Phương pháp xác định hàm lượng Vitamin

Vitamin B2 giữ vai trò xác định trong các phản ứng của một số enzyme cầnthiết cho quá trình hô hấp tham gia vào thành phần của các enzyme vậnchuyển hiđrô.Vai trò: Cân bằng dinh dưỡng: vi

MỞ ĐẦU

Vitamin là thành phần không nhiều nhưng lại hết sức quan trọng trong thựcphẩm Nó cần thiết cho sự phát triển, duy trì và thực hiện các hoạt độngchức năng của cơ thể con người

Vitamin được tổng hợp chủ yếu trong cơ thể thực vật và vi sinh vật, người vàđộng vật hầu như không thể tự tổng hợp được vitamin Tuy nhiên cũng cómột vài vitamin đặc biệt như :vitamin C được tổng hợp hầu hết cơ thể độngvật, vitamin A, D chỉ phát hiện thấy trong cơ thể người ,động vật nhưngkhông có trong thực vật

Nhu cầu về vitamin trong cơ thể người rất ít nhưng nhất thiết phải được cungcấp đầy đủ qua thức ăn có nguồn từ động vật, thực vật, vi sinh vật.khi thiếuvitamin người và động vật sẽ mắc bệnh

Có nhiều vitamin nhưng được chia làm 2 nhóm lớn: vitamin tan trong nước vàvitamin tan trong chất béo

Do vitamin có cấu tạo hóa học rất khác nhau, nên mỗi loại vitamin có nhữngphản ứng hóa học đặc trưng khác nhau Người ta sử dụng các phản ứng hóahọc đặc trưng đó để định tính và định lượng vitamin

Vitamin, hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động

chuyển hoá bình thường của cơ thể sinh vật Có nhiều loại vitamin và chúngkhác nhau về bản chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý

Các loại vitamin

Vitamin A, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, D1, D2, D3, D4, D5, E, K Vitamin A, D, E, K hòa tan trong chất béo

Vitamin B, C hòa tan trong nước

Vitamin A

Còn có các tên là retinol, axerophthol

Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:

Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơ thể

Tiền vitamin A: nó chính là một tiền chất của vitamin A được biết đến nhiềudưới tên bêta-caroten Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruột thành vitamin A

để cơ thể có thể sử dụng

Vitamin A1, A2 được gặp ở trạng thái tự nhiên trong cơ thể động vật:

Vitamin A có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể con người:

Thị giác: mắt được cấu tạo bởi các sắc tố có chứa vitamin A Nó được hấp thụbởi luồng thần kinh được vận chuyển nhờ dây thần kinh thị giác Vì vậy sự cómặt của vitamin A là một phần không thể thiếu đối với việc đảm bảo thị giáccủa con người

Các mô: Vitamin A kích thích quá trình phát triển của các biểu mô như môsừng, ruột và các con đường hô hấp Nó cũng ảnh hưởng đặc biệt đến da, kíchthích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da như trứng cá

Sự sinh trưởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người,nên vitamin A là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển cua phôi thai và trẻ

em Vitamin A còn có vai trò đối với sự phát triển của xương, thiếu vitamin Alàm xương mềm và mảnh hơn bình thường, quá trình vôi hoá bị rối loạn

Hệ thống miễn dịch: do các hoạt động đặc hiệu lên các tế bào của cơ thể,vitamin A tham gia tích cực vào sức chống chịu bệnh tật của con người

Chống lão hoá: Vitamin A kéo dài quá trình lão hoá do làm ngăn chặn sự pháttriển của các gốc tự do

Chống ung thư: hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng dẫn đếnngăn chặn được một số bệnh ung thư

Vitamin D

Còn có các tên là antirachitic factor, calcitriol

Đây là một nhóm hóa chất trong đó về phương diện dinh dưỡng có 2 chất quantrọng là ecgocanxiferon (vitamin D2) và colecanxiferon (vitamin D3) Trongthực vật ecgosterol, dưới tác dụng của ánh nắng sẽ cho ecgocanxiferon Trongđộng vật và người có 7-dehydro-cholesterol, dưới tác dụng cửa ánh nắng sẽ chocolecanxiferon

Vai trò:

Hình thành hệ xương: vitamin này tham gia vào quá trình hấp thụ canxi vàphotpho ở ruột non, nó còn tham gia vào củng cố, tu sửa xương

Cốt hóa răng: tham gia vào việc tạo ra độ chắc cho răng của con người

Chức năng khác: vitamin D còn tham gia vào điều hoà chức năng một số gen.Ngoài ra, còn tham gia một số chức năng bài tiết cảu insulin, hormon cận giáp,

hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới

Vitamin E

Vitamin E là một chất chống oxy hoá tốt do cản trở phản ứng xấu của các gốc

tự do trên các tế bào của cơ thể

Vai trò:

