ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

MỤC TIÊU• Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPN Most Probable Number • Trình bày được phạm vi áp dụng của thử nghiệm • Nêu và thực hiện được các bước của qui trình định lượng Coli

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E coli

BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

MỤC TIÊU

• Trình bày được nguyên lý của phương

pháp MPN (Most Probable Number)

• Trình bày được phạm vi áp dụng của thử nghiệm

• Nêu và thực hiện được các bước của qui

trình định lượng Coliforms và E coli bằng

phương pháp MPN

PHƯƠNG PHÁP MPN (