BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

Lựa chọn môi trường VRB vì trong VRB có chứa Crystal Violet và muối mật số 3 có khả năng ức chế vi khuẩn gram - giúp loại bỏ các vi khuẩn gram -, ngoài ra muối mật số 3 còn tạo vòng tủa

Họ và tên: Nguyễn Thị Thùy Linh

MSSV: 1318191

Ca: 2A

Nhóm: 14

BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

I Mẫu thực phẩm:

1 Tên mẫu: Thịt heo

2 Ngày thu: 22/12/2015

3 Nơi thu mẫu: Chợ nhỏ gần nhà

II Chuẩn bị môi trường:

Trong quá trình học, nhóm em có chuẩn bị 2 môi trường là BPW (Buffered Pepton Water) và Urea Broth

Đối với môi trường BPW, sẽ chứa cả trong chai và trong ống nghiệm với thể tích như sau:

Chứa trong chai: 250ml/nhóm x 19 nhóm = 4750ml Chứa trong ống nghiệm (1 ống/nhóm): 19 ống x 10ml/ống = 190ml

 Tổng = 4940ml Nhóm pha 5000ml

Môi trường BPW là môi trường từng thành phần nên ta sẽ cân riêng từng thành phần theo

tỉ lệ khối lượng:

Trong: 1000ml H2O có: pepton 10g, NaCl 5g, Na2HPO4.12H2O 9g, KH2PO4 1.5g

 5000ml H2O: pepton 50g, NaCl 25g, Na2HPO4.12H2O 45g, KH2PO4 7.5g Sau khi đã cân đủ các thành phần với khối lượng như trên thì ta mới thêm nước vào (nhưng chưa đủ 5000ml, khoảng 2500ml) rồi khoáy đều lên cho các thành phần tan hết Sau khi các thành phần trong đó tan hết ta đổ môi trường qua ống đong rồi mới thêm nước vào cho tới khi đủ 5000ml Môi trường này không cần vô trùng nên ta chỉ cần lấy ống đong để đong vào chai Còn ống nghiệm thì chúng ta đo 5ml trước, kẻ vạch, sau đó them vào cho tới vạch là được

Đối với môi trường Urea broth, đây là môi trường tổng hợp nên ta sẽ dựa vào khối lượng mà nhà sản xuất ghi trên chai đựng Cần pha: (2 ống/nhóm) 19 nhóm x 2 ống

x 5ml/nhóm = 190ml Pha thành 200ml Trên chai ghi 38.5g/l => cần cân 7.7g Sauk hi cân được 7.7g (trong điều kiện vô trùng, đốt đèn cồn xung quanh), bỏ vào becher rồi cho them nước vào (không đủ 200ml) khoáy tan Sau khi đã khoáy tan, ta đổ môi trường vào ống đong rồi cho them nước vào đến khi đủ 200ml Khi cho môi trường vào trong ống nghiệm ta cũng thực hiện trong điều kiện vô trùng (đèn cồn) Sử dụng xi lanh với đầu tip 5ml có màng lọc (vô trùng) để hút môi trường cho vào ống nghiệm

III Kết quả thí nghiệm:

1 Chỉ tiêu định lượng Coliforms:

Quy trình:

Kết quả: Trên đĩa VRB:

Hệ số pha loãng

Số khuẩn lạc đếm được

Đĩa petri 1 Đĩa petri 2 Đĩa đối chứng

10-3 451 (>300) Không đếm được 23

Kết quả trong ống BGBL: Có 2 ống trong 5 ống mẫu không sinh hơi Ống đối chứng không sinh hơi

