tìm hiểu các chỉ tiêu và phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong nhà máy sữa

Đại diện : vi khuẩn Các vi khuẩn thường gặp : + Vi khuẩn lactic + Coliform + Vi khuẩn sinh acid butyric + Vi khuẩn sinh acid propionic . + Các vi khuẩn gây thối

TÌM HIỂU CÁC CHỈ TIÊU

VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

TRONG NHÀ MÁY SỮA

GVHD : LÊ LÝ THÙY TRÂM

SVTH : NGUYỄN ĐOÀN THANH DUNG NGUYỄN THỊ DIỆU HƯƠNG VĂN THỊ THU NGUYỆT

TRẦN THỊ NHI 1

I GIỚI THIỆU VỀ SỮA :

1.Sữa là gì?

Sữa là một chất lỏng màu trắng đục được tạo ra bởi con cái

của động vật có vú, là nguồn dinh dưỡng ban đầu cho con non mới sinh.

3

2.Chất dinh dưỡng có trong sữa :

Thành phần dinh dưỡng trong 100ml sữa mẹ và sữa bò

5

3.Phân loại sữa:

II.HỆ VI SINH VẬT TRONG SỮA

1 Nguồn gốc

2.Hệ vi sinh vật trong sữa

Được chia thành 2 nhóm chính: Procaryote và

Eucaryote

7

Procaryote Eucaryote

Nhân chưa hoàn chỉnh Nhân hoàn chỉnh

Vùng nhân chỉ là mạch ADN xoắn

kép nằm trong tế bào chất, lưu

giữ các thông tin di truyền cho tế

+ Vi khuẩn sinh acid butyric

+ Vi khuẩn sinh acid propionic

Đại diện : nấm men và nấm sợi

8

3.Vi sinh vật chỉ thị

9

III/ CÁC CHỈ TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP

KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRONG NHÀ

MÁY SỮA :

1 Chất chỉ thị xanh Metylen

a) Nguyên tắc:

Các v i sinh vật ô nhiễm sữa khi phát triển là thay đổi hiệu

thế oxi hóa khử, nếu cho chất chỉ thị xanh metylen vào sữa

sẽ làm thay đổi màu xanh metylen, tùy theo màu thay đổi

và t hời gian thay đổi màu có thể tính được mức độ nhiễm

v i sinh vật của sữa.

b) Cách tiến hành:

Khi màu xanh của ống nghiệm

chuyển sang màu trắng, còn lại

khoảng 1cm chiều cao có màu xanh

nhạt => đọc giờ kết thúc

Thời gian mất màu xanh methylen = giờ kết thúc – giờ bắt đầu

13

c) Kết quả:

Thời gian mất màu Mức độ nhiễm vsv

< 15 phút nhiễm rất nhiều vsv 15p – 1 giờ ô nhiễm nặng

1 – 3 giờ ô nhiễm nhẹ

> 3 giờ đạt chuẩn vsv

2 Chất chỉ thị Resazurin:

a) Nguyên tắc:

-Sự thay đổi màu của chất chỉ thị này theo thời gian phụ

thuộc vào sự hoạt động của vsv hiện diện trong sữa

-Điều đó có nghĩa là phản ứng với resazurin cho ta biết

mức độ hoạt động của vsv hơn là số lượng của chúng.

b) Cách tiến hành:

15

Ống nghiệm: 10 ml mẫu sữa +

Đạt chuẩn vsv

17

3 Xác định tổng lượng vi sinh vật hiếu khí:

a) Nguyên tắc:

Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu vào

môi trường dinh dưỡng Đếm số khuẩn lạc mọc lên trên cơ

sở xem một khuẩn lạc là một sinh khối phát triển từ một tế

bào hiện diện trong mẫu.

b) Cách tiến hành:

Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ

pha loãng 10-1,10-2,10-3,10-4…

Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp,

chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô

trùng (mỗi nồng độ cấy2 đĩa)

