TÌM HIỂU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

Sau thời gian thực tập tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng em đã tiếp thu được rất nhiều kiến thức quý báu từ các anh, chị chuyên viên để có thể hoàn thành bài báo cáo này và vững bước trên con đường mình đã chọn. Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn các anh, chị chuyên viên công tác tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng, đặc biệt là chị Nguyễn Thị Thu Hương là người trực tiếp hướng dẫn, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em nghiên cứu, tiếp cận với thực tế, vận dụng những kiến thức đã học mà phát huy khả năng của mình, đồng thời biết được những nhược điểm mà khắc phục, sửa đổi để hoàn thành tốt chuy

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐÀ NẴNG TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI TÌM HIỂU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOA LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) TRÊN QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Cán hướng dẫn: Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Lớp: Nguyễn Thị Thu Hương Đoàn Thị Vân Hồ Thị Hiền Thu 13CNSH Đà Nẵng, tháng 03 năm 2017 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng em tiếp thu nhiều kiến thức quý báu từ anh, chị chuyên viên để hoàn thành báo cáo vững bước đường chọn Lời em xin chân thành cảm ơn anh, chị chuyên viên công tác Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng, đặc biệt chị Nguyễn Thị Thu Hương người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em nghiên cứu, tiếp cận với thực tế, vận dụng kiến thức học mà phát huy khả mình, đồng thời biết nhược điểm mà khắc phục, sửa đổi để hoàn thành tốt chuyên đề tốt nghiệp Đồng thời em xin chân thành cảm ơn thầy, cô Khoa Sinh- Môi trường trường Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt truyền đạt cho em kiến thức nghề nghiệp thời gian học tâp trường Lời cuối cùng, em xin gửi tới quý thầy cô Khoa Sinh- Môi trường trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng, anh chị chuyên viên Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng lời chúc sức khỏe, thành đạt sống, chúc Trung Tâm phát triển đạt nhiều thành công Do kiến thức hạn hẹp nên không tránh khỏi thiếu sót cách hiểu, lỗi trình bày Em mong nhận đóng góp ý kiến quý thầy cô, Ban lãnh đạo anh chị Trung tâm để báo cáo tốt nghiệp đạt kết tốt Em xin chân thành cảm ơn Đà Nẵng, ngày 10 tháng 03 năm 2016 Sinh viên thực Hồ Thị Hiền Thu DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BAP Cs ĐHST MS NAA : Benzyl amino purine : Cộng : Điều hòa sinh trưởng : Murashige Skoog (1962) : Naphthalene Acetic Acid DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 2.1 3.1 3.2 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 Tên hình Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng Sơ đồ phòng công nghệ tế bào thực vật Tủ sấy Máy nước cất Nồi hấp Cân phân tích Cân kỹ thuật Máy đo pH Tủ cấy cấp Nhà lưới lan Hồ Điệp Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng Quạt thông gió Bức tường nước Máy vắt giá thể Kệ (giàn) đặt lan Sơ đồ phân hóa phản phân hóa tế bào Một số hình ảnh lan Hồ Điệp Trung tâm Công nghệ Sinh Học Đà Nẵng Lá hoa lan Hồ Điệp Sơ đồ quy trình nuôi cấy hoa Lan Hồ Điệp Quy trình vào mẫu hoa lan Hồ Điệp Mẫu cấy sau tuần Mẫu cấy bị nhiễm nấm Cấy nhân nhanh protocorme Mẫu protorme sau tháng Mẫu