyên đối với kháng thể khác

Các enzyme sử dụng trong đánh dấu thường là:peroxida s e,

beta-galactoxidase, alkaline phosphatase

Hình 3.1 : Các giếng và pipettes trong phân tích Elisa

3.2.2.2 Các phương pháp phân tích Elisa

Phương pháp Elisa trực tiếp ( Direct Elisa )

Trong trường hợp này, kháng nguyên nằm trộn lẫn trong dung dịch đệm sẽ được cho vào đáy giếng Kháng nguyên sẽ liên kết cố định vào bề mặt của đáy giếng Ủ một thời gian ngắn, sau đó tiến hành rửa trôi Những kháng nguyên nào không liên kết sẽ được đưa ra ngoài

Thêm dung dịch chứa kháng thể có gắn enzyme vào giếng,

kháng thể sẽ liên kết với kháng nguyên tạo phức hợp gắn chặt

vào giếng Ủ một thời gian để phức hợp ổn định, sau đó tiến

hành rửa trôi Những kháng thể nào không liên kết với kháng

nguyên sẽ được rửa trôi

Thêm dung dịch cơ chất có hệ đệm vào giếng Nếu có sự

tồn tại của phức hợp kháng thể_E_kháng nguyên thì cơ chất dưới

tác dung của E sẽ tạo màu cho dung dịch Dựa vào sự xuất hiện

màu và cường độ màu trong dung dịch sẽ định tính và định lượng

được kháng nguyên

Phương pháp Elisa gián tiếp (indirect Elisa)

Kháng nguyên sẽ được cho vào đáy giếng Kháng nguyênsẽ liên kết cố định vào bề mặt của đáy giếng Ủ một thờigian ngắn, sau đó tiến hành rửa trôi Những kháng nguyên nàokhông liên kết sẽ được đưa ra ngoài

Đưa kháng thể mục tiêu đặc hiệu vào giếng, ủ một thờigian và tiến hành rửa trôi, chỉ những kháng thể đặc hiệu mớiđược giữ lại cùng kháng nguyên trên bề mặt đáy giếng.

Đưa tiếp dung dịch đệm chứa kháng thể thứ cấp có gắn

emzyme vào, kháng thể này sẽ liên kết với kháng thể mục tiêu Tạo phức hợp kháng nguyên_kháng thể mục tiêu_kháng thể thứ cấp_E Cũng tiến hành ủ và rửa trôi

Khi cho dung dịch chứa cơ chất vào giếng, cơ chất dưới xúc tác của E sẽ có phản ứng tạo màu

Phương pháp này chỉ khác với dạng trực tiếp là phải sửdụng kháng thể thứ cấp để gắn E do kháng thể mục tiêu khôngthể gắn với E

Hình 3.3 : Sơ đồ nguyên tắc Elisa gián tiếp

Phương pháp Elisa Sandwich:

Trực tiếp

Mẫu cần phân tích được cho vào trong đĩa giếng đã được phủ kháng thể chuyên biệt Kháng nguyên trong mẫu sẽ kết hợp với kháng thể trên đĩa giếng và trở nên bất động Đĩa giếng này tiếp tục được rửa để loại bỏ những kháng nguyên không kết hợp được với kháng thể Sau đó, phức hợp kháng thể - enzym (gồm kháng thể liên kết với enzym qua liên kết cộng hóa trị) được thêm vào Kháng thể của phức hợp này sẽ kết hợp với kháng nguyên bất động trên đĩa giếng còn lại sau khi rửa để hình thành 1 bánh sandwich gồm: kháng thể – kháng nguyên – kháng thể/enzyme trên đĩa giếng

Sau khi loại bỏ kháng nguyên hoặc kháng thể, các cộng hợp tự do, cơ chất và chất phát màu tương ứng với enzyme sẽ được cho vào và màu sẽ xuất hiện trong các giếng thử Việc định

lượng hàm lượng kháng thể hoặc kháng nguyên được thực hiện bằng cách đo mật độ quang

giữa mẫu và chất chuẩn nhờ máy máy đọcELISA