BÁO cáo môn THỰC tập PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CễNG NGH SINH HC ăăăăăăăă BO CO MễN THC TP PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH Họ tên: Trừ Lâm Yến Linh MSSV: 18180218 Nhóm 16- Lớp Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng năm 2021 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ I Mục tiêu: Để xác định có Coliforms có gam mẫu vật kiểm nghiệm cho biết mức độ ô nhiễm thịt II - - Nguyên tắc: Coliforms trực khuẩn Gram âm (-), khơng sinh bào tử, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37 ±0,5° C 24 giờ, diện rộng rãi tự nhiên, ruột người động vật Số lượng diện Coliforms thực phẩm dùng để thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác Mẫu thịt sau pha lỗng ni cấy môi trường VRB( Violet Red Bile) ủ qua đêm Môi trường Violet Red Bile môi trường tăng sinh chọn lọc, dựa vào đặc tính Coliforms,VRB có thành phần phù hợp giúp vi khuẩn Coliform phát triển, dùng để phát có mặt Coliforms thông qua khuẩn lạc đặc trưng Thành phần gồm: - • Pepton cao nấm men (yeast Extract) nguồn cung cấp nitơ, lưu huỳnh,carbon, vitamin khống chất • Hỗn hợp mật muối(Bile salts) tinh thể màu tím(Crystal violet) chất ức chế vi khuẩn Gram dương Coliforms vi khuẩn gram âm nên mọc mơi trường VRB • Đường Lactose carbohydrate giúp lên men sinh khí gas, acid Đặc điểm để nhận biết có xuất Coliforms mẫu hay khơng • Muối Natri Clorua nhằm cân áp suất thẩm thấu • Neutral red chất thị màu Cấy khuẩn lạc đặc trưng vào môi trường BGBL môi trường chọn lọc, khẳng định có mặt Coliforms,… ức chế tăng trưởng vi khuẩn gram dương số vi khuẩn gram âm trình lên men lactose Sau cấy khuẩn lạc vào môi trường BGBL, ống nghiệm có sinh chứng tỏ dương tính với Coliforms Coliforms có khả lên men đường lastose có thành phần mơi trường Thành phần gồm: • Pepton nguồn cung cấp dinh dưỡng • Đường Lactose carbohydrate giúp lên men sinh khí gas, acid • Salt bile Green brilliant chất ức chế vi khuẩn gram dương(+) số vi khuẩn gram âm Tránh vi khuẩn khác cạnh tranh chất dinh dưỡng với Coliforms mọc đĩa, gây nhầm lẫn với Coliforms III Qui trình: Cân 10 g mẫu thịt vào bao PE + 90g dung dịch pha loãng (Dung dịch pha loãng 10-1) Đồng mẫu máy dập mẫu Tiến hành pha loãng từ dung dịch pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 Cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3 10-4 vào đĩa petri trống (mỗi nồng độ cấy đĩa) 10-3 x đĩa 10-3 x đĩa Sau đổ 15ml môi trường VRB vào đĩa, lắc đều, đợi đông đặc Đổ thêm 5ml môi trường VRB, để đông đặc 10-3 x đĩa 10-4 x đĩa Lật ngược đĩa, ủ 37°C qua đêm Mẫu đối chứng: Cấy 1ml canh khuẩn E.coli vào đĩa, thực đổ đĩa môi trường tương tự mẫu Đếm ghi nhận số khuẩn lạc đặc trưng đĩa nồng độ 10-3 10-4 Khuẩn lạc đặc trưng: có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đừơng kính lớn hay 0,5mm Chọn khuẩn lạc đặc trưng đếm cấy sang môi trường BGBL Ủ 37°C qua đêm Cấy KL mẫu đối chứng Cấy KL đặc trưng vào ống 10 Quan sát sinh môi trường BGBL Tính tỉ lệ xác nhận R ống mẫu IV Kết quả: Sự xuất khuẩn lạc đặc trưng đĩa mơi trường VRB: có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đường kính lớn 0,5mm - Đĩa chứng dương: có nhiều khuẩn lạc đặc trưng, khơng thể đếm số lượng khuẩn lạc, N>300 Đĩa dung dịch pha loãng nồng độ 10-3 : đĩa có khuẩn lạc đặc trưng, đĩa có khuẩn lạc đặc trưng Đĩa dung dịch pha loãng nồng độ 10-4 : đĩa có khuẩn lạc đặc trưng, đĩa khơng có khuẩn lạc đặc trưng