 Tỷ lệ xác nhận R: R = Số khuẩn lạc sinh hơi/số khuẩn lạc đã cấy = 2/5 = 0.4

 Tổng số Coliforms (cfu/g): C = NxR/nVf = (165 + 150)x0.4/(2x1x10-4) = 6.3x105 (cfu/g) Đối với Coliforms, vì Coliforms là vi khuẩn gram âm (-), có khả năng lên men lactose sinh acid và có khả năng sinh hơi ở 37oC Nên đầu tiên ta dùng môi trường VRB (môi trường đỏ hồng) để chọn lọc Coliforms Lựa chọn môi trường VRB vì trong VRB có chứa Crystal Violet và muối mật số 3 có khả năng ức chế vi khuẩn gram (-) giúp loại bỏ các vi khuẩn gram (-), ngoài ra muối mật số 3 còn tạo vòng tủa muối mật, lactose là nguồn Carbohydrat, Coliforms sẽ sử dụng

và lên men lactose sinh ra acid, acid sẽ được phát hiện bằng Neutral red có trong môi trường VRB => pH giảm => khuẩn lạc đặc trưng có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, kích thước >= 0.5mm Sau khi chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng, ta cấy vào ống nghiệm môi trường BGBL (có chuông Durham ngược) BGBL là môi trường tổng hợp không chọn lọc, giúp các vi khuẩn trong môi trường khỏe mạnh trở lại Ngoài ra, trong BGBL cũng có lactose giúp phát hiện Coliforms (nếu có Coliforms thì sẽ có các bọt khí trong chuông Durham) Ống đối chứng không sinh hơi có thể là do thao tác thực hiện có sai sót (que cấy còn nóng làm chết, khi lấy sinh khối không lấy được), khi chọn khuẩn lạc trên đĩa đối chứng đã chọn sai khuẩn lạc

Đổ vào 10-15ml VRB đã đun tan và làm nguội 45 o C, chờ đông đặc (khoảng 15’), đổ them 5ml, chờ đông đặc

Lật ngược và ủ ở

37 o C trong 24 giờ

Cấy 1ml mẫu đã pha

loãng 10 -3 và 10 -4 vào đĩa

petri, 2 đĩa/nồng độ

Ủ ở 37 o C trong 24 giờ

Cấy 5 khuẩn lạc đã chọn sang môi trường BGBL

Chọn và đếm các

khuẩn lạc đặc

trưng

Kết luận: Tổng số Coliforms/g trong mẫu là 6.3x105 (cfu/g)

2 Chỉ tiêu định tính E coli giả định

Quy trình:

Kết quả:

LSB Sinh hơi trong chuông Durham,

môi trường đục

Sinh hơi trong chuông Durham,

môi trường đục

EC Broth Sinh hơi trong chuông Durham,

môi trường đục

Sinh hơi trong chuông Durham,

môi trường đục

E coli giả định là Coliforms có khả năng chịu nhiệt (44oC) và có khả năng cho phản ứng indol (+) Đầu tiên, ta sẽ cấy mẫu vào trong môi trường LSB đôi (Lauryl sulphate broth nồng độ đôi)

và đem ủ ở 37oC để chọn lọc Coliforms Vì trong LSB có chứa lauryl sulphate có khả năng ức chế các vi sinh vật không phải là Coliforms, giúp tăng sinh Coiliforms trong mẫu Lactose là nguồn Carbohydrat, giúp phát hiện sự có mặt của Coliforms Coliforms sẽ sử dụng nguồn đường lactose này, lên men và sẽ sinh ra acid Quan sát thấy có sự sinh hơi trong chuông Durham có nghĩa là có sự lên men lactose bởi Coliforms Sau đó, cấy các ống có sinh hơi (có Coliforms) sang môi trường EC broth và ủ ở nhiệt độ 44oC để chọn lọc ra E coli giả định Trong EC broth

có muối mật số 3 có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+), còn sót lại sau khi đã chọn lọc ở

bước tăng sinh E coli giả định trong môi trường LSB đôi trên Lactose được lên men bởi E coli

giả định sinh ra khí trong chuông Durham Đem ủ ở 44oC để chọn lọc ra E coli giả định vì E

coli giả định có thể chịu được nhiệt còn Coliforms thì không chịu được nhiệt Cuối cùng chọn

các ống sinh hơi cấy vào canh trypton và đem ủ ở 44oC trong 24 giờ rồi đem đi thử phản ứng

indol để khẳng định chắc chắn là có E coli giả định Trong canh trypton – môi trường giàu tryptophan, tryptophanase của E coli giả định sẽ thủy phân tryptophan thành indol vì vậy ta cần

