Họ tên: Nguyễn Thị Thùy Linh MSSV: 1318191 Ca: 2A Nhóm: 14 BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM I II Mẫu thực phẩm: Tên mẫu: Thịt heo Ngày thu: 22/12/2015 Nơi thu mẫu: Chợ nhỏ gần nhà Chuẩn bị môi trường: Trong trình học, nhóm em có chuẩn bị môi trường BPW (Buffered Pepton Water) Urea Broth Đối với môi trường BPW, chứa chai ống nghiệm với thể tích sau: Chứa chai: 250ml/nhóm x 19 nhóm = 4750ml Chứa ống nghiệm (1 ống/nhóm): 19 ống x 10ml/ống = 190ml Tổng = 4940ml Nhóm pha 5000ml Môi trường BPW môi trường thành phần nên ta cân riêng thành phần theo tỉ lệ khối lượng: Trong: 1000ml H2O có: pepton 10g, NaCl 5g, Na2HPO4.12H2O 9g, KH2PO4 1.5g 5000ml H2O: pepton 50g, NaCl 25g, Na2HPO4.12H2O 45g, KH2PO4 7.5g Sau cân đủ thành phần với khối lượng ta thêm nước vào (nhưng chưa đủ 5000ml, khoảng 2500ml) khoáy lên cho thành phần tan hết Sau thành phần tan hết ta đổ môi trường qua ống đong thêm nước vào đủ 5000ml Môi trường không cần vô trùng nên ta cần lấy ống đong để đong vào chai Còn ống nghiệm đo 5ml trước, kẻ vạch, sau them vào vạch Đối với môi trường Urea broth, môi trường tổng hợp nên ta dựa vào khối lượng mà nhà sản xuất ghi chai đựng Cần pha: (2 ống/nhóm) 19 nhóm x ống x 5ml/nhóm = 190ml Pha thành 200ml Trên chai ghi 38.5g/l => cần cân 7.7g Sauk hi cân 7.7g (trong điều kiện vô trùng, đốt đèn cồn xung quanh), bỏ vào becher cho them nước vào (không đủ 200ml) khoáy tan Sau khoáy tan, ta đổ môi trường vào ống đong cho them nước vào đến đủ 200ml Khi cho môi trường vào ống nghiệm ta thực điều kiện vô trùng (đèn cồn) Sử dụng xi lanh với đầu tip 5ml có màng lọc (vô trùng) để hút môi trường cho vào ống nghiệm Kết thí nghiệm: Chỉ tiêu định lượng Coliforms: III Quy trình: Cấy 1ml mẫu Lật pha ngược loãng ủ 37oC Đổ vào 10-15ml VRB đun tan làm -3 -4 10 10 vào đĩatrong petri,24 nguội 45oC, chờ đông đặc (khoảng 15’), đĩa/nồng độ đổ them 5ml, chờ đông đặc Chọn đếm Cấy khuẩn lạc Ủ 37oC 24 Kết quả: Trên đĩa VRB: khuẩn lạc đặc trưng chọn sang môi trường BGBL Hệ số pha Số khuẩn lạc đếm loãng Đĩa petri Đĩa petri Đĩa đối chứng 10-3 451 (>300) Không đếm 23 10-4 165 150 Kết ống BGBL: Có ống ống mẫu không sinh Ống đối chứng không sinh Tỷ lệ xác nhận R: R = Số khuẩn lạc sinh hơi/số khuẩn lạc cấy = 2/5 = 0.4 Tổng số Coliforms (cfu/g): C = NxR/nVf = (165 + 150)x0.4/(2x1x10-4) = 6.3x105 (cfu/g) Đối với Coliforms, Coliforms vi khuẩn gram âm (-), có khả lên men lactose sinh acid có khả sinh 37oC Nên ta dùng môi trường VRB (môi trường đỏ hồng) để chọn lọc Coliforms Lựa chọn môi trường VRB VRB có chứa Crystal Violet muối mật số có khả ức chế vi khuẩn gram (-) giúp loại bỏ vi khuẩn gram (-), muối mật số tạo vòng tủa muối mật, lactose nguồn Carbohydrat, Coliforms sử dụng lên men lactose sinh acid, acid phát Neutral red có môi trường VRB => pH giảm => khuẩn lạc đặc trưng có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, kích thước >= 0.5mm Sau chọn khuẩn lạc đặc trưng, ta cấy vào ống nghiệm môi trường BGBL (có chuông Durham ngược) BGBL môi trường tổng hợp không chọn lọc, giúp vi khuẩn môi trường khỏe mạnh