Tìm hiểu quy trình nhân giống hoa đồng tiền in Vitro

Do sau một thời gian tồn tại ngoài đồng ruộng khá lâu nên tấtyếu sẽ nhiễm rất nhiều loại vi rút và vi khuẩn làm cho chất lượng cây giống khôngcao, thoái hóa ảnh hưởng đến chất lượng sản

Ngày nay, phương pháp nhân giống cổ truyền bằng cách tách chồi từ cây mẹ đãkhông còn phù hợp Do sau một thời gian tồn tại ngoài đồng ruộng khá lâu nên tấtyếu sẽ nhiễm rất nhiều loại vi rút và vi khuẩn làm cho chất lượng cây giống khôngcao, thoái hóa ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm cành hoa.

Trong vài năm gần đây, tại Đà Lạt- Lâm Đồng, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy

mô tế bào trong nhân giống được phát triển mạnh mẽ Có nhiều cơ quan nhà nước,công ty, cơ sở tư nhân (Trung Tâm Nghiên Cứu Khoai Tây, Rau & Hoa, Trung tâmỨng dụng Đà Lạt, công ty Hasfarm, Bonniefarm, Rừng Hoa và một số cơ sở tư nhânnhỏ) đã và đang nghiên cứu, ứng dụng lĩnh vực này trong nhân giống các loại rau,hoa và đã có nhiều thành công đáng kể Nhân giống hoa Đồng Tiền bằng phương

pháp này đang dần phổ biến và được nhiều người biết đến Đề tài “Tìm hiểu quy

trình nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro” nhằm tìm hiểu quá trình nhân giống hoa

Đồng Tiền như thế nào, tìm hiểu một số biện pháp kỹ thuật trong nhân giống hoa

Đồng Tiền in vitro, nhằm khắc phục những nhược điểm và đáp ứng được những yêu

cầu hiện nay

Qui trình nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro được ghi nhận tại Bộ môn Công

Nghệ Sinh Học thuộc Trung Tâm Nghiên Cứu Khoai Tây, Rau & Hoa – Đà Lạt

I Tính cấp thiết của đề tài:

Hoa Đồng Tiền xuất hiện ở nước ta vào những năm 1940 và đến nay đã phát triển

ra nhiều tỉnh thành trong cả nước Tuy nhiên, diện tích trồng hoa Đồng Tiền trong cảnước còn thấp, chất lượng hoa của một số vùng còn yếu, hoa Đồng Tiền được trồngchủ yếu ở một số địa phương như: Đà Lạt, Hải Phòng, Hà Nội, Thành Phố Hồ ChíMinh,… Nguyên nhân của hạn chế về diện tích và chất lượng hoa Đồng Tiền là:

 Thiếu giống tốt, không chủ động được giống cây, phải nhập giống Do vậy, làmcho chi phí sản xuất cao, mà giá thành ngoài thị trường của hoa lại chưa cao

 Trong điều kiện trồng trọt ở vùng nhiệt đới ở nước ta, hoa Đồng Tiền thườngnhiễm bệnh, nấm Với nguồn nước ô nhiễm, vệ sinh đồng ruộng kém, cành hoa

bị ngắt sát đất dễ mẩn cảm với bệnh nên các giống hoa Đồng Tiền dễ bị thoáigiống

Trước tình hình đó, việc tìm ra biện pháp nhân giống hoa Đồng Tiền sạch bệnh,

có chất lượng là rất cần thiết

II Mục đích, yêu cầu và ý nghĩa:

1 Mục đích:

Tìm hiểu qui trình nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro.

Khảo sát một số biện pháp kỹ thuật trong nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro.

2 Yêu cầu:

Xác định nồng độ BAP tối ưu trong môi trường MS cho nhân nhanh chồi in vitro

các giống hoa Đồng Tiền G04.6

Xác định nồng độ NAA tối ưu trong quá trình tạo rễ của cây hoa Đồng Tiền in vitro G04.6.

Xác định loại giá thể phù hợp với hoa Đồng Tiền

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sản xuất hoa:

1.1.1 Tình hình sản xuất hoa trên thế giới:

Ngày nay, hoa là một sản phẩm đặc biệt Hoa làm tăng chất lượng cuộc sống củacon người và hoa đem lại cho con người những cảm xúc tuyệt vời mà các quà tặngkhác không có được

Ngày nay, sản xuất hoa trên Thế Giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và đã trởthành một ngành thương mại cao Sản xuất hoa đã mang lại lợi ích to lớn cho nềnkinh tế các nước trồng hoa trên Thế Giới

Diện tích hoa của Thế Giới ngày càng mở rộng và không ngừng tăng lên Cácnước sản xuất hoa lớn trên Thế Giới là: Nhật với khoảng 3.731 tỷ đôla, Hà Lankhoảng 3.558 tỷ đôla, Mỹ khoảng 3.270 tỷ đôla

Sản xuất hoa của Thế Giới sẽ tiếp tục phát triển và mạnh mẽ nhất ở các nướcChâu Á, Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh Mục tiêu sản xuất hoa cần hướng tới làgiống hoa đẹp, tươi, chất lượng cao và giá thành thấp