cấy phát sinh chồi Chồi phát sinh từ mẫu cấy sau tháng Cấy nhân chồi Chồi sau tuần Cấy rễ Cây sau tuần Cây hoa lan Hồ Điệp huấn luyện từ 7-10 ngày Cây hoa lan Hồ Điệp đạt tiêu chuẩn Quy trình hoa lan Hồ Điệp Trang 6 7 8 10 11 11 12 12 14 20 24 31 34 35 35 36 36 36 36 37 37 38 38 39 40 41 MỞ ĐẦU Cuộc sống ngày bận bịu với công việc, học tập, gia đình… đôi lúc làm căng thẳng muốn tìm tới niềm vui để xã stress Ngày nay, công nghệ thông tin phát triển, thú đem lại qua phim ảnh, âm nhạc, game… thật lớn Cũng có người tìm đến thể thao để rèn luyện sức khỏe, nấu ăn, làm đẹp, mua sắm… Bên cạnh đó, có không người tìm đến hoa thú vui để có phút giây thực thư giãn với loài hoa rực rỡ sắc màu Hoa ăn thiếu đời sống tinh thần người Hoa tượng trưng cho đẹp, khiết, tình yêu thiên nhiên, vạn vật người Chúng đem lại cho người thoải thái, thư giãn thưởng thức vẻ đẹp chúng Bên cạch đó, hoa mang lại nguồn lợi kinh tế cao Ở nước ta, nghề trồng hoa mang lại hiệu kinh tế cao cho nhiều địa phương, góp phần không nhỏ việc chuyển đổi cấu trồng Do đời sống người dân nâng cao nên nhu cầu hoa tươi ngày cao, bên cạnh ngành trồng sản xuất hoa đặt mục tiêu không phục vụ nước mà hướng thị trường quốc tế Theo thống kê Cục Trồng trọt cho thấy, năm 2014, nước có khoảng 22671,9 diện tích trồng hoa Thu nhập bình quân trồng hoa, cảnh nước năm 2014 285 triệu đồng/ha/năm So với giá trị thu nhập/ha canh tác toàn ngành trồng trọt 82-83 triệu đồng/ha/năm, mức thu nhập gấp gần 3,5 lần Trong vòng 10 năm gần (2005-2015) diện tích hoa tăng 2,3 lần, giá trị sản lượng tăng 7,2 lần (đạt 6.500 tỷ đồng, xuất xấp xỉ 50 triệu đô-la Mỹ) Mức tăng giá trị thu nhập đơn vị héc-ta ba lần, hình thành nhiều mô hình đạt từ 800 triệu đến 2,5 tỷ đồng héc-ta [1] Đây lĩnh vực sản xuất cho thu nhập cao gấp nhiều lần so với loại trồng thông thường khác điều kiện canh tác Ngày nay, có vô số loài hoa thơm, rực rỡ loại hoa chất lượng cao phục vụ cho việc xuất : Lay ơn, Hồng Môn, Tuylip, Phong Lan, Địa Lan, Lily…Trong đó, loại lan nói chung lan Hồ Điệp nói riêng xem trồng đem lại hiệu kinh tế cao Do có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cấu trồng từ lúa, hoa màu sang trồng lan Hiệu kinh tế cao gấp 2-3 lần so với trồng khác Lan Hồ Điệp yêu thích không màu sắc, kiểu dáng mà mang vẻ đẹp sang trọng trang nhã Hoa lan loài hoa có giá trị kinh tế cao ưa chuộng nước Trồng hoa Lan Hồ Điệp thu hút lớn nhà đầu tư nước Nó hướng giúp người nông dân đẩy nhanh việc xóa đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm giảm tỷ lệ thất nghiệp nông thôn hướng giúp chuyển dịch nhanh cấu nông nghiệp Chính vậy, việc trồng sản xuất hoa lan Hồ Điệp ý đầu tư Tuy nhiên, lan Hồ Điệp loài lan khó nhân giống việc nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô in-vitro tạo hàng loạt ổn định mặt di truyền đáp ứng giá phải hữu ích Đó lý thực chuyên đề tìm hiểu về: “ Quy trình nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) quy mô công nghiệp Chương GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP 1.1 Lịch sử, phận chức tình hình hoạt động Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng 1.1.1 Lịch sử Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng Tên đơn vị: Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng Tên giao dịch tiếng anh: Danang Biotechnology Center (DanaBC) Địa chỉ: Tổ 25, phường Hòa Thọ Tây, quận Cẩm Lệ, thành phố Đà Nẵng Hình 1.1 Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng 1.1.2 Các phận chức Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng + Ban giám đốc + Phòng Hành Tổng hợp + Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật + Phòng Công nghệ Vi sinh + Trạm sản xuất – kinh doanh 1.1.3 Tình hình hoạt động Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng Nghiên cứu khoa học  Triển khai dự án thuộc chương trình nông thôn miền núi gồm dự án sau: - Nghiên cứu tuyển chọn giống nấm thích nghi phát triển môi trường khí - hậu Đà Nẵng Dự án mô hình sản xuất nấm ăn nấm dược liệu Dự án ứng dụng khoa học công nghệ, xây dựng mô hình nhân giống - sản xuất Lan Hồ Điệp quy mô công nghiệp Đà Nẵng Dự án xây dựng mô hình việc ứng dụng phát triển khoa học công nghệ trồng hoa chậu phục vụ phát triển kinh tế nông nghiệp du lịch sinh thái bền vững cho Đà Nẵng  Hoạt động dịch vụ Cung cấp loại giống nấm ăn nấm dược liệu như: sò, rơm, linh chi, mộc nhĩ, đùi gà, kim châm Cung cấp giống nuôi cấy mô loại: - Phong Lan: Hồ Điệp, Dendro, Vũ nữ, Moocara Các loại hoa Cúc: Pha lê, Cúc Nhật, Bốn số chín Cây đặc hữu Đà Nẵng: Lá đỏ Cung cấp loại giống thương phẩm, hoa chậu, hoa thảm như: Tô Liên, Ngọc Thảo, Ly Ly, Triển khai mô hình ứng dụng cho nông dân địa phương thành phố: - Mô hình công nghệ nuôi trồng nấm sò Mô hình công nghệ nuôi trồng nấm rơm trái vụ Mô hình công nghệ nuôi trồng nấm linh chi Mô hình nuôi trồng long ruột đỏ Mô hình trồng cải phương pháp thủy canh Mô hình sản xuất phân vi sinh Chuyển giao quy trình công nghệ: - Công nghệ thiết kế nhà lưới cấp 1, cấp Quy trình công nghệ nhân giống nấm cao cấp: kim châm trắng, kim châm vàng, - đùi gà Quy trình công nghệ nhân giống nuôi trồng loại nấm thông dụng: nấm - linh chi, nấm rơm, nấm sò, mộc nhĩ Quy trình công nghệ nhân giống loại hoa chậu, hoa thảm,… Quy trình công nghệ trồng chăm sóc hoa lan Dendro, Moocara,… 1.2 Giới thiệu phòng công nghệ tế bào thực vật PHÒNG NUÔI MẪU CẤY PHÒNG CHỨA MÔI TRƯỜNG PHÒNG CẤY VÔ TRÙNG KHO PHÒNG LÀM VIỆC PHÒNG LÀM PHÒNG LÀM HÀNH LANG WC PHÒNG MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT VIỆC VIỆC LỐI VÀO Hình 1.2 Sơ đồ phòng công nghệ tế bào thực vật 1.2.1 Chức năng, nhiệm vụ phòng công nghệ tế bào thực vật  Chức phòng Công nghệ tế bào thực vật Tham mưu giúp lãnh đạo Sở Khoa học Công nghệ Đà Nẵng, ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng thực hoạt động ứng dụng công nghệ lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật, phục vụ công tác bảo tồn nhân giống trồng, nguồn gen thực vật quý  Nhiệm vụ phòng Công nghệ tế bào thực vật: Cung cấp giống từ nuôi cấy mô tế bào cho vùng trồng trọt, nhà vườn, hộ nông dân địa bàn thành phố Đà Nẵng vùng lân cận Thực công tác đào tạo, chuyển giao công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật cho cá nhân, tổ chức có nhu cầu Triển khai sản xuất giống (hoa cao cấp, lâm nghiệp, loại nấm ăn,…) 1.2.2 Giới thiệu số dụng cụ, thiết bị, máy móc có phòng công nghệ tế bào thực vật `Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật trang bị hệ thống sở vật chất để phục vụ cho yêu cầu nghiên cứu sau: - Dụng cụ: Chai lọ thủy tinh, ống đong (100ml, 500ml,1l…); bình đong nhựa (1l, 2l ); phễu (hủy tinh, nhựa,…); panh mềm, panh cứng, kéo, dao cắt, - đèn cồn, nút bông, nilon,… Trang thiết bị, máy móc: Máy sấy, nồi hấp tuyệt trùng, tủ lạnh, cân phân tích, cân kỹ thuật, bếp từ, lò vi sóng, máy xay sinh tố, cất nước,tủ đững hóa chất, máy đo pH, tủ an toàn sinh học,  Tủ sấy Model: OF-02G/12G/22G Công dụng: Sấy khô loại nguyên vật liệu việc xác định độ ẩm vật liệu, sấy khô dụng cụ phòng thí nghiệm để sử dụng liên tục để tốn thời gian để khô tự nhiên Bên cạnh đó, tủ sấy dùng để tiệt trùng loại dụng cụ que cấy, đĩa Petri, giấy cấy … Nguyên lý hoạt động: Gió thổi qua hệ thống làm nóng ( Giàn sấy- trở nhiệt) đến nhiệt độ cần sấy, quạt gió hút đẩy khí nóng tuần hoàn tủ, nhiệt độ đạt đến nhiệt độ sấy, role tự ngắt ngừng cung cấp điện cho trở nhiệt, giảm xuống - độ C role lại cấp lại dòng điện cho trở nhiệt nâng nhiệt độ sấy Trong trình sấy cài đặt thời gian sấy, hết thời gian sấy điện ngừng cung cấp cho trở quạt gió tuần hoàn, quạt hút bật hút khí nóng mang nước  Hình 1.3 Tủ sấy Máy nước cất Model: Merit W4000 Công dụng: Chuyển nước cứng thành nước tinh khiết phục vụ pha hóa chất, pha môi trường xử lí mẫu Nguyên lý hoạt động: Quá trình chưng cất dùng nhiệt độ để đun nước, làm nước bay ngưng tụ Nước thu từ việc làm bay ngưng tụ gọi nước cất  Nồi hấp Hình 1.4 Máy nước cất Model: HIRAYAMA HV-110 Công dụng: Nồi hấp giúp trùng, giúp diệt vi khuẩn, nấm, từ đảm bảo yếu tố vô trùng cho môi trường đem sử dụng nuôi cấy cách sử dụng áp suất cao nước bão hòa 1210C khoảng 15-20 phút tùy thuộc vào kích thước dung tích đối tượng cần hấp khử trùng Nguyên tắc hoạt động: Làm bay nước nguyên sinh chất dẫn đến phá vỡ vỏ để tiêu diệt vi sinh vật Chu trình hoạt động: chu trình tiệt trùng môi trường thường kéo dài gồm chế độ chính: - Chế độ chờ (stand by): Bắt đầu từ 33oC Chế độ làm nóng: Nâng dần nhiệt độ lên đến - 121oC Chế độ trùng: Giữ nguyên nhiệt độ 121 oC - 17 phút Chế độ làm nguội: Nhiệt độ hạ dần 97oC kết thúc trình  Cân phân tích Hình 1.5 Nồi hấp 10 Hình 1.6 Cân phân tích 3.3 Tình hình nghiên cứu lan Hồ Điệp 3.3.1 Trên giới Tanaka (1990) hệ thống phương pháp nhân nhanh Phalaenopsis qua nuôi cấy mô cách tái sinh chồi non qua phát hoa, chồi non cắt nuôi cấy đặt tối tuần kế đưa ánh sáng tạo protocorm Zhang (2014) nuôi cấy tạo protocorm la Phalaenopsis từ mô có nguồn gốc từ cuống hoa nuôi cấy môi trường MS bổ sug BA Một số loài Phalaenopsis hình thành từ chóp rễ (Sagawa and Kunasaki, 1982) [9] 3.3.2 Tại Việt Nam Theo nghiên cứu Dương Tấn Nhựt cộng năm 2007 với đề tài “Tái sinh bảo quản hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis amabilis)”; nguyên liệu dung để tạo hạt nhân tạo mô sẹo, thể dẻ hành (protocorm-like body- PLB) phôi vô tính lan Hồ Điệp In vitro Nồng độ sodium alginate vỏ hạt khác phần nội nhũ nhân tạo làm giàu môi trường chứa Hyponex, đường, dịch chiết khoai tây vitamin MS Sau đó, hạt bảo quản nuôi cấy loại môi trường giá thể khác nhằm khảo sát khả bảo quản tái sinh chúng Kết cho thấy nguyên liệu để tạo hạt nhân tạo tốt cho đối tượng lan Hồ Điệp phôi vô tính Nồng độ alginate 30 g/l dung dịch tạo vỏ hạt nhân tạo nồng độ tối ưu giúp hạt có tỷ lệ nảy mầm cao ứng dụng để nhân giống In vitro Môi trường tốt để tái sinh hạt môi trường chứa g/l Hyponex + 5ml/l vitamin MS + 30 g/l khoai tây nấu chín + g/l agar + g/l than hoạt tính; môi trường bảo quản hạt tốt cho hạt nhân tạo từ PLB có khả sống sót cao môi môi trường bổ sung g/l Hyponex + ml/l vitamin MS + 30 g/l khoai tây nấu chin với giá thể gòn (87%), đó, hạt tạo thành mô sẹo lại sống sót hoàn toàn bảo quản nước cất [2] Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Pha cộng năm 2011 với