Ngăn ngừa lão hoá: do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc

tự do mà vitamin E có vai trò quan trọng trong việc chống lão hoá

Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng làmchậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư

Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm các cholestrol xấu và làm tănng

sự tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bênh tim mạch

Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường bằngviệc bảo vệ các tế bào

Vitamin B1

Còn có các tên là thiamin, aneurin

Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết chocác hoạt động chức năng của con người

Vai trò:

Đồng hoá đường: vitamin B1 cần thiết cho việc tạo ra một loại enzym (tham giavào thành phần của coenzyme) quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hoáđường và quá trình phát triển của cơ thể Khi thiếu vitamin B1 axit pyruvic sẽtích lũy trong cơ thể gây độc cho hệ thống thần kinh Vì thế nhu cầu vitamin B1đối với cơ thể tỉ lệ thuận với nhu cầu năng lượng

Nhân tố ngon miệng: kích thích sự tạo thành một loại enzyme tham gia vào quátrình đồng hoá thức ăn, kích thích cảm giác thèm ăn

Sự cân bằng về thần kinh: Vitamin B1 tham gia điều hòa quá trình dẫn truyềncác xung tác thần kinh, kích thích hoạt động trí óc và trí nhớ

Vitamin B2

Vitamin B2 giữ vai trò xác định trong các phản ứng của một số enzyme cầnthiết cho quá trình hô hấp (tham gia vào thành phần của các enzyme vậnchuyển hiđrô).

Vai trò:

Cân bằng dinh dưỡng: vitamin B2 tham gia vào sự chuyển hoá thức ăn thànhnăng lượng thông qua việc tham gia sự chuyển hoá glucid,lipid và protein bằngcác enzyme

Nhân tố phát triển

Tình trạng của da

Thị giác: vitamin B2 có ảnh hưởng tới khả năng cảm thụ ánh sáng của mắt nhất

là đối với sự nhìn màu Kết hợp với vitamin A làm cho dây thần kinh thị giáchoạt động tốt đảm bảo thị giác của con người

Vitamin C

Còn có các tên là acid ascorbic

Vitamin C là một chất chống oxy hoá tốt, nó tham gia vào nhiều hoạt động sốngquan trọng của cơ thể

Vai trò:

Kìm hãm sự lão hoá của tế bào: nhờ phản ứng chống oxy hoá mà vitamin Cngăn chặn ảnh hưởng xấu của các gốc tự do, hơn nữa nó có phản ứng tái sinh

mà vitamin E - cũng là một chất chống oxy hoá - không có

Kích thích sự bảo vệ các mô: chức năng đặc trưng riêng của viamin C là vai tròquan trọng trong quá trình hình thành collagen, một protein quan trọng đốI với

sự tạo thành và bảo vệ các mô như da, sụn, mạch máu, xương và răng

Kích thích nhanh sự liền sẹo: do vai trò trong việc bảo vệ các mô mà vitamin Ccũng đóng vai trò trong quá trình liền seo

Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin E tạo thành nhân tố quan trọng làmchậm quá trình phát bệnh của một số bênh ung thư

Tăng cường khả năng chống nhiễm khuẩn: kích thích tổng hợp nên interferon chất ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn và virut trong tế bào

-Dọn sạch cơ thể: vitamin C làm giảm các chất thải có hại đối với cơ thể nhưthuốc trừ sâu, kim loại nặng, CO, SO2, và cả những chất độc do cơ thể tạo ra

Chống lại chứng thiếu máu: vitamin C kích thích sự hấp thụ sắt bởi ruột non.Sắt chính là nhân tố tạo màu cho máu và làm tăng nhanh sự tạo thành hồng cầu,cho phép làm giảm nguy cơ thiếu máu

ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN

A) ĐỊNH TÍNH VITAMIN

I) Nhóm vitamin tan trong chất béo

1) Các phản ứng của vitamin A (retinol)

a) Phản ứng của vitamin A với H2SO4

Nguyên tắc: khi tác dụng với H2SO4 đặc, vitamin A bị mất nước tạo thành sảnphẩm ngưng tụ có màu hồng không bền, sau đó biến đổi nhanh thành màu đặctrưng của lipocrom

Nguyên liệu và hóa chất: Dầu cá được hòa tan trong clorofooc với tỷ lệ 1/5;H2SO4 đặc

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch vitamin A trong clorofooc vàhai giọt H2SO4 đặc Lắc đều, quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm, giảithích kết quả

b) Phản ứng của vitamin A với SbCl3

Nguyên tắc: Vitamin A có tác dụng tương hỗ với SbCl3 bão hoà trong

chlorofooc, bị mất nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu, sau đó có sự biếnđổi màu trong ống nghiệm