1.1.2 Tình hình sản xuất hoa ở Châu Á:

Châu Á Thái Bình Dương có diện tích trồng hoa khoảng 134 000 ha, chiếm 60%diện tích hoa Thế Giới Nhưng diện tích hoa thương mại của Châu Á nhỏ Tỷ lệ thịtrường hoa của các nước đang phát triển chỉ chiếm 20% thị trường hoa Thế Giới.Nguyên nhân là do các nước Châu Á có diện tích trồng hoa được bảo vệ thấp Ở đâyhoa được trồng trong điều kiện tự nhiên của đồng ruộng Hoa được trồng chủ yếuphục vụ cho thị trường nội địa Mấy năm gần đây thị trường hoa xuất hiện nhiều nướcmới, trong đó có các nước ở khu vực Châu Á như: Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc,Singapore, Ấn Độ

Các nước ở Châu Á có diện tích trồng hoa lớn là: Trung Quốc (3 000 ha), Ấn Độ(65 000 ha), Malaysia (1 218ha), Srilanka (500 ha), Thái Lan (5 452 ha), Việt Nam,Inđônêsia, Philippin Nghề trồng hoa ở Châu Á có từ lâu đời, nhưng trồng hoa thươngmại phát triển từ những năm 80 của thế kỷ 20 Khi các nước Châu Á mở của, tăngcường đầu tư, đời sống của nhân dân được nâng cao, yêu cầu hoa cho khách sạn, dulịch lớn, các thị trường hoa phát triển.

Các loài hoa được trồng ở Châu Á chủ yếu gồm hai nhóm giống hoa, phân chiachủ yếu dựa vào yêu cầu nhiệt độ của chúng: nhóm các giống hoa có nguốn gốc nhiệt

đới gồm các loài hoa như hoa Lan (Orchidacea), Anthurium, hoa Đồng Tiền (Gerbera), …và nhóm hoa có nguồn gốc ôn đới như: hoa Hồng (Rosa sp), Cúc (Chrysanthemum sp), Layơn (Gladiolus), Huệ…

Các điều kiện thuận lợi và hạn chế của sản xuất hoa Châu Á

1.1.2.1 Điều kiện thuận lợi của sản xuất hoa các nước Châu Á:

 Có nguồn gen cây hoa phong phú, đa dạng

 Khí hậu nhiệt đới, đủ mưa, nắng, ánh sáng, đất tốt, giá rẻ

 Lao động dồi dào, giá lao động thấp

 Chính phủ khuyến khích đầu tư phát triển hoa

1.1.2.2 Các mặt hạn chế sản xuất hoa Châu Á:

 Thiếu giống hoa đẹp, chất lượng cao Giống hoa thường nhập từ bên ngoài

 Chưa đủ kỹ thuật sản xuất, chế biến hoa thương mại

 Vốn đầu tư ban đầu cao Vốn vay lãi xuất cao

 Cơ sở hạ tầng cho sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, xuất khẩu thiếu

 Thông tin về thị trường chưa đầy đủ

 Thiếu vốn đầu tư cho nghiên cứu, đào tạo cán bộ

 Thuế cao, sự kiểm dịch khắt khe của các nước nhập khẩu

1.1.3 Tình hình sản xuất hoa ở Việt Nam:

1.1.3.1 Diện tích trồng hoa ở Việt Nam:

Việt Nam có diện tích tự nhiên trên 33 triệu ha Diện tích trồng hoa ở Việt Namcòn nhỏ, chiếm khoảng 0,02% diện tích trồng trọt Hoa được trồng từ lâu đời Diệntích hoa tập trung ở các vùng trồng hoa truyền thống của thành phố, khu công nghiệp,khu du lịch, nghỉ mát như Ngọc Hà, Quảng An, Nhật Tân, Tây Tựu (Hà Nội), ĐằngHải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn, thị xãThanh Hóa ( Thanh Hóa), Gò Vấp, Hóc Môn (Thành Phố Hố Chí Minh), Đà Lạt ĐàLạt là vùng sản xuất hoa lớn nhất cả nước với tổng diện tích trồng hoa khoảng 2 027

ha (năm 2005)

Theo điều tra ở các tỉnh trong các vùng sinh thái nông nghiệp Việt Nam, các loàihoa chính được trồng trong sản xuất là:

Bảng 1.1: Các loài hoa trồng phổ biến ở Việt Nam

Hoa HồngHoa CúcHoa Cẩm ChướngHoa Lay ƠnHoa HuệHoa Loa KènHoa Thược DượcHoa Đồng Tiền

Rosa sp.

Chrysanthemum sp.

Dianthus caryofullus Gladiolus communis Polianthes tuberosa L.

Lilium longiflorum Thumb Dahlia pinnata Cav.

Gerbera jamesonii

Hoa VioletHoa LanHoa Trà Mi

Viola tricolor L.

Orchidaceae Camellia japonica Nois.

1.1.3.2 Kỹ thuật sản xuất hoa ở Việt Nam:

Sản xuất hoa ở Việt Nam dựa vào kinh nghiệm truyền thống và áp dụng kỹ thuậtnhân giống hoa cổ truyền Cây giống hoa đem trồng hiện nay gồm các giống gieo hạt,

mầm, củ, nhánh, từ cây nuôi cấy in vitro.