đề tài “Nuôi cấy mầm ngủ phát hoa lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)”; đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống trực tiếp lan Hồ Điệp Phalaenopsis từ mầm ngủ phát hoa không qua giai đoạn tạo mô sẹo; kết thu môi trường có nồng độ khoáng thấp ( ½ macro MS + ½ micro MS, bổ sung mg/l BAP 0,5 mg/l NAA) có hiệu tạo chồi 31 cao (2,83 chồi/ mầm) 60 ngày sau cấy Vị trí mầm ngủ khác cho kết tạo chồi khác nhau, mầm ngủ gần gốc phát hoa cho tỷ lệ chồi sinh dưỡng cao (82%), mầm ngủ xa gốc phát hoa lại cho tỷ lệ chồi sinh sản cao (33,24%) Môi trường có thành phần khoáng đa tương tự môi trường B5, khoáng vi lượng tương tự môi trường MS, chất điều hòa sinh trưởng, vitamin, dịch trích hữu cho khả tạo rễ tốt (trung bình rễ, với chiều dài 0,87 cm) [6] Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Sơn cộng năm 2014 với đề tài “Nhân dòng vô tính lan Hồ Điệp Phalaenopsis Yukidian”, kết nghiên cứu cho thấy: Nguồn vật liệu ban đầu phát hoa với chế độ khử trùng tối ưu khử trùng kép CaOCl2 15% phút Johnson 1% phút Môi trường tốt cho phát sinh hình thái protocorm từ phận soma In vitro MS + 2,0 mg/l BA + 6,0g/l agar Môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l -NAA + g/l agar môi trường tạo chồi tốt Chồi lan có tốc độ lớn nhanh môi trường MS bổ sung 10% nước dừa Môi trường MS + 10% nước dừa + 3,0 mg/l BA + 6g/l agar môi trường tối ưu để nhân nhanh chồi lan với hệ số nhân chồi cao 4,20 lần sau tuần nuôi cấy Môi trường MS + 10% nước dừa + 0,5 g/l than hoạt tính + 6g/l agar môi trường thích hợp để tạo hoàn chỉnh từ chồi [7] 32 Chương QUY TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CÂY HOA LAN HỒ ĐIỆP 4.1 Quy trình nhân giống hoa lan hồ điệp Quy trình nuôi cấy mô lan Hồ Điệp gồm giai đoạn sau: Phát hoa chứa mắt ngủ Khử trùng cồn 70°, phút Giai đoạn Khử trùng NaClO 2%, 30 phút Chồi phát triển từ mắt ngủ Môi trường tạo protocorme Giai đoạn Loại bỏ đỉnh sinh trưởng Thể protocorme Môi trường nhân protocorme Giai đoạn Môi trường tạo chồi Cụm protocorme Chồi hoa in vitro Môi trường tạo rễ Giai đoạn Cây Cây cao 5-7cm, 3-4 Giai đoạn Huấn luyện Vườn ươm Hình 4.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy hoa Lan Hồ Điệp 33 4.1.1 Giai đoạn vào mẫu Mục tiêu: Môi trường để nuôi cấy mô tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng… thích hợp cho loại nấm vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào nấm vi khuẩn lớn nhiều so với tế bào thực vật, môi trường nuôi cấy nhiễm vài bào tử nấm vi khuẩn sau vài ngày đến tuần toàn bề mặt môi trường mô nuôi cấy phủ đầy nhiều loại nấm vi khuẩn Trong điều kiện mô nuôi cấy không phát triển chết dần Môi trường: Môi trường vào mẫu lan Hồ Điệp môi trường MS có bổ sung agar, đường than hoạt tính pH = 5.8 Dụng cụ thiết bị: - Dụng cụ : + Panh, - dao cấy Hóa chất: + Sunlight chanh + + Đèn cồn + Giấy + Nước cất vô trùng + Javel 15% cấy 34 Cồn 700 +Bình duran đựng mẫu Cách tiến hành: Bước 1: Đối tượng lan Hồ Điệp ta chọn phát hoa có từ 3-4 hoa nở rát thích hợp cho bước vô mẫu Giai đoạn phần gốc phát hoa cứng cáp, mắt ngủ phình to, khỏe thuận tiện cho việc khử trùng Phát hoa cắt khúc 3-7 cm có chứa mầm ngủ tùy kích thước bình Duran Bước 2: Ngâm mẫu nước xà phòng loãng dùng lau nhẹ lên phát hoa, ý rửa theo chiều xuôi phát hoa để tránh làm tổn thương mầm ngủ Sau rửa nhiều lần nước máy Bước 3: Lau chai môi trường vào mẫu, bình Duran, ca đựng mẫu