ủ 24 giờ để có xuất hiện indol Để phát hiện indol, dùng thuốc thử Kovac có chứa

p-dimethylaminobenzaldehyde Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl ammonium có màu đỏ Vì vậy khi cho thuốc thử Kovac vào ta sẽ thấy có vòng màu đỏ trên bề

Chọn ống sinh hơi cấy sang ống EC broth (10ml)

Ủ ở 44 o C trong

24 giờ

Ủ ở 37 o C trong

24 giờ

Cấy 1g (10ml của

10 -1 ) vào 10ml môi

trường LSB đôi

Thử phản ứng indol,

E coli giả định cho

phản ứng indol (+)

Ủ ở 44 o C trong

24 giờ

Chọn ống sinh

hơi cấy sang

canh trypton

mặt môi trường Để quan sát ta không được lắc ống nghiệm vì nếu ta lắc thì vòng màu đỏ này sẽ tan đi không còn quan sát được nữa

Kết luận: Phát hiện E coli giả định trong 1g mẫu thịt tươi.

3 Chỉ tiêu định lượng S aureus

Quy trình:

Kết quả: Trong môi trường BPA:

Trong môi trường TSA: Có 3 trong 5 ống mẫu đông tụ và ống đối chứng đông tụ Cả 4 ống đều đông tụ sau 4 giờ ủ và đều bị tan sau đó Sau khi ủ được 24 giờ thì vẫn không có ông nào đông tụ trở lại

 Tỷ lệ xác nhận R: R = số ống huyết tương đông tụ/số khuẩn lạc đã cấy = 3/5 = 0.6

 Tổng số S aureus (cfu/g): C = (N/nVf)xR = (42+98)x0.6/(2x1x10-3) = 4.2x104 (cfu/g)

Staphylococcus Aureus là vi khuẩn gram (+), sống hiếu khí tùy nghi, cho phản ứng catalase,

coagulase dương tính, có khả năng lên men tạo acid từ mannitol và có khả năng tạo độc tố enterotoxin bền nhiệt Đầu tiên, ta cấy mẫu lên môi trường BPA BPA là môi trường chọn lọc để

phát hiện và đếm số S aureus Khuẩn lạc đặc trưng là khuẩn lạc tròn, lồi, đen bóng, có quầng

sáng và quầng trong bao quanh, đôi khi chỉ có 1 trong 2 quầng trên Màu đen của khuẩn lạc là do tellurite (egg yolk tellurite) tạo nên Trong BPA có LiCl giúp ức chế các quần thể vi khuẩn

thường hiện diện cùng với S aureus Natri pyruvate và L-lysine kích thích sự tăng trưởng của S

aureus Nấm men cung cấp phức hệ vitamin B kích thích tăng trưởng Vì vậy sẽ giúp cho tỉ lệ S aureus trong mẫu tăng lên Sau đó, chọn ra 5 khuẩn lạc đặc trưng rồi đem cấy vào môi trường

TSA (trypton soya agar) TSA là môi trường giàu dinh dưỡng, giúp tăng sinh không chọn lọc Trong TSA có trypton và soya pepton là nguồn cung cấp đạm, vitamin và cacbon giúp cho vi

sinh vật tăng sinh trở lại một cách tối ưu Sau khi đã chọn lọc trong môi trường BPA, S aureus

cần được tăng sinh, phát triển trở lại để có thể thể hiện đầy đủ đặc tính khi ta cho cấy chuyển vào

Cấy 0.1ml dd mẫu ở 10 -3 lên

bề mặt 2 đĩa môi trường BPA,

trải đều bằng que tam giác

Chuyển 5 khuẩn lạc

đã đếm sang môi trường TSA

Ủ ngược đĩa ở 37 o C trong 48 giờ => đếm số khuẩn lạc đặc trưng

Ủ ở 37 o C qua

đêm

Cấy vào ống chứa 0.3ml huyết tương

Ủ ở 37 o C và theo dõi sau 2,4,6,8 giờ Nếu không có biểu hiện ngưng kết sẽ ủ đến 24 giờ.