Rót vào mỗi đĩa petri 10-15ml môi

trường PCA đã được làm nguội đến

45°C, lắc cho mẫu phân tán đều vào

môi trường, ủ ở 30°C trong 72 giờ

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong

khoảng 25-250 khuẩn lạc/đĩa để đếm

Tính tổng số vsv hiếu khí 19

Công thức:

Trong đó:

-A: số tế bào VK trong 1g hay 1ml mẫu

-N: số khuẩn lạc đếm được rên các đĩa đã chọn

-n: số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ nhất

-V: thể tích mẫu (ml) cấy vào đĩa

c) Kết quả:

Số khuẩn lạc Chất lượng sữa

105 tế bào/g(ml) sữa bị chua 106-107 tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi

108 tế bào/g(ml) có mùi hôi không chấp

nhận được 109-1010 tế bào/g(ml) sữa thay đổi cấu trúc

21

4 Xác định sự lên men:

a) Nguyên tắc:

Dựa vào sự thay đổi màu sắc, sinh hơi của môi trường PRB

và mẫu trong ống Durham

b) Cách tiến hành:

Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu

10-1 Tiến hành với mẫu 100 và

10-1

Dùng pipet vô trùng lấy 0.1 ml

mẫu dung dịch thứ cho vào ống

nghiệm chứa môi trường PRB tiệt

Âm tính Môi trường màu đỏ, có thể chuyển

sang màu vàng nhưng không sinh hơi trong ống Durham.

5 Xác định Staphylococcus aureus:

a) Nguyên tắc:

Staphylococcus aureus được xác định cơ sở các đặc điểm

tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng

thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.

b) Cách tiến hành:

25

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu 10 -1 ,10 -2 ,10 -3 ,…

Chuyển 1 ml dung dịch 10-1,

10-2, 10-3 vào ống 10 ml canh

MBS, mỗi nồng độ 3 ống lặp

lại, ủ 37°C, 48 giờ

Chọn ống (+) mỗi độ pha loãng

Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 37°C,

48 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng

Cấy vào TSA, ủ 37±1°C, 24 giờ

Đếm số khuẩn lạc không đặc trưng Lấy 5 khuẩn

lạc cấy vào TSA, ủ 37±1°C,

24h

Lấy 5 khuẩn lạc cấy vào TSA, ủ 37±1°C, 24h Thử nghiệm ngưng kết coagulase

Tỉ lệ khuẩn lạc đặc trưng, congulase (+)

Tỉ lệ k.lạc ko đặc trưng, congulase (+) 26

Khuẩn lạc S.aureus trên môi

trường thạch BPA

Khuẩn lạc S.aureus trên môi trường

thạch máu

Công thức:

Trong đó:

- F: là độ pha loãng

- Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng

- Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng

- Ht: tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+)

so với khuẩn lạc đặc trưng

- Ha: tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng

định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.

(NtHt+ NaHa)/( F1+F2)

c) Kết quả:

-Phản ứng đông kết: Dịch cấy tạo khối đông => phản ứng

dương tính

-Đếm những khuẩn lạc đặc trưng, Gram (+), làm đông

huyết tương => số khuẩn lạc trên 1 mẫu thử.

29

6 Định lượng Coliform:

a) Nguyên tắc:

Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc, cùng với sự sinh khí

và thay đổi của môi trường nuôi cấy.