thấm cồn 700, xếp vào tủ an toàn sinh học Dùng panh gắp mẫu vào bình Duran, lắc rửa loại bỏ nước Lắc với cồn 700 phút, tráng lại nước cất Bước 4: Cho vào bình Duran dung dịch Javen thương phẩm theo tỉ lệ : vòng 30 phút với giọt Tween Tween polyglycol, sánh lỏng, màu vàng vàng nâu, độ nhớt cao, chất gây thấm, tăng sức căng bề mặt, tăng khả phân tán dung dịch Javen đến mẫu cấy Bước 5: Lắc mẫu tay 30 phút tráng lại nước cất hết bọt trắng Bước 6: Đặt chồi lên giấy vô trùng, dùng dao gỡ bỏ lớp vỏ lụa thật khéo léo, tránh làm tổn thương mắt ngủ Cắt bỏ hai đầu mẫu để loại bỏ tế bào bị tổn thương chất khử trùng Bước 7: Cắm vào bình chứa môi trường vào mẫu chuẩn bị sẵn Cắm nghiêng 45 0, cho mắt ngủ hướng lên trên, từ mọc chồi Ghi lại giống ngày thực chai để tiện theo dõi thu kết Lưu ý:  Có nhân tố đảm bảo thành công nuôi cấy mô tế bào thực vật Bảo đảm điều kiện môi trường Chọn môi trường chuẩn bị môi trường cách Chọn mô cấy xử lý mô cấy thích hợp trước sau cấy  Có nguồn tạp nhiễm chính: - Dụng cụ thủy tinh, môi trường nuôi cấy, nút đậy không vô trùng tuyệt đối - Trên bề mặt bên mô cấy tồn sợi nấm, bào tử nấm vi - - khuẩn Trong trình thao tác làm rơi nấm vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường Bước Bước Bước Bước Bước Bước Bước Hình 4.2 Quy trình vào mẫu hoa lan Hồ Điệp Hình 4.3 Mẫu cấy sau tuần Hình 4.4 Mẫu cấy bị nhiễm nấm 4.1.2 Giai đoạn tạo thể protocorme Để có hệ số nhân cao, chồi non phát triển từ mắt ngủ điều kiện in vitro đem nuôi cấy môi trường cảm ứng tạo protocorme Các protocorm phát triển thành chồi nguồn mẫu sản xuất sau Cách tiến hành: Dùng kìm nhọn tách lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng khỏi mô cấy vào môi trường nhân giống ban đầu Sau tuần, từ mẫu cấy hình hình thể protorme Khi protocorme phát triển đạt số lượng định ( không nhiều khó quan sát mẫu bị nhiễm) mang tách cụm protorme thành nhiều phần nhỏ cấy vào môi trường nhân nhanh thể protorme Môi trường: ( Môi trường HS) + Sử dụng môi trường MS + Bổ sung BAP, Thiamin, Glycine + Đường + Than hoạt tính + Nước dừa + Agar BAP kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ Vì người ta xem chúng chất hoạt hóa phân chia tế bào, nguyên nhân xytokinin hoạt hóa mạnh mẽ trình tổng hợp axit nucleic protein dẫn đến kích phân chia tế bào Thiamin (Vitamin B1) có khả kích thích mạnh sinh trưởng rễ nhỏ tách rời trồng môi trường tổng hợp, mặc khác vitamin B1 có khả chuyển hóa gluxit Glycine acid amin không thiết yếu, giản đơn, tham gia vào tổng hợp protein thể, creatin, acid glycocholic, glutathion, acid uric, hem Glycin tham gia chuyển acid benzoic thành acid hipuric không độc Hình 4.5 Cấy nhân nhanh protocorme 4.1.3 Hình 4.6 Mẫu protorme sau tháng Giai đoạn tái sinh chồi Các protocorme tiếp tục phân chia thành protocorme phát triển thành hoàn chỉnh Cách tiến hành: Thể protocorme lấy khỏi môi trường cấy, dùng dao nhọn tách làm 4-6 miếng tuỳ kích thước thể protocorme Sau đó, chuyển mẫu vào môi trường tái sinh chồi (môi trường HS) Mỗi protocorme phát triển thể chồi sau khoảng tuần, tiếp tục cấy chuyền sang môi trường để nhân nhanh chồi Hình 4.7 Mẫu cấy phát sinh chồi  Lưu ý: Hình 4.8 Chồi phát sinh từ mẫu cấy sau tháng Sau thời gian cấy dài ngày ta cần cấy chuyển vì: - Mẫu cấy tăng kích thước chồi, tăng sinh khối chiếm ưu thể tích bình nuôi - cấy Sự thoát nước nên môi trường khô, tăng nồng độ muối môi trường Thiếu Oxygen cho mô - Giảm