Sau chọn khuẩn lạc đặc trưng đếm vào ống môi trường BGBL ống chứng dương: - Ống chứng dương: có xuất bọt khí ống Durham ngược Ống chứa khuẩn lạc dung dịch pha lỗng nồng độ 10-4 có xuất bọt khí ống Durham ngược ống cịn lại khơng xuất bọt khí ống Durham ngược Tỉ lệ xác nhận R R= 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 sinh ℎơ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝐵𝐺𝐵𝐿 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 𝑐ấ𝑦 = = 0,2 Tổng số Coliforms (cfu/g) (C) Tổng số Coliforms mẫu thịt kiểm nghiệm C= 𝑁 𝑛1𝑉𝑓1+𝑛2𝑉𝑓2 ×𝑅= 3+3+1 2.1.10−3+2.1.10−4 × 0,2 =636 (cfu/g) (C) Trong đó: - A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn gram hay 1ml mẫu - N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn - ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i - V: thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa - fi: Độ pha loãng tương ứng V Biện luận kết quả: Sự xuất khuẩn lạc đặc trưng môi trường cấy đĩa VRB: - - Đĩa chứng dương có xuất nhiều khuẩn lạc cho thấy thao tác cấy đĩa đảm bảo vơ trùng, q trình pha mơi trường VRB, hóa chất, q trình hấp khử trùng, thao tác đảm bảo xác, nên xuất khuẩn lạc đặc trưng, tin tưởng kết mẫu vật Đĩa mẫu thịt kiểm nghiệm nhóm, có khuẩn lạc đặc trưng, điều chứng tỏ mẫu thịt kiểm nghiệm sạch, có vi khuẩn Coliforms Sau cấy khuẩn lạc đặc trưng qua ống nghiệm mơi trường BGBL: - Ở ống chứng dương có xuất bọt khí chng Durham ngược, chứng tỏ cấy khuẩn lạc, đặc trưng, thao tác cấy môi trường đảm bảo Ở ống mẫu có ống chứa khuẩn lạc dung dịch pha lỗng 10-4 xuất khí, ống cịn lại khơng xuất hiện.Có thể khuẩn lạc ống mơi trường cịn lại khơng phải khuẩn lạc đặc trưng nên khơng có xuất bọt khí Do số khuẩn lạc đặc trưng đĩa nồng độ pha lỗng có N nên tổng số Coliforms mẫu nồng độ tính theo cơng thức bình thường Kết định lượng có khoảng 636 vi khuẩn Coliforms có gam mẫu thịt VI Kết luận: Mẫu thịt nhóm có xuất vi khuẩn Coliforms, với số lượng Trên đĩa cấy khuẩn lạc nồng độ dung dịch pha loãng 10-3 nồng độ dung dịch pha loãng 10-4 có 10 khuẩn lạc dặc trưng Các ống có xuất bọt khí tổng ống mẫu nhóm Những ống khơng xuất bọt khí khuẩn lạc khơng phải khuẩn lạc đặc trưng khuẩn lạc nhỏ nên khơng thể xuất bọt khí Tỉ lệ xác nhận R: R= 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 sinh ℎơ𝑖 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝐵𝐺𝐵𝐿 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 𝑐ấ𝑦 = = 0,2 Định lượng Coliforms: C= 𝑁 𝑛1𝑉𝑓1+𝑛2𝑉𝑓2 ×𝑅 = 3+3+1 2.1.10−3+2.1.10−4 × 0,2 =636 (cfu/g) (C) Định lượng Coliforms mẫu thịt: có khoảng 636 vi khuẩn Coliforms gam mẫu thịt kiểm nghiệm ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus I Mục tiêu: Để xác định có S.aureus có gam mẫu vật kiểm nghiệm II Nguyên tắc: Staphylococcus aureus vi khuẩn Gram dương, không di động, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý Có khả lên men sinh acid từ mannitol, sucrose Phát triển tốt môi trường tổng hợp, đặc biệt môi trường thạch máu huyết Ngoài S aureus sinh trưởng mơi trường có hoạt độ thấp lồi vi khuẩn khác mơi trường có nồng độ muối cao Mơi trường Baird Parker Agar (BPA) môi trường nuôi cấy chọn lọc, định lượng S.aureus gồm: • Tryptone, cao thịt, cao nấm men lag nguồn cung cấp dinh dưỡng • Lithium Chloride có vai trị chọn lọc • Sodium Pyruvate Glycine thành phần phát triển S aureus Trên môi trường thạch BPA khuẩn lạc có hình trịn trơn bóng, có tâm đen-quầng sángquầng Nguyên