Hóa chất: SbCl3 bão hòa trong chlorofooc không ngậm nứơc; dầu cá

Dụng cụ: ống nghiệm (1), lọ đựng hóa chất (2)

Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2 giọt dầu cá và 1ml SbCl3 bão hòa trongchlorofooc Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kếtquả?

c) Phản ứng của vitamin A với FeSO4

Nguyên tắc: Trong môi trường axit, vitamin A tác dụng với FeSO4 tạo thành sảnphẩm có màu không ổn định (đối với carotin là tiền của vitamin A tạo thànhmàu đặc trưng)

Hóa chất và nguyên liệu: FeSO4 bão hòa trong CH3COOH kết tinh, H2SO4(đ),dầu cá tươi

Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1ml FeSO4 bão hòa trongCH3COOH và 4 giọt H2SO4(đ) quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm vàgiải thích hiện tượng

2) Phản ứng của vitamin K với anilin

Nguyên tắc: Metinon có cấu trúc tương tự vitamin K1, được tổng hợp nhân tạo,

có hoạt tính sinh học cao Khi metinon tác dụng với anilin tạo thành các hợpchất màu Phản ứng như sau:

Nguyên liệu và hóa chất: vitamin K 0,2% trong cồn, anilin chưng cất lại

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml vitamin K 0,2% và 10 giọt thuốc thửanilin Lắc đều, quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả

3) Các phản ứng của vitamin E (Tocopherol)

a) Phản ứng của vitamin E với FeCl3

O H

Aniline

Nguyên tắc: Tocopherol tác dụng với FeCl3, bị oxy hóa thành

tocopherylquinon xảy ra phản ứng sau:

Hóa chất: FeCl3 5%, vitamin E 0,1% trong cồn

Dụng cụ: ống nghiệm, lọ đưng hóa chất

Tiến hành: cho vào ống nghiệm 10 giọt vitamin E 0,1% và 10 giọt FeCl3 5%,lắc đều Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả? b) Phản ứng của vitamin E với HNO3

Nguyên tắc: dưới tác dụng của HNO3 đặc, vitamin E bị oxi hóa thành hợp chấtkinon

Nguyên liệu và hóa chất:vitamin E( 0.1 %) trong cồn 96 0 ,HNO3(đ)

Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 10 giọt vitamin E (0.1 %) và 1ml HNO3(đ)lắc nhẹ, để 1 đến 2 phút quan sát và giải thích hiện tượng

4) Phản ứng của vitamin D (canxipherol)

a) Phản ứng của vitamin D với anilin

Nguyên tắc: trong môi trường axit ,vitamin D tác dụng với anilin,tạo thành hợpchất màu đặc trưng

Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1 ml clorofooc và 4 giọtthuốc thử anilin,lắc đều trong ống nghiệm xuất hiện các thế nhũ tương có màu.Đun ống nghiệm sôi trong 30 giây, dung dịch biến đổi thành màu đặc trưng

b) Phản ứng của vitamin D với SbCl 3

Nguyên tắc: vitamin D tác dụng với SbCl3 trong clorofooc tạo thành hợp chấtmàu đặc trưng

Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 1 ml dầu cá tan trong clorofooc Lắc đềuquan sát màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả

II) Nhóm vitamin tan trong nước.

1) Phản ứng phát huỳnh quang của vitamin B 1

a) phản ứng tạo thành thiocrom

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của ferrixianuakali, tiamin

bị oxi hóa thành tiocrom Dưới ánh sáng của tia tử ngoại, tiocrom phát huỳnhquang có màu đặc trưng.phản ứng như sau:

Nguyên liệu và hóa chất: Vitamin B1 1%, NaOH 10%, K3[Fe(CN)6]1%, rượuizobutilic

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 20 giọt vitamin B1 1%, 10 giọt NaOH 10% và

5 giọt K3[Fe(CN)6] 1% Lắc đều cho đến khi dung dịch xuất hiện màu Thêmvào ống nghiệm 20 giọt rượu izobutilic, lắc đều, sau đó để yên, dung dịch trongống tạo thành 2 lớp ngăn cách Để ống nghiệm dưới ánh sáng mặt trời hoặcdưới ánh đèn tia tử ngoại, quan sát sự tạo thành huỳnh quang, giải thích kếtquả

b) phản ứng AgNO 3

Nguyên tắc: Thiamin phản ứng với nitrat Ag để cho kết tủa màu xám

Tiến hành:Dùng 2ml dung dịch vitamin B1 ,axit hóa bằng axit nitric loãng 0.1%

và them vào đó 1 ml dung dịch AgNO30.5%, các màng kết tủa xuất hiện

c) Phản ứng với thuốc thử diazo (hỗn hợp của axit sulfannilic và natri nitric)