pH môi trường Sự biến dưỡng mô bị biến đổi gây chất độc tích tụ, ức chế tăng - trưởng phân chia tế bào 6-8 tuần cấy chuyền lần Với mục đích giữ giống: Không cấy chuyền - nhiều lần thời gian dài (vì số lần cấy chuyền tỷ lệ thuận với biến dị) Tạo mô sẹo, có thay đổi nhiễm sắc thể tạo đột biến Mẫu cấy có biểu không mong muốn phải cấy sang môi trường khác Cách tiến hành:.Chồi hoa lan Hồ Điệp tách từ cụm chồi, cắt bỏ bị hư, sau cấy vào môi trường nhân nhanh chồi Hình 4.9 Cấy nhân chồi Hình 4.10 Chồi sau tuần 4.1.4 Giai đoạn tái sinh hoàn chỉnh Mục tiêu: Khi đạt đến số giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích rễ) Sau -5 tháng, thể chồi phát triển thành Môi trường: (Môi trường HR) + Sử dụng môi trường MS + Bổ sung NAA, Thiamin, Glycine + Đường + Than hoạt tính + Khoai tây + Agar NAA (Naphthalene Acetic Acid-C12H9O2Na) chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tác dụng rộng, thúc đẩy phân bào hình thành rễ nhánh , rễ lá, dùng để tăng nhanh tốc độ rễ Cách tiến hành: Chồi hoa lan Hồ Điệp tách từ cụm chồi Chồi cấy sang môi trường kích thích rễ Hình 4.11 Cấy rễ Hình 4.12 Cây sau 4tháng 4.1.5 Huần luyện ngôi, chăm sóc vườn ươm  Giai đoạn huấn luyện Mục tiêu: Giúp thích nghi với môi trường tự nhiên việc thay đổi độ ẩm Độ ẩm bên bình nuôi cấy cao môi trường bên ngoài, thay nắp giấy giúp việc cân độ ẩm bên bình bên Cách tiến hành: Chọn bình có phát triển tốt Tiến hành tủ an toàn sinh học Mở nắp nilon, hơ miệng chai thủy tinh lửa đèn cồn cho khô nước xung quanh thành miệng, thay nắp nilon nắp giấy hấp sấy truyệt trùng Nếu không hơ kỹ miệng bình thủy tinh thay nắp, giấy bị rách, khó bọc Thời gian tối thiểu cho thích nghi khoảng tuần, thời gian cần phải chăm sóc bảo vệ trước yếu tố bất lợi sau: Mất nước nhanh làm cho bị héo khô, nhiễm vi khuẩn nấm gây nên tượng thối nhũn, cháy nắng Cần có bước huấn luyện cấu trúc hình thái giải phẩu cấy mô có số khác biệt so với trồng nhà lưới: - Lớp cutin: Do độ ẩm bình nuôi cấy cao nên thiếu lớp sáp dày bề mặt nguyên nhân làm cho nuôi cấy mô dễ nước dễ chết điều kiện tự nhiên - Khí khổng: Ở nuôi cấy mô khí khổng có dạng tròn so với bình thường trồng nhà lưới có cấu trúc hình elip Mặt khác, nuôi cấy mô có số khí khổng đơn vị diện tích nhiều trồng nhà lưới Khí khổng nuôi cấy mô chưa có chức đóng mở, chuyển từ bình nuôi cấy môi trường bên hầu hết khí khổng mở Vì vậy, ngày đầu chuyển cấy mô môi trường nước cao - Lá nuôi cấy mô mỏng trồng nhà lưới - Thân nuôi cấy mô thiếu mô cương mô mô hỗ trợ cho cứng thân Vì vậy, nuôi cấy mô thường yếu trồng nhà lưới - Rễ nuôi cấy mô thường chưa có chức số loài, rễ chưa phát triển lông hút, chưa hoàn chỉnh liên kết hệ mạch rễ thân Hình 4.13 Cây hoa lan Hồ Điệp huấn luyện từ 7-10 ngày  Ra chăm sóc vườn ươm - Tiêu chuẩn ngôi: Cây có đủ thân lá, rễ, không bị nấm bệnh Hình 4.14 Cây hoa lan Hồ Điệp đạt tiêu chuẩn - Cây lấy khỏi bình rửa sạch, xử lý thuốc trừ nấm Ridomil (nồng độ g/lít) khoảng phút - Giá thể rêu khô (dớn) dược xử lý thuốc trừ nấm Ridomil, nước ngâm 30 phút, sau vắt máy ly tâm - Trồng vào giá thể khay chứa nhiều lỗ có đường kính cm lưu ý quấn giá thể quanh gốc đảm bảo chặt sau đưa vào khay - Đặt khay vừa giàn (kệ) nhà lưới lan Hồ Điệp chăm sóc - Tưới nước dinh dưỡng: Trong 15 ngày đầu tưới nước, phun nhẹ vòi phun tay, giữ ẩm cho giá thể Sau 15 ngày, phun cho chế phẩm Vitamin B1, nồng độ 50ml/100 lít, định kỳ phun ngày/lần Sau tháng, tưới