Hệ số pha loãng

Số khuẩn lạc đếm được

Đĩa petri 1 Đĩa petri 2 Đĩa đối chứng

huyết tương S aureus có cho hiện tượng đông tụ huyết tương nên ta cấy chuyển mẫu vào ống huyết tương để kiểm tra mẫu Trong S aureus có enzyme Coagulase sẽ tác động vào làm hoạt

hóa quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm và một

enzyme vách vi khuẩn giúp S aureus tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó Làm hình thành nên các cục đông tụ huyết tương Nhưng trong S aureus có enzyme protease, nên khối fibrin có thể

bị cắt bởi protease làm tan cục huyết tương Vì vậy, chúng ta cần quan sát thường xuyên (2,4,6,

…,24 giờ) để quan sát kĩ nhất sự đông tụ huyết tương

Kết luận: Tổng số S aureus/g trong mẫu là 4.2x104 (cfu/g)

4 Chỉ tiêu định tính Salmonella

Quy trình:

Ủ ở 42 o C trong

24 giờ

Chuyển 0.1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường RV

Ủ ở 37 o C trong 16-24 giờ

Cân 25g mẫu +

225g BPW,

đồng nhất

Ủ ở 37 o C trong 24 giờ

Ủ ở 37 o C trong khoảng 4-6 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường BHI

Ủ ở 37 o C trong 24 giờ

Cấy phân lập

sang môi

trường XLD

Cấy vào các môi trường thử nghiệm

sinh hóa: KIA, Manitol Phenol Red

broth, Urea broth, LDC, canh trypton

Kết quả:

Đầu tiên, cân mẫu và đem đi đồng nhất mẫu với BPW vì đây là môi trường tăng sinh không chọn lọc Trong BPW có pepton là nguồn nitơ, cacbon, vitamin và khoáng vật,… Giúp cho vi sinh vật tăng trưởng trở lại một cách mạnh mẽ cũng như phục hồi các tế bào

bị tổn thương trong quá trình bảo quản Cần có giai đoạn tiền tăng sinh như vậy vì sang giai đoạn tăng sinh, ta sẽ chuyển canh khuẩn vào môi trường RV (Rapparport Vasiliadis broth) Đây là môi trường chọn lọc cực mạnh, giúp ức chế các vi sinh vật khác, chọn lọc

có tâm đen/không tâm

Khuẩn lạc trong suốt,

có tâm đen/không tâm

4 Hồi phục tổn

thương

Sâu: hơi vàng, có tủa đen và có sinh khí (nứt thạch)

Nghiêng: Đỏ Sâu: Vàng, có tủa đen

và có sinh khí (nứt thạch)

Manitol Phenol Red Broth

Lysine Decarboxylase Broth

(+), có vòng tím trên bề mặt, đục

(+), tím, đục

Salmonella Nhưng vì đây là môi trường chọn lọc cực mạnh nên nếu chúng ta không có

giai đoạn tiền tăng sinh để chúng khỏe mạnh thì có thể ngay cả Salmonella cũng bị ức chế (các tế bào Salmonella yếu, bị tổn thương…) Trong môi trường RV có Malachite green oxalate (chất ức chế mạnh) giúp ức chế các vi sinh khác không phải Salmonella.

MgCl2 tăng áp lực thẩm thấu trong môi trường Độ pH thấp của môi trường RV kết hợp với MgCl2 và Malachite green oxalate cũng làm tăng tính đề kháng của Salmonella.