Nguyên tắc: vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo sẽ cho màu vàng da camhoặc đỏ

Nguyên tắc: Cho vào ống nghiệm 0.5 ml dung dịch axit sulfannilic vào 0.5 mldung dich natri nitric, thêm vào đó vài giọt dung dịch vitamin B1 và 10 giọtcarbonat Na 10%.Lắc ống nghiệm ta sẽ thấy màu đỏ da cam

2) Phản ứng của vitamin B 6 (Pyridoxin) với FeCl 3:

Nguyên tắc: Pyridoxin tác dụng với FeCl3 tạo thành phức chất có màu đặc

trưng.phản ứng như sau:

Hóa chất: pyridoxin 1%; FeCl3 5%;

Dụng cụ: ống nghiệm (1); lọ đựng hóa chất (2)

Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml pyridoxin 1% và 5 giọt FeCl3, lắc đều.Quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả?

3) Các phản ứng của vitamin C

a) Phản ứng của vitamin C với ferrixianuakali (K3[Fe(CN)6])

Nguyên tắc: Vitamin C có 2 nhóm enol linh động dễ dàng tham gia vào các

phản ứng oxy hoá khử với một số chất như: ferrixianuakali; 2,6 – diclorophenolindolphenol, iot.phản ứng xảy ra như sau:

Hóa chất: K3[Fe(CN)6] 5%; FeCl3 5%; axit ascorbic 1%.

Dụng cụ: ống nghiệm , lọ đựng hóa chất

Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml axit ascorbic 1%, 1ml K3[Fe(CN)6] 5% và

3 giọt FeCl3 5%, lắc nhẹ Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giảithích kết quả?

b) Phản ứng của vitamin C với 2,6-diclorophenol indophenol (2,6D)

2,6D trong môi trường kiềm có màu xanh, trong môi trường axit có màuhồng, khi tác dụng với vitamin C, phản ứng oxi hóa –khử diễn ra như sau:

Hóa chất:axit ascorrbic 1%, 2,6D 0.01%; HCl 2%

Tiến hành: cho vào ống nghiệm 20 giọt 2,6D 0.01% và 2 giọt HCl 2%dung dịchxuất hiện màu.sau đó cho 10 giọt

- ống Hatch

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Becher, erlen

Chuẩn bị hóa chất:

Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích , gồm:

- nước cất loại dùng cho HPLC

- Dietyl ete tinh khiết không có Peroxit

Xây dựng đường chuẩn:

Nếu dùng chuẩn vitamin A thì phân tích ngay trên thiết bị HPLC Nếu Dùngvitamin A dưới dạng este, thí dụ như vitamin A acetat, vitamin A palmitat, thìphải tiến hành xà phòng hóa để giải phóng vitamin A ra thể tự do rồi mới tiếnhành phân tích bằng HPLC

Xây dựng đường chuẩn dùng Vitamin A palmitat

Quá trình xà phòng hóa:

Cân 18.32 mg vitamin A palmitat tương ứng với 10mg vitamin A ( phân tửlượng của Vitamin A là 286, phân tử lượng của vitamin A Palmitat là 524) chovào bình cầu có cổ nhám, thêm 20-40ml dung dịch KOH 2M trong etanol và0.5natri ascorbat lắp ống sinh hàn hồi lưu Đặt trên nồi cách thủy, xà phònghóa ở nhiệt độ 70oC trong 30 phút

Chuyển dung dịch còn nóng vào một bình lóng, rửa bình cầu nhiều lần bằngH2O cất và tập trung nước rửa vào bình lóng

Chú ý: lượng nước không được quá 3 lầnlượng KOH 2M để tránh hình thànhnhủ tương có thể gây mất Vitamin A khi chiết

Vitamin A từ dung dịch đã xà phòng hóa được chiết 3 lần bằng dietyl ete không

có peroxit 3 lần, mỗi lần 40ml Tập trung lớp ete chiết được vào một bình lóng.Rửa lớp ete nhiều lần với nước cất (mỗi lần 50ml) cho đến khi không còn vếtkiềm (thử với phenolphtalein) Loại nước trong dịch chiết etebằng cách lọc qualớp Na2SO4 khan, rửa lớp Na2SO4 ba lần, mỗi lần với 10ml ete

Gộp tất cả lốp ete vào bình quả lê Cô quay đến cạn Cặn còn lại hòa tan trongacetonitrile, chuyển sang bình định mức 10ml Định mức đến vạch bằng

acetonitrile Dung dịch này dùng để làm dung dịch vitamin A chuẩn gốc

(1000mg /l)

Dung dịch chuẩn 100ug/ml: hút chính xác 1ml dung dịch vitamin A chuẩn gốc1000ug/ml vào bình định mức 10ml Định mức tới vạch bằng ACN