cho phân NPK với tỷ lệ 30:20:10 với nồng độ 40g/100 lít nước, định kỳ tưới ngày/lần - Những ngày không phun, tưới dinh dưỡng phải ý giữ ẩm cho cây, thông thường 2-3 ngày tưới lần vòi phun tay Hình 4.15 Quy trình hoa lan Hồ Điệp KẾT LUẬN Quá trình thực tập tháng ngắn cho em học hỏi không kinh nghiệm từ môi trường làm việc có tính chuyên môn cao cách xử giao tiếp với người, có trách nhiệm với công việc giao Đối với công việc giao cần phải nắm quy trình chung để phân công vào vị trí khác hoàn thành phần việc mình, biết làm gì, quan sát ghi nhớ Trong trình thực tập, phải mạnh dạn làm quen, thân thiện với người, mở rộng quan hệ lợi lớn sau, có thái độ chân thành hòa đồng với người Đưa ý kiến cần thiết để biết làm hay sai, sinh viên nên hỏi chưa biết hay chưa hiểu rõ từ quy trình hay khác thực tế lý thuyết học Siêng yếu tố quan trọng thích người chăm chỉ, không ngại việc, biết giúp đỡ người có trách nhiệm với việc làm Qua đó, em học nhiều kiến thức lĩnh vực Công nghệ sinh học, trao dồi kiến thức, học thêm kiến thức tích lũy kinh nghiệm thực tế quý báu mà em chưa có học giảng đường Điều giúp em nhận thức sâu sắc hơn, hiểu biết nhiều ngành nghề theo đuổi vị trí, vai trò Công nghệ sinh học xã hội Cũng qua đợt thực tập em học tập, trao dồi kiến thức bổ sung kỹ công việc, học tập để ngày hoàn thiện TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, Phát triển nghành công nghiệp hoa, cảnh kinh tế hội nhập, Báo điện tử Đảng Cộng Sản Việt Nam 18/02/2016 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Tuyền, Nguyễn Duy, Mai Xuân Phán (2007), Tái sinh bảo quản hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis amabilis), Tạp chí Công Nghệ Sinh Học (1):85-95 Đặng Văn Đông (2011), Hoàn thiện quy trình nhân giống sản xuất số giống hoa lan Hồ Điệp theo quy mô công nghiệp, Bộ Khoa học Công nghệ Lương Công Trữ (2013), Nghiên cứu ảnh hưởng số biện pháp kỹ thuật đến sinh trưởng hoa lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) Thái Nguyên, Luận văn thạc sỹ Khoa Nông Nghiệp, Đại học Thái Nguyên – Đại học Nông Lâm, mã số 60.62.01.10 Ngô Xuân Bình (2010), Nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận ứng dụng Đại học Lâm nghiệp Thái Nguyên NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Thị Pha, Trần Thị Xuân Mai, Lê Thị Mai Trang, Nguyễn Thị Liên (2011), Nuôi cấy mầm ngủ phát hoa lan Hồ Điệp (Phalaenopsis), Tạp chí Khoa học 2011:20b 12-20 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Hoàng Thị Ánh Nguyệt (2014), Nhân dòng vô tính lan Hồ Điệp Phalaenopsis Yukidian, Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1283-1293 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật, NXB Giáo Dục Sagawa and Kunasaki (1982), Clonal propagation of orichds by tissue culture, In: Proc 5th Cong, Plant Tissue and Cell Culture P 683-684 ... nhân giống Mẫu nuôi cấy môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro thể chồi thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân. .. cytokinin khác cô lập Ngày nay, người ta gọi cytokinin để nhóm hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống kinetin Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng aminopurin thay... lan khó nhân giống việc nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô in- vitro tạo hàng loạt ổn định mặt di truyền đáp ứng giá phải hữu ích Đó lý thực chuyên đề tìm hiểu về: “ Quy trình nuôi cấy in vitro lan