trở lại Ngoài ra, BGBL có lactose giúp phát Coliforms (nếu có Coliforms có bọt khí chuông Durham) Ống đối chứng không sinh thao tác thực có sai sót (que cấy nóng làm chết, lấy sinh khối không lấy được), chọn khuẩn lạc đĩa đối chứng chọn sai khuẩn lạc Kết luận: Tổng số Coliforms/g mẫu 6.3x105 (cfu/g) Chỉ tiêu định tính E coli giả định Quy trình: o Ủ 44 Cấy 1g (10ml củaC10 ) vào 10ml24 môi trường LSB đôi Chọn ống sinh cấy sang canh trypton Ủ 37oC 24 Ủ 44oC 24 Chọn ống sinh cấy sang ống EC broth (10ml) Thử phản ứng indol, E coli giả định cho phản ứng indol (+) Kết quả: Môi trường Đối chứng Mẫu LSB Sinh chuông Durham, môi trường đục Sinh chuông Durham, môi trường đục EC Broth Sinh chuông Durham, môi trường đục Sinh chuông Durham, môi trường đục Canh trypton Dương tính Dương tính E coli giả định Coliforms có khả chịu nhiệt (44oC) có khả cho phản ứng indol (+) Đầu tiên, ta cấy mẫu vào môi trường LSB đôi (Lauryl sulphate broth nồng độ đôi) đem ủ 37oC để chọn lọc Coliforms Vì LSB có chứa lauryl sulphate có khả ức chế vi sinh vật Coliforms, giúp tăng sinh Coiliforms mẫu Lactose nguồn Carbohydrat, giúp phát có mặt Coliforms Coliforms sử dụng nguồn đường lactose này, lên men sinh acid Quan sát thấy có sinh chuông Durham có nghĩa có lên men lactose Coliforms Sau đó, cấy ống có sinh (có Coliforms) sang môi trường EC broth ủ nhiệt độ 44oC để chọn lọc E coli giả định Trong EC broth có muối mật số có khả ức chế vi khuẩn gram (+), sót lại sau chọn lọc bước tăng sinh E coli giả định môi trường LSB đôi Lactose lên men E coli giả định sinh khí chuông Durham Đem ủ 44oC để chọn lọc E coli giả định E coli giả định chịu nhiệt Coliforms không chịu nhiệt Cuối chọn ống sinh cấy vào canh trypton đem ủ 44oC 24 đem thử phản ứng indol để khẳng định chắn có E coli giả định Trong canh trypton – môi trường giàu tryptophan, tryptophanase E coli giả định thủy phân tryptophan thành indol ta cần ủ 24 để có xuất indol Để phát indol, dùng thuốc thử Kovac có chứa pdimethylaminobenzaldehyde Chất kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl ammonium có màu đỏ Vì cho thuốc thử Kovac vào ta thấy có vòng màu đỏ bề mặt môi trường Để quan sát ta không lắc ống nghiệm ta lắc vòng màu đỏ tan không quan sát Kết luận: Phát E coli giả định 1g mẫu thịt tươi Chỉ tiêu định lượng S aureus Quy trình: Cấy 0.1ml dd mẫu 10-3 lên bề mặt đĩa môi trường BPA, trải que tam giác Ủ ngược đĩa 37oC 48 => đếm số khuẩn lạc đặc trưng Chuyển khuẩn lạc đếm sang môi trường TSA Ủ 37oC qua đêm Ủ 37oC theo dõi sau 2,4,6,8 Nếu biểu ngưng kết ủ đến 24 Cấy vào ống chứa 0.3ml huyết tương Kết quả: Trong môi trường BPA: Hệ số pha loãng 10-3 Số khuẩn lạc đếm Đĩa petri Đĩa petri Đĩa đối chứng 98 42 126 Trong môi trường TSA: Có ống mẫu đông tụ ống đối chứng đông tụ Cả ống đông tụ sau ủ bị tan sau Sau ủ 24 ông đông tụ trở lại Tỷ lệ xác nhận R: R = số ống huyết tương đông tụ/số khuẩn lạc cấy = 3/5 = 0.6 Tổng số S aureus (cfu/g): C = (N/nVf)xR = (42+98)x0.6/(2x1x10-3) = 4.2x104 (cfu/g) Staphylococcus Aureus vi khuẩn gram (+), sống hiếu khí tùy nghi, cho phản ứng catalase, coagulase dương tính, có khả lên men tạo acid từ mannitol có khả tạo độc tố enterotoxin bền nhiệt Đầu tiên, ta cấy mẫu lên môi trường BPA BPA môi trường chọn lọc để phát đếm số S aureus Khuẩn lạc đặc trưng khuẩn lạc tròn, lồi, đen bóng, có quầng sáng quầng bao quanh, có quầng Màu đen khuẩn lạc tellurite (egg yolk tellurite) tạo nên Trong BPA có LiCl giúp ức chế quần thể vi khuẩn thường diện với S aureus Natri pyruvate L-lysine kích thích tăng trưởng S aureus Nấm men cung cấp phức hệ vitamin B kích thích tăng trưởng Vì giúp cho tỉ lệ S aureus mẫu tăng lên Sau đó, chọn khuẩn lạc đặc trưng đem cấy vào môi trường TSA (trypton soya agar) TSA môi trường giàu dinh dưỡng, giúp tăng sinh không chọn lọc Trong TSA có trypton soya pepton nguồn cung cấp đạm, vitamin cacbon giúp cho vi sinh vật tăng sinh trở lại cách tối ưu Sau chọn lọc môi trường BPA, S aureus cần tăng sinh, phát triển trở lại để thể đầy đủ đặc tính ta cho cấy chuyển vào huyết tương S aureus có cho tượng đông tụ huyết tương nên ta cấy chuyển mẫu vào ống huyết tương để kiểm tra mẫu Trong S aureus có enzyme Coagulase tác động vào làm hoạt hóa trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzyme với yếu tố kết cụm enzyme vách vi khuẩn giúp S aureus tạo kết tủa fibrin bề mặt Làm hình thành nên cục đông tụ huyết tương Nhưng S aureus có enzyme protease, nên khối fibrin bị cắt protease làm tan cục huyết tương Vì vậy, cần quan sát thường xuyên (2,4,6, …,24 giờ) để quan sát kĩ đông tụ huyết tương Kết luận: Tổng số S aureus/g mẫu 4.2x104 (cfu/g) Chỉ tiêu định tính Salmonella Quy trình: Cân 25g mẫu + 225g BPW, đồng Cấy phân lập sang môi trường XLD Ủ 37oC 16-24 Ủ 37oC 24 Cấy vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: KIA, Manitol Phenol Red broth, Urea broth, LDC, canh trypton Kết quả: Chuyển 0.1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường RV Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường BHI Ủ 37oC 24 Ủ 42oC 24 Ủ 37oC khoảng 4-6 Giai đoạn Môi trường Mẫu Đối chứng Tiền tăng sinh BPW Đục Đục Tăng sinh chọn lọc RV Đục Đục Phân lập XLD Khuẩn lạc suốt, có tâm đen/không tâm Khuẩn lạc suốt, có tâm đen/không tâm Hồi phục tổn thương BHI Không thấy rõ đục Không thấy rõ đục Khẳng định Nghiêng: đỏ Nghiêng: Đỏ KIA Sâu: vàng, có tủa đen Sâu: Vàng, có tủa đen và có sinh khí (nứt thạch) có sinh khí (nứt thạch) Manitol Phenol Red Broth (+), có màu vàng (+), có màu vàng Urea Broth (-), không đổi màu (-), không đổi màu Lysine Decarboxylase Broth (+), có vòng tím bề mặt, đục (+), tím, đục Canh Trypton (-) (-) - Đầu tiên, cân mẫu đem đồng mẫu với BPW môi trường tăng sinh không chọn lọc Trong BPW có pepton nguồn nitơ, cacbon, vitamin khoáng vật,… Giúp cho vi sinh vật tăng trưởng trở lại cách mạnh mẽ phục hồi tế bào bị tổn thương trình bảo quản Cần có giai đoạn tiền tăng sinh sang giai đoạn tăng sinh, ta chuyển canh khuẩn vào môi trường RV (Rapparport Vasiliadis broth) Đây môi trường chọn lọc cực mạnh, giúp ức chế vi sinh vật khác, chọn lọc Salmonella Nhưng môi trường chọn lọc cực mạnh nên giai đoạn tiền tăng sinh để chúng khỏe mạnh Salmonella bị ức chế (các tế bào Salmonella yếu, bị tổn thương…) Trong môi trường RV có Malachite green oxalate (chất ức chế mạnh) giúp ức chế vi sinh khác Salmonella MgCl2 tăng áp lực thẩm thấu môi trường Độ pH thấp môi trường RV kết hợp với MgCl2 Malachite green oxalate làm tăng tính đề kháng Salmonella Ngoài ra, Trong RV có Trypton nguồn dinh dưỡng kết hợp nhiều dưỡng chất, giúp tăng sinh Salmonella Vì vậy, sau giai đoạn tăng sinh mật độ Salmonella mẫu cao so với vi sinh vật khác Cấy lập sang môi trường XLD để phân lập biệt hóa Salmonella, tách biệt Salmonella khỏi vi sinh vật khác Khuẩn lạc đặc trưng có dạng: khuẩn lạc suốt, có tâm đen tâm đen Khuẩn lạc có tâm đen XLD có Ferric ammonium citrate sodium thiosulfate H 2S kết hợp với Fe2+ tạo tủa FeS có màu đen Trong XLD có nguồn đường xylose, lactose sucrose, Salmonella sử dụng đường xylose (đường đơn) mà không sử dụng đường lactose sucrose (2 đường đôi) Chính Salmonella không sử dụng loại đường nên tạo khuẩn lạc suốt Ngoài ra, lượng đường xylose XLD nên Salmonella sử dụng hết chuyển sang sử dụng L-lysine có XLD Môi trường XLD ban đầu có màu cam vàng, Salmonella sử dụng đường xylose làm sinh acid nên môi trường có màu vàng Nhưng sau hết xylose chuyển sang sử dụng L-lysine làm kiềm hóa môi trường, nên môi trường có màu hồng Vì vậy, quan sát khuẩn lạc ta thấy khuẩn lạc suốt, có tâm đen xung quanh khu vực khuẩn lạc, môi trường có màu hồng Môi trường BHI môi trường tăng sinh không chọn lọc, giúp cho vi khuẩn khỏe lại để thể đầy đủ đặc tính Salmonella, để tiến hành thử nghiệm sinh hóa giúp khẳng định xem có Salmonella mẫu hay không Môi trường KIA môi trường thạch nghiêng để thử nghiệm khả lên men glucose, khả sinh khí sinh H2S Salmonella Phần nghiêng bề mặt hiếu khí, vi khuẩn sử dụng glucose để hô hấp sinh CO 2, trình sinh acid làm cho môi trường có màu vàng, glucose hết vi khuẩn dùng nguồn lactose, sau peptone làm sinh NH3, làm kiềm hóa môi trường, nên môi trường chuyển sang màu đỏ Phần thạch sâu có màu đen tủa FeS , H 2S Salmonella sinh từ Soldium thiosulfate phản ứng với Ammonium ferrous (II) citrate Màu vi khuẩn sử dụng glucose làm lên men sinh acid tạo màu vàng Môi trường Mannitol phenol red broth để thử nghiệm khả lên man đường mannitol Salmonella Salmonella sử dụng nguồn carbohydrat làm sinh acid nên môi trường có màu vàng Môi trường LDC môi trường dùng để thử khả sinh enzyme Lysine Decarboxylase Salmonella Khi vi khuẩn sử dụng dextrose (có môi trường) làm sinh acid, pH giảm, màu từ tím chuyển sang vàng Nhưng sau đó, hết dextrose, sử dụng pepton, sinh NH 3, kiềm hóa môi trường, nên môi trường lại chuyển sang màu tím Vì vậy, vòng màu tím bề mặt ống nghiệm cho thấy bắt đầu bước vào giai đoạn kiềm hóa Còn ống nghiệm có màu tím kiềm hóa hoàn toàn Salmonella khả sinh indol, khả thủy phân urea sinh NH nên cho phản ứng với Urea broth phản ứng indol âm (-) tính Kết luận: Có phát Salmonella 25g thịt tươi IV Kết luận chung: Mẫu thịt tươi nhiễm chủng vi sinh vật: Coliforms, E coli giả định, Staphylococcus Aureus Salmonella