Các phương pháp nhân giống cổ truyền dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệmcủa nông dân, giá thành thấp Do đó, hiện nay phương pháp này là phổ biến, chiếm

ưu thế trong sản xuất Nhược điểm của phương pháp này là chất lượng giống khôngcao Cây hoa trồng lâu bị thoái hóa Bệnh, vi rút có nhiều khả năng lan truyền và pháttriển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa

Các loại hoa trồng từ cây in vitro như: hoa cẩm chướng, hoa cúc, hoa hồng, hoa đồng tiền,… Cây in vitro đã dược đưa ra sản xuất nhưng ở diện tích nhỏ Ưu điểm của cây giống hoa được nhân bằng phương pháp in vitro là cây khỏe, sạch bệnh, hệ số nhân giống cao, làm tăng chất lượng hoa Nhưng cây nhân bằng in vitro đòi hỏi phải

có thiết bị, giá thành cây giống cao Hiện nay khi thị trường hoa bắt đầu phát triển,

phương pháp nhân giống bằng in vitro bắt đầu được ứng dụng rộng rãi, điều mà ở các

nước trồng hoa tiên tiến đã áp dụng từ lâu

Vai trò của cây hoa trong nền kinh tế : Hoa có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế củacác vùng và của các nước trồng hoa Trồng hoa đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn sovới trồng các cây trồng khác

1.1.3.3 Những điều kiện thuận lợi và khó khăn của sản xuất hoa ở Việt Nam

a) Những điều kiện thuận lợi của sản xuất hoa cắt cành ở Việt Nam:

Việt Nam là một nước nông nghiệp Diện tích tự nhiên lớn, 80% dân số sống bằngnghề nông Nông dân cần cù, giàu kinh nghiệm sản xuất Nghề trồng hoa có từ lâuđời.

Thị trường tiêu thụ hoa nội địa ngày càng mở rộng Có tiềm năng xuất khẩu hoa racác nước

Một số họ, loài hoa nhiệt đới có nguồn gốc ở Việt Nam Thích hợp với điều kiện

tự nhiên của vùng

Nhà nước đang khuyến khích phát triển hoa để phục vụ nhu cầu trong nước vàxuất khẩu

b) Những hạn chế của sản xuất hoa ở Việt Nam:

Khí hậu miền Bắc nóng, ẩm về mùa hè Đặc biệt trong các tháng 5 đến tháng 8 Sốngày nhiệt độ cao (>300C ), độ ẩm không khí cao (85-90%) Mùa đông có gió mùađông bắc lạnh Nhiều ngày nhiệt độ dưới 150C Độ chiếu sáng ngắn, yếu Miền Namquanh năm nóng ấm, có một mùa nóng khô và một mùa nóng mưa, ẩm độ cao Điềukiện khí hậu đó không thuận lợi cho các cây hoa có nguồn gốc ôn đới

Chưa có các giống hoa chất lượng cao, thích ứng với điều kiện của vùng Tuyvùng có một số giống đẹp, quý như hoa lan, trà, anthurium,… nhưng ở dạng hoa dại.Thị trường thế giới hiện giờ ưu thích các dạng hoa lai tạo đẹp và có màu sắc sặc sỡhơn

Sản xuất hoa tản mạn Các tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất, bảo quản hoa chưađược áp dụng rộng rãi trong sản xuất hoa

Thiếu các phương tiện, thiết bị để bảo vệ hoa trong điều kiện nắng, nóng, mưabão,… như nhà kính, nhà lưới, nhà che,…

Thị trường hoa chưa phát triển cả ở trong nước và xuất khẩu

Đội ngũ cán bộ khoa học về cây hoa chưa được đào tạo đầy đủ.

Nhà nước chưa có bản quyền về giống cây trồng nói chung và về cây hoa nóiriêng Từ đó hạn chế việc trao đổi, đầu tư giống hoa của các nước vào Việt Nam

1.1.3.4 Phương hướng phát triển sản xuất hoa ở Việt Nam:

 Nhà nước cần đầu tư cho công tác nghiên cứu phát triển hoa ở Việt Nam, đểkhai thác hợp lý, tận dụng tiềm năng, khắc phục, hạn chế khó khăn, đem lạihiệu quả cao cho sản xuất hoa ở nước ta

 Trước mắt nên tập trung nghiên cứu, cải tiến giống, đầu tư phát triển các loàihoa nhiệt đới quý, đẹp, được thị trường chấp nhận, có khả năng thích ứng vớiđiều kiện tự nhiên của các vùng như hoa lan Phát triển các giống hoa ôn đớitheo mùa vụ ở các vùng thảo nguyên có khí hậu thích hợp

 Tăng cường đào tạo cán bộ về hoa Áp dụng các tiến bộ kỹ thuật về sản xuất,bảo quản, chế biến hoa của thế giới vào điều kiện sản xuất hoa của vùng

 Tạo cơ sở vật chất kỹ thuật cho sản xuất, chế biến, bảo quản hoa như nhà lưới,nhà kính, nhà che cây hoa, kho lạnh, bến bãi bảo quản, lưu giữ phục vụ xuấtkhẩu hoa

 Tìm kiếm thị trường tiêu thụ hoa

 Ra đời luật bản quyền về giống cây trồng

 Tích cực hợp tác, mời các chuyên gia hàng đầu về hoa của các nước tiên tiếnsang truyền đạt kinh nghiệm, kỹ thuật trong sản xuất hoa