nhân hình thành hình dạng khuẩn lạc đặc trưng: • S aureus có enzyme coagulase phân giải Tellurite có thành phần Egg Yolk Tellurite mơi trường nuôi cấy thành Telluride tạo tâm đen khuẩn lạc • S aureus có enzyme lecithinase phân giải licithin tạo quầng sáng cho khuẩn lạc • S aureus có enzyme lipase phân giải lipid thành acid béo glycerol tạo quầng cho khuẩn lạc Sau đó, cấy khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường tăng sinh TSA.TSA môi trường giàu dinh dưỡng chứa mẫu phân giải casein bột đậu tương giúp S aureus phát triển số lượng để cấy sang môi trường huyết tương Trong môi trường huyết tương để xác định mẫu có S.aureus khơng thơng qua yếu tố gây đơng máu enzyme coagulase Staphylococcus aureus Do coagulase phản ứng với fibrinogen huyết tương thành fibrin dẫn đến tượng đơng đặc huyết tương Nếu có đơng tụ huyết tương, chứng tỏ mẫu thịt kiểm nghiệm có vi khuẩn Staphylococcus aureus III Qui trình Cấy 0,1ml dung dịch pha lỗng có nồng độ 10-3 vào đĩa petri môi trường BPA 10-3 Lật ngược đĩa ủ 37°C ngày Mẫu đối chứng: cấy 0,1ml dịch canh khuẩn S.aureus vào đĩa petri môi trường BPA, thực tương tự mẫu Sau ủ ngày, quan sát khuẩn lạc đặc trưng đĩa đối chứng đĩa cấy dung dịch pha lỗng có nồng độ 10-3 có hình dạng: tính từ tâm ra: đen- quầng sáng- quầng Cấy khuẩn lạc mẫu đối chứng khuẩn lạc đĩa cịn lại vào mơi trường TSA, ủ 37°C qua đêm Nhóm cấy khuẩn lạc gồm: khuẩn lạc mẫu đối chứng, khuẩn đặc trưng có xuất quần khuẩn lạc khơng có quầng Cấy chuyển mẫu đối chứng mẫu sang môi trường huyết tương, ủ 37°C theo dõi 2, 4, 6, 8, , 24 Quan sát đông tụ huyết tương IV Kết Sau cấy mơi trường BPA, đĩa có xuất khuẩn lạc đặc trưng có hình dạng: hình trịn, tính từ tâm có màu đen- quầng sáng- quầng - Ở đĩa chứng dương: có nhiều khuẩn lạc đặc trưng, đếm số lượng Ở đĩa mẫu thứ nhóm: khơng có khuẩn lạc đặc trưng có quầng phía ngồi, có tâm đen quầng sáng Số khuẩn lạc khơng có quầng 114 Ở đĩa mẫu thứ hai nhóm: có khuẩn lạc đặc trưng có quầng trong, 107 khuẩn lạc có tâm đen quầng sáng Mẫu đối chứng mẫu nhóm Sau cấy khuẩn lạc khuẩn lạc mẫu đối chứng vào mơi trường TSA, có xuất đường ria khuẩn lạc chọn phần đĩa môi trường TSA Sau khi, cấy phần khuẩn lạc ria môi trường TSA, kết sau cấy khuẩn lạc qua môi trường huyết tương Kết ủ sau môi trường huyết tương: ống nghiệm mẫu ống nghiệm đối chứng khơng có thay đổi màu, khơng có tượng đơng tụ Kết ủ sau môi trường huyết tương: ống mẫu đối chứng có đơng tụ nhẹ, dung dịch đơng lại; ống mẫu nhóm có cặn lặn xuống đáy, tượng giống mẫu đối chứng Kết ủ sau 24 môi trường huyết tương: ống mẫu đối chứng có đơng tụ huyết tương; ống mẫu nhóm khơng có đơng tụ, tượng giống sau ủ Xác định tỉ lệ dương tính R R= 𝑆ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 đơ𝑛𝑔 𝑡ụ 𝑠ố 𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐 𝑐ấ𝑦 =0 Số S aureus (cfu/g) S= 𝑁 𝑛𝑉𝑓 ×R= 1+107+114 2.0,1.10−3 × = 111 × 104 (cfu/g) Số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus 1g mẫu kiểm nghiệm nhỏ 111 × 104 vi khuẩn V Biện luận kết quả: Kết nuôi cấy mẫu mơi trường BPA, có khuẩn lạc giống hình thái khuẩn lạc đặc trưng, khuẩn lạc cịn lại khơng có quầng phía ngồi, chưa thể xác định có hay khơng có vi khuẩn S aureus mẫu kiểm nghiệm thơng qua hình thái khuẩn lạc Tiếp tục nuôi cấy tăng sinh môi trường TSA, thực phản ứng đông tụ huyết tương Các mẫu khơng có đơng tụ rõ rệt, sau 24 mẫu nhóm khơng có đơng tụ Định lượng xem có vi khuẩn S aureus mẫu, N