10 CFU/g hoặc CFU/ml

b) Cách tiến hành:

Dùng pipet đã vô trùng chuyển 10 ml dịch mẫu pha

loãng 1/10 hay 1 ml sữa dạng lỏng

Rót vào đĩa petri đã vô trùng, để dịch mẫu chảy tự do,

khoảng 10-15 ml trong môi trường DLA

Dùng tay lắc xoay tròn đĩa xuôi và ngược chiều kim

đồng hồ cho môi trường cấy và dịch mẫu hòa đều vào

nhau

Đổ 1 đĩa đối chứng cho mỗi môi trường cấy

K hi môi trường đã đông hoàn toàn, rót thêm 3-4 ml môi

trường DLA tráng kín bề mặt đĩa

Môi trường đông đặc, lật ngược đĩa cho vào tủ ấm

32±1°C ủ trong 24±3 giờ

K iểm chứng trên môi trường BGLB: tách khuẩn lạc

nghi ngờ cấy vào ống nghiệm có ống Durham chứa môi

trường BGLB Các ống cấy đã được lắc đều và ủ

32±1°C ủ trong 48±3 giờ.

31

c) Kết quả:

-Đếm số khuẩn lạc Coliform trên môi trường DLA có

đường kính >= 0,5mm, ở giữa màu đỏ sẫm, xung quanh

màu hồng.

-Kết quả kiểm chứng: Nếu có khí và có sự thay đổi màu

môi trường thì khuẩn lạc là Coliform

7 Kiểm tra tổng số E.coli:

Chuẩn bị mẫu thử

Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu thử vào

ống nghiệm chứa môi trường BGBL 2%

( mỗi nồng độ 3 ống thử)Cho vào tủ 35±1°C ủ trong 24±3 giờ

Dương tính: màu

môi trường thay

đổi và có sinh hơi

trong ống Durham

Âm tính: màu môi trường không thay đổi và không sinh hơi trong ống Durham

Dùng khuyên cấy đã khử dịch mẫu trong ống

có phản ứng dương tính cấy ria quanh môi

trường DLA Cho vào tủ ấm 35±1°Củ trong

24±3 giờ

Thử phản ứng sinh hóa với khuẩn lạc mọc trên

Thử nghiệm Cách tiến hành Kết quả

Thử Indol Cấy vi khuẩn cần xác định sang

môi trường nước pepton Cho vào tủ ấm 35±1°C ủ trong 24±2 giờ Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovacs vào

Dương tính : xuất hiện màu đỏ trên mặt môi trường

Âm tính: giữ nguyên màu của môi trường.

Thử MR-VP Cấy vi khuẩn cần xác định sang

môi trường MR-VP, cho vào tủ

ấm 35±1°C ủ trong 48±2 giờ.

-Thử nghiệm MR: nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl 0.2% vào mỗi ống.

-Thử nghiệm VP: nhỏ khoảng 6 giọt α-napthol 5% và 2 giọt KOH 40% Lắc nhẹ và để yên khoảng 15-20 phút.

Thử nghiệm MR:

- Dương tính : dịch cấy màu đỏ.

- Âm tính: dịch cấy màu vàng hoặc màu cam

trường thạch nghiêng Citrate simmons Cho vào tủ ấm 35±1°C

c) Kết quả:

Phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC có kết quả

+ + - - hay -+ .

T NG K T ỔNG KẾT ẾT

 Sữa là nguồn dinh dưỡng vô cùng quý giá đối với con

người Tuy nhiên nó cũng là môi trường thuận lợi cho các

loại vi sinh vật gây hại phát triển Để bảo đảm chất lượng

dinh dưỡng của sữa, sức khỏe của người tiêu dùng, các hộ

chăn nuôi bò phải đảm bảo quy trình chăn nuôi an toàn,

hợp vệ sinh, nhà máy sản xuất sữa cần có những hệ thống,

phương pháp kiểm nghiệm hiện đại và nghiêm ngặt

 Đây chính là yếu tố quan trọng để phát triển chất lượng

của nguồn sữa Việt Nam

37

Tài liệu tham khảo:

1 Giáo trình công nghệ chế biến sữa, Lê Thị Hồng Ánh

2 Giáo trình hóa phân tích thực phẩm, Huỳnh Quang

3 Staphylococcus aureus, TS Nguyễn Đỗ Phúc

4 Vi sinh thực phẩm, Lê Lý Thùy Trâm.

- Các website:

www.wikipedia.com.vn