Ngoài ra, Trong RV còn có Trypton là nguồn dinh dưỡng kết hợp của nhiều dưỡng chất,

giúp tăng sinh Salmonella Vì vậy, sau giai đoạn tăng sinh này thì mật độ Salmonella

trong mẫu sẽ cao hơn so với các vi sinh vật khác Cấy lập sang môi trường XLD để phân

lập và biệt hóa Salmonella, tách biệt Salmonella ra khỏi các vi sinh vật khác Khuẩn lạc

đặc trưng có dạng: khuẩn lạc trong suốt, có tâm đen hoặc không có tâm đen Khuẩn lạc

có tâm đen là vì trong XLD có Ferric ammonium citrate và sodium thiosulfate H2S kết hợp với Fe2+ tạo ra tủa FeS có màu đen Trong XLD có 3 nguồn đường là xylose, lactose

và sucrose, nhưng Salmonella chỉ sử dụng đường xylose (đường đơn) mà không sử dụng đường lactose và sucrose (2 đường đôi) Chính vì Salmonella không sử dụng 2 loại

đường này nên đã tạo ra khuẩn lạc trong suốt Ngoài ra, lượng đường xylose trong XLD

là rất ít nên khi Salmonella sử dụng hết thì nó sẽ chuyển sang sử dụng L-lysine có trong XLD Môi trường XLD ban đầu có màu cam vàng, Salmonella chỉ sử dụng đường xylose

làm sinh acid nên môi trường có màu vàng Nhưng sau khi hết xylose nó chuyển sang sử dụng L-lysine làm kiềm hóa môi trường, nên môi trường sẽ có màu hồng Vì vậy, khi quan sát khuẩn lạc ta sẽ thấy khuẩn lạc trong suốt, có tâm đen và xung quanh khu vực khuẩn lạc, môi trường sẽ có màu hồng Môi trường BHI là môi trường tăng sinh không

chọn lọc, giúp cho vi khuẩn khỏe lại để thể hiện đầy đủ đặc tính của Salmonella, để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa giúp khẳng định xem có Salmonella trong mẫu hay không.

Môi trường KIA là môi trường thạch nghiêng để thử nghiệm khả năng lên men glucose, khả năng sinh khí và sinh H2S của Salmonella Phần nghiêng là bề mặt hiếu khí, vi khuẩn

sử dụng glucose để hô hấp và sinh CO2, trong quá trình đó sẽ sinh ra acid làm cho môi trường có màu vàng, nhưng khi glucose hết thì vi khuẩn dùng nguồn lactose, sau đó là peptone làm sinh NH3, làm kiềm hóa môi trường, nên môi trường chuyển sang màu đỏ Phần thạch sâu có màu đen là do tủa FeS , H2S do Salmonella sinh ra từ Soldium

thiosulfate phản ứng với Ammonium ferrous (II) citrate Màu và là do vi khuẩn sử dụng glucose làm lên men sinh acid tạo ra màu vàng Môi trường Mannitol phenol red broth để

thử nghiệm khả năng lên man đường mannitol của Salmonella Salmonella sử dụng

nguồn carbohydrat này làm sinh ra acid nên môi trường có màu vàng Môi trường LDC là

môi trường dùng để thử khả năng sinh enzyme Lysine Decarboxylase của Salmonella.

Khi vi khuẩn sử dụng dextrose (có trong môi trường) làm sinh acid, pH giảm, màu từ tím chuyển sang vàng Nhưng sau đó, khi hết dextrose, sẽ sử dụng pepton, sinh ra NH3, kiềm hóa môi trường, nên môi trường lại chuyển sang màu tím Vì vậy, vòng màu tím trên bề mặt ống nghiệm cho thấy đang bắt đầu bước vào giai đoạn kiềm hóa Còn ống nghiệm có

màu tím thì đã kiềm hóa hoàn toàn Salmonella không có khả năng sinh indol, cũng

không có khả năng thủy phân urea sinh NH3 nên cho phản ứng với Urea broth và phản ứng indol âm (-) tính

Kết luận: Có phát hiện Salmonella trên 25g thịt tươi.

IV Kết luận chung:

Mẫu thịt tươi nhiễm cả 4 chủng vi sinh vật: Coliforms, E coli giả định, Staphylococcus

Aureus và Salmonella