1.2 Giới thiệu về hoa Đồng Tiền:

1.2.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm của hoa Đồng Tiền:

1.2.1.1 Nguồn gốc:

Hoa Đồng Tiền có tên khoa học là Gerbera jamesonii Hoa Đồng Tiền gồm nhiều

loài thuộc chi Gerbera Chi này có khoảng 30-100 loài sống hoang dã, phân bố ở Nam

Mỹ, Châu Phi đại lục, Madagascar và vùng nhiệt đới Châu Á Chi Gerbera rất phổ

biến và được trồng tại vườn chủ yếu là các giống lai giữa Gerbera jamesonii và một loài khác ở Nam Phi là Gerbera hybrida Hiện nay tồn tại hàng trăm giống khác nhau 1.2.1.2 Phân loại:

 Nhóm 1- hoa đơn: hoa chỉ có một hoặc hai tầng cánh, xếp xen kẽ nhau tạo

vòng tròn Hoa mỏng và yếu hơn hoa kép, màu sắc hoa ít hơn, điển hình làmàu trắng, đỏ, tím, hồng

 Nhóm 2- hoa kép: cành hoa to, gồm hơn hai tầng cánh, bông to, đường kính

hoa có thể đạt tới 12-15 cm, cánh hoa tụ lại thành bông nằm ở đầu trục chính,cuống dài 40-60 cm Màu sắc đa dạng như màu trắng, đỏ, vàng, hồng, màugạch cua

 Nhóm 3- hoa đơn nhị kép: bên ngoài cùng cánh đơn, bên trong cánh kép dày

đặc, thường màu trắng trong lớp cánh kép màu cánh sen nhưng nhóm nàykhông đẹp bằng hoa kép

a b

C Hình 1.2: Hình các nhóm hoa Đồng Tiền

 Rễ: rễ hoa Đồng Tiền thuộc dạng rễ chùm, phát triển khỏe, rễ hình ống, ănngang và nổi phía trên mặt luống, rễ thường vươn dài tương ứng với diện tích

lá tỏa ra

 Hoa: hoa Đồng Tiền do hai loại hoa nhỏ hình lưỡi và hình ống tạo thành, làloại hoa tự đơn hình đầu Hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc ở phía ngoài xếpthành vòng hoặc vài vòng nhỏ, do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được

gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa, rất được chú trọng Trong quá trình hoa nở, hoahình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở theo thứ tự từ ngoài vào theo từng vòngmột.

 Quả: quả Đồng Tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt nhõ,một gram hạt có khoảng 280-300 hạt

1.2.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa Đồng Tiền ở Việt Nam:

to, cánh dày, gồm nhiều tầng xếp lại với nhau, màu sắc phong phú, hình dáng hoa cânđối, rất đẹp, năng suất cao Vì vậy, những giống này đã được tiếp nhận và phát triểnmạnh mẽ ở khắp mọi vùng, mọi tỉnh thành trên cả nước

Trong các loại hoa Đồng Tiền đã và đang trồng tại Việt Nam thì hoa Đồng Tiềnkép nhập nội là một trong những cây cho hiệu quả kinh tế cao nhất Từ một sào hoaĐồng Tiền giống mới chăm sóc đúng kỹ thuật có thể cho thu nhập gần 50triệu/sào/năm

1.2.2.2 Tình hình tiêu thụ:

Hiện nay, hoa Đồng Tiền là loài hoa rất được ưu chuộng với giá cả phải chăng.Nhưng tình trạng sản xuất hoa Đồng Tiền của Việt Nam (cũng như các sản phẩm cây

cảnh khác) khó xâm nhập vào thị trường thế giới Vì chất lượng, chủng loại, kích cỡkhông đồng đều, chưa đáp ứng được thị hiếu của khách hàng quốc tế.

Sự chênh lệch về giá cả giữa thị trường hoa Việt Nam và thị trường hoa thế giớicũng thể hiện rõ Ở hoa Đồng Tiền, khi bán tại ruộng giá dao động từ 500-1.500đồng/ bông, bán trên thị trường giá trong khoảng từ 1.500-2.500 đồng/bông (tùy theomùa, dịp lễ mà giá bông khác nhau) Trong khi đó, giá bán hoa Đồng Tiền tại Mỹ là20.000-25.000 đồng/bông

1.2.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa Đồng

Tiền:

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa

Đồng Tiền trên thế giới:

Theo điều tra nghiên cứu về công nghệ sinh học thực vật trên thế giới ở hoa ĐồngTiền, người ta có thể sử dụng đỉnh sinh trưởng, đế hoa, lá, cuống lá, bầu nhụy, noãn,

… làm mẫu cấy Việc tái sinh mẫu từ lá non là thành công nhất, khi sử dụng mẫu cấy

là đỉnh sinh trưởng trải qua nhiều công đoạn để tạo ra một khối lượng sinh khối lớn.Theo kết quả của viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ, sự phát sinh cơ quan và sựhình thành của chồi từ mô sẹo ở hoa Đồng Tiền có hệ số nhân cao Các mô sẹo này

được hình thành từ lá ex vitro, các mô sẹo phát triển trong môi trường MS bổ sung

0,4 mg/l BAP, 4 mg/l NAA và 3% succrose Có 2 loại mô sẹo được hình thành: mộtloại riêng rẽ và không chứa chất diệp lục tố được hình thành chủ yếu trên bề mặt vếtcắt của mô nuôi cấy, và một tập hợp mô sẹo chứa chất diệp lục tố Tỉ lệ chồi tái sinhhình thành được khẳng định là có liên quan đến nồng độ chất dinh dưỡng trong môitrường nuôi cấy Khi cấy mô sẹo vào môi trường chứa 2 mg/l NAA và 1 mg/l BAP,

mô tái sinh được hình thành với tỉ lệ cao (83,3%)

Theo Skoog và Miller (1958), quá trình phát triển của mô sẹo hoa Đồng Tiền cần

có cả cytokinin và auxin Mô sẹo không hình thành khi môi trường nuôi cấy chỉ chứa

BAP hay chỉ chứa NAA Mô sẹo hình thành tốt nhất ở nồng độ NAA cao và BAPthấp.

Theo Pierik và Segers (1973), sự hình thành mô sẹo bởi cytokinin sẽ tăng lên khi

có mặt auxin trong môi trường, đặc biệt là IBA Cytokinin hiệu quả nhất là BAP.Thêm vào đó là kết quả nghiên cứu của Huang (2001) dùng môi trường MS bổ sung 1mg/l BA và 0,05 mg/l IBA thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ đỉnh chồi và từcuống lá

Kết quả nghên cứu của Jerzy và Lubonskg (1991) cho thấy số chồi hình thành caonhất (8-11 chồi) trong môi trường có 10 mg/l BAP, nhưng có vài chồi yếu và xuấthiện hiện tượng thủy tinh thể Trong môi trường BA chứa 1-2 mg/l BA chỉ hình thành1-3 chồi

Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ đã kết luận rằng khi chỉ sử dụng BAP trongmôi trường nuôi cấy mà không kết hợp NAA thì hệ số nhân của chồi thấp, còn khidùng riêng NAA thì không có một chồi nào xuất hiện Viện cũng đưa ra môi trườnggiúp cây ra rễ tốt nhất là MS + NAA và IBA Theo Barbosa (1992) hệ thống rễ pháttriển tốt hơn trong môi trường MS + IAA (nồng độ từ 0,5; 1,0; 2,0 và 4,0 mg/l)

Theo viện nghiên cứu nông nghiệp Banglaclech, trong nhân giống hoa Đồng Tiền

in vitro, những nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau (IAA;

NAA; 2,4-D và kinetin) có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau trong sự táisinh chồi cũng như trong quá trình hình thành mô sẹo trên những mô cấy khác nhau

của cây hoa Đồng Tiền trong điều kiện in vitro Trong quá trình tái sinh chồi và nhân lên của chồi thì những mẫu cấy ban đầu là đỉnh chồi hoặc rễ cây in vitro tỏ ra có hiệu

quả hơn so với các mẫu từ các mô khác của cây Cũng theo nghiên cứu này, môi

trường MS bổ sung 2 mg/l NAA cho bộ rễ của cây hoa Đồng Tiền in vitro hình thành

sớm và nhiều nhất Ngoài ra, những mô sẹo phân chia, phát sinh phôi khi nuôi cấy lá

và cuống lá in vitro trên môi trường MS bổ sung thêm 0,4 mg/l 2,4-D.

1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa

Đồng Tiền trong nước:

Theo phương pháp truyền thống, người nông dân thường nhân giống bằng cáchtách cây con từ cây mẹ để làm giống cho thế hệ sau Phương pháp này vẫn được sử

dụng đến ngày nay Cho đến khi phương pháp nhân giống bằng kỹ thuật in vitro ra

đời, người nông dân đã nhanh chóng tiếp thu kỹ thuật công nghệ sinh học mới này và

đã áp dụng trên diện rộng cho nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao và hiệu quảnăng suất cao hơn nhiều so với phương pháp nhân giống truyền thống

Ở nước ta, phương pháp nhân giống in vitro chỉ mới bắt đầu từ năm 1975, đến nay

đã khá phổ biến và được ứng dụng thành công đối với một số loại rau củ như khoaitây, dâu tây,… hoa lan, cúc, cẩm chướng Trong đó, có hoa Đồng Tiền là một trongnhững giống hoa có giá trị kinh tế cao Hiện nay, tại các trung tâm nghiên cứu hoặcnhững cơ sở nuôi cấy mô vừa và nhỏ trên địa bàn Đà Lạt – Lâm Đồng đã và đangphát triển mạnh mẽ phương pháp nhân giống cây trồng, nhất là những cây có giá trịcao Trong đó, hoa Đồng Tiền cũng là một trong những giống hoa ưu tiên hàng đầu.Tại những nông trại lớn có vốn đầu tư của nước ngoài như Hasfarm, Bonniefarm,nông trại tư nhân như Langbiang farm và các trung tâm nghiên cứu như Phân việnSinh học, Trung tâm Nghiên cứu Khoai Tây, Rau & Hoa đã bước đầu thành công và

là nơi cung cấp giống hoa Đồng Tiền in vitro.

1.3 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật:

1.3.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật:

Haberlandt (1902) cho rằng bằng cách nuôi cấy, người ta có khả năng tạo thànhcông các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng Nhưng ông đã thất bại trong nuôicấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm như cây bách hợp

(Erythronium), cây sữa chim (Ornithogalum), cây cỏ trai (Tradescantia) Nguyên

nhân là ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt (mất hết khả năng tái sinh)

Kotte (1922), học trò của Haberlandt và Robbins người Mỹ, lập lại thực nghiệmcủa Haberlandt, với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo Trong môitrường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nênmột hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại một thờigian, sau đó chậm dần và ngưng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trườngmới

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi White

nuôi cấy thành công một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với

môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, và nước chiết nấm men Sau đó, White

đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitaminenhóm B: thiamin (B1), pyridoxin (B6) và nicotinic acid Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ đãđược tiến hành ở nhiều cây khác nhau

Trong thời gian này, Gautheret ở Pháp đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy môtượng tầng một số cây gỗ Sau khi Went và Thimanm (1937) phát hiện chất sinhtrưởng đầu tiên là IAA và kết tinh được chất này, Gautheret xác nhận tác dụng kíchthích sinh trưởng mô sẹo của IAA và nhóm 3 vitamin do White đề nghị Cùng vớiNobercourt, Gautheret (1939), đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng của mô

sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường bán rắn.

Overbeek (1941), chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trongnuôi cấy phôi Sau đó, Steward (1948) xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo

cà rốt Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đãđược nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công NAA, 2,4-D bắt đầu được sử dụng

để trừ cỏ lá rộng trong nông nghiệp Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa,

2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượngthực vật trước đó rất khó nuôi cấy

Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sựnhân chồi.

Skoog (1954), tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã để lâu của aciddesoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh

mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rất rõ rệt Skoog cốtìm bản chất hiện tượng kích thích sinh trưởng của DNA DNA mới trích ly từ tinhdịch cá bẹ không có tác dụng nhưng nếu đem hấp trong hơi acid thì mẫu DNA mớicũng có hoạt tính như mẫu DNA cũ Skoog cho rằng chất có hoạt tính là một sảnphẩm phân giải của DNA Năm 1955, chất này được xác lập là 6-furfurylaminopurine

và được Skoog đặt tên là “Kinetin” do tác dụng kích thích sự phân bào Sau này,người ta chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hóahọc tương tự kinetin điều khiển và gộp chung các chất này vào nhóm cytokinin Chấtcytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô

Nikkell (1956) nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris).

Skoog và Miller (1957) công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệkinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹothuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ,ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo.Bergmanm (1960) công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu đượcmột huyền phù không có các tế bào dính cụm mà gồm hầu hết là tế bào đơn

Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnhsinh trưởng Từ kết quả đó, Lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thươngmại hóa Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triểnvới tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa

Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy, đánh dấu mộtbước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở choviệc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay.

Guha và Maheswari (1966) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi

phấn cây cà độc dược (Dautura inoxia) Một năm sau, nhóm Bourgin và Nitsch

(1967) tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá

1.3.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sựphân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy

1.3.2.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật:

a Điều kiện vô trùng:

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt

điều kiện vô trùng, mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bịnhiễm, chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy

b Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ:

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinhtrưởng của mô nuôi cấy

 Ánh sáng:

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thờigian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sángtác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với

đa số các loài cây là 12-18 giờ/ngày

Cường độ chiếu sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Cường

độ chiếu sáng cao kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợpcho nuôi cấy là 1000-7000 lux Ngoài ra, chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự

phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân

chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chếvươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay, trongcác phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-

2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35-40cm

 Nhiệt độ:

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới

sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ củamẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợpnhất cho sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C

1.3.2.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho

sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành cônghay thất bại của nuôi cấy mô và tế bào thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau cónhững đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một sốloài mới hoặc giống mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môitrường cơ bản phù hợp

Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau Trong đó, có một sốmôi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng đalượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd

và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn

Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một sốthành phần cơ bản sau:

 Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

 Nguồn cacbon

 Các vitamine và amino acid

 Các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

 Các chất điều hòa tăng trưởng

a Các muối khoáng đa lượng và vi lượng:

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khácnhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phảicung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe.

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là

lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy Cácthí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để pha môi trường khôngtinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trườngnuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I,Mo,…

b Nguồn cacbon:

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp,

do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào.Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccharose,một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccharose nhưng chúngthường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật Ngoài ra, khi khử trùng môitrường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng đường hóa,làm môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triểncủa tế bào

c Các vitamin và acid amin:

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các

loài khác nhau thì khác nhau

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và pháttriển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau

Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn

cho sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôicấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol.

d Các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường:

Nước dừa: được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loạicây Thông thường nước dừa được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quảnlạnh

Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô tếbào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tếbào động vật với nồng độ thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc bộtchuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l nhằm tăng cường sự phát triển của môsẹo hay cơ quan nuôi cấy

Agar: là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trongnuôi cấy mô thực vật Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ởnhiệt độ 60-1000C, đặc lại khi nhiệt độ xuống 450C Vì vậy, agar ổn định trong tất cảcác điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật Hơnnữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường Độ cứng của agar quyết địnhbởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường

Than hoạt tính: Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụngkhử độc Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòasinh trưởng và làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởng của

mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinh trưởngtrong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2iP Khả năng kích thích sự tăngtrưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do

mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy

e Các chất điều hòa sinh trưởng:

Các chất điều hòa sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật

là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản xuất với mộthàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chấtđược tổng hợp nhân tạo Các chất điều hòa tăng trưởng gồm 2 nhóm chính: auxin vàcytokinin Ngoài ra còn có gibberlin, ethylene, abscisic acid (ABA)

 Auxin:

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyêntrong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinhdưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù

tế bào và điều hòa sự phát triển sinh hình thái, đặc biệt khi nó được phối hợp vớicytokinin

Đặc tính của auxin: auxin là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid(IAA) Các chất có cấu trúc gần giống IAA và cùng có vai trò với IAA trong vài cơquan đều được gọi là auxin (như IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid).Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạomới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản trở sựphát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ởtrạng thái tiềm sinh) Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể noncủa rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này Trong sự tạo rễ,auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tổng hợp được),amino acid (như arginin) và nhất là các chất ortho diphenolic (như cafeic acid,chlorogenic acid)

 Cytokinin:

Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia Các hợp chấtnày xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và RNA Hợp chất

Cytokinin đầu tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là zeatin - một hợp chất cótrong phần lớn thực vật và vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống Kinetin, nhưng hoạt tínhcao hơn gấp 10 lần Sau zeatin, hơn 30 loại cytokinin khác cũng được cô lập Ngàynay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, có đặctính sinh lý giống kinetin Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều làcác aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6 như BA.

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tácđộng lên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Trong nuôi cấycác mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin kích thích sự phân đôinhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách, sự phânvách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tếbào và sinh tổng hợp protein Trong thân và rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài nhưngkích thích sự tăng rộng tế bào lá trưởng thành

Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) là mộtyếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi Như cậy,cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữaauxin (giúp tạo rễ), cytokinin (giúp tạo chồi) Sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này

là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển

Các chất kích thích điều hòa tăng trưởng hầu như không tan trong nước cất vì vậy khi pha các chất này cần lưu ý:

 Nhóm auxin chủ yếu tan trong cồn hoặc bazơ

 Nhóm cytokinin chủ yếu tan trong acid hay bazơ

Không nên pha một lượng dung dịch mẹ các chất sinh trưởng quá nhiều vì nó rất

dễ biến tính

 Gibberellin:

Gibberellin là một nhóm trong các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80hợp chất khác nhau Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là cósườn gibbane, được trích ra từ thực vật, vi sinh vật và được đánh số sau chữ GA Acidgibberellic3 (GA3) và hỗn hợp giữa GA3 với acid gibberellic7 (GA7) là nhữnggibberellin duy nhất có giá trị thương phẩm do chúng thường được sử dụng trongnuôi cấy mô thực vật.

Ảnh hưởng của gibberellin trên sự phát sinh hình thái: khi bổ sung gibberellin vàotrong môi trường nuôi cấy mô thực vật thì sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi,

rễ bất định và sự phát sinh phôi soma Ở mô sẹo thuốc lá, GA3 đặc biệt có tác dụngcản sự tạo chồi khi có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng và nó có tácdụng cản mạnh hơn khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện tối so với ngoài sáng.Trong thực vật, gibberellin có ảnh hưởng:

 Kích thích vươn thân qua kích thích phân bào và kéo dài tế bào Tạo ra thâncao ngược với tính lùn cây

 Kích thích vươn thân trong điều kiện ngày dài

 Kích thích nảy mầm ở hạt cần xử lý lạnh hay ánh sáng để phát sinh nảy mầm

 Kích thích sản xuất nhiều loại enzyme như α - amylase ở các loại hạt ngũcốc

 Gibberellins ngoại sinh kích thích sự hình thành và phát triển trái

 Phát sinh tính cái của hoa lưỡng tính

 Ethylene:

Ethylene được tổng hợp từ methionine ở nhiều loại mô khi phản ứng với stress.Dường như nó không cần thiết cho sinh trưởng sinh dưỡng Nó chỉ là mộthydrocarbon có ảnh hưởng trên thực vật Đặc biệt nó được tổng hợp ở mô trái quaquá trình lão hóa hay đang chín đột phát

Là một chất khí, ethylene vận chuyển bằng phương thức khuếch tán từ nơi nóđược tổng hợp Có một chất trung gian rất quan trọng 1- aminocyclopropane – 1-carbonxylic acid (ACC) có thể được vận chuyển và có thể giải thích những ảnhhưởng của ethylene ở xa nơi gây ra sự kích thích.

Ethylene có ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý của thực vật như:

 Sinh trưởng và biệt hóa chồi

 Hình thành rễ bất định

 Rụng lá và trái

 Phát sinh ra hoa ở một loài thực vật

 Phát sinh tính cái ở hoa lưỡng tính

 Nở hoa

 Lão hóa hoa và lá

 Chín trái

 Abscisic acid (ABA):

ABA là một phân tử đơn Tên gọi đầu tiên là abscisin II vì nó kiểm soát quá trìnhlão hóa ở cây vải Vào cùng thời điểm đó có một nhóm khác được gọi tên là dormintác động lên sự nảy mầm Để trung hòa thì tên gọi mới là abscisic acid Vì quy luậttác động của ABA trên sự rụng và lão hóa, nên ABA được coi là một chất ức chế.ABA ngoại sinh có tác động ức chế sinh trưởng ở thực vật, nên ABA được xem như

là chất bắt đầu (như tổng hợp protein ở hạt) hay như một chất ức chế

ABA được tổng hợp từ mevalonic acid ở lá thuần thục khi phản ứng với stress

thiếu nước Trong hạt cũng giàu ABA do được tích lũy từ lá hay được tổng hợp in situ.

Ảnh hưởng của ABA đến các quá trình sinh lý của thực vật:

 Đóng khí khổng: trong nước có nhiều ABA sẽ làm đóng khí khổng

 Gây nên sự vận chuyển sản phẩm quang hợp để phát triển hạt và được hấp thubởi phôi đang sinh trưởng.

 Phát sinh tổng hợp protein dự trữ trong hạt

 Tác động ngược lại ảnh hưởng của gibberellin đến tổng hợp α - amylase ởhạt ngũ cốc đang nảy mầm

 Phát sinh và duy trì sự nảy mầm ở hạt và chồi Quy luật tác động của ABA vẫnchưa xác định rõ, vì nó không chỉ tác động đến sự nảy mầm

1.3.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật:

1.3.3.1 Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu.

Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy Để tiến hành

nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ

quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kíchthước và vị trí lấy mẫu đó Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng vàkhử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodiumdichloroisocyanurate, clorua thủy ngân,…

1.3.3.2 Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống.

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống

in vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống

in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với

những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạocụm chồi từ mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 vàcác chất hữu cơ khác

1.3.3.3 Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro.

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôicấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệunuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể

chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhângiống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra

nhanh Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian

dài

1.3.3.4 Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh.

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bịchuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môitrường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là cácchất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên

ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ

thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của

mẫu, kiểu di truyền Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.

1.3.3.5 Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm.

Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trongchậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ ẩm cao,cường độ chiếu sáng thấp,… Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh sự thoáthơi nước ở lá

Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây conthường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra

rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ

Đây là gian đoạn rất quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con

thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro.

1.3.4 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật:

Cả về mặt lý luận và thực tiễn, nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô cónhững ưu điểm sau:

 Hệ số nhân giống cao: từ một tế bào sạch bệnh ban đầu có thể nhân nhanh vàcung cấp một lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên qui mô mặt bằng nhỏ

 Các cây đồng nhất về mặt di truyền

 Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống

 Chất lượng giống cao: bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, kết hợpvới một số biện pháp xử lý nhiệt, xử lý hóa chất có thể làm sạch bệnh trêngiống và tái tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất

 Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng

 Có thể nhân giống quanh năm, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kếhoạch sản xuất và cung cấp giống

 Các tập đoàn giống và giống sản xuất được lưu giữ trong điều kiện vô trùng,cách li hoàn toàn với các nguồn bệnh

 Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm

 Dễ dàng tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen

Bên cạnh những đặc điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống, phươngpháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần khắc phục:

 Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao

 Tiến hành nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảngthời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm

 Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo rathường ít đồng nhất về mặt kiểu hình

 Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng bổ sungvào môi trường nuôi cấy

1.3.5 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô thực vật:

Phương pháp nuôi cấy mô thực vật có ý nghĩa vô cùng quan trọng với việc nghiêncứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất vàđời sống.

1.3.5.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản:

Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sựsống Thông qua nuôi cấy mô thực vật có thể tiến hành so sánh đặc tính cơ thể với cácthành phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra mối tương quan giữa các

bộ phận trong cây Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi

từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, từ mô sẹo có thể kích thích

để tái sinh cây hoàn chỉnh Đây là ưu thế mà các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyềnhọc dễ dàng sử dụng trong việc của mình

Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chínhxác theo chu kỳ phát triển của cá thể Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phụcđược khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt mộtcách rõ rệt Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinhtrưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài Từ đó có thể tìm racác mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn Bằngphương pháp nuôi cấy mô và tế bào có thể tiến hành nghiên cứu mối quan hệ ký sinh

và ký chủ Như vậy, rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơbản Từ đó, tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật, giúp cho việc phòng bệnhcho cây tốt hơn, đỡ tốn kém hơn

1.3.5.2 Về mặt thực tiễn sản xuất:

Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giốngcây quý, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trongcông tác giống cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chỉ sau một thời gian ngắn

có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất sinh khối được tạo ra vẫn giữ nguyên

được thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid,glycoside, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm,những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn trong công nghiệp.

1.4 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật:

1.4.1 Nuôi cấy nốt đơn thân:

Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên mang mộtđoạn thân ngắn Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo thành câynguyên vẹn

Chồi được thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinhdưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng Chồi mới tăng trưởng sẽ mangnhiều lá và các chồi bên ở các nách lá tiếp tục được cấy chuyền đến khi đạt đủ sốlượng chồi cần thiết thì chúng được cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh vàđược chuyển ra trồng trong đất

Phương pháp này đã được thưc hiện thành công trên một số đối tượng như: câyMăng tây, Khoai tây, Lê, Hoa hồng, Cà chua, Dưa chuột, Cà tím,…

1.4.2 Nuôi cấy chồi bên:

Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân.Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân

và thường không cần đến cytokinin để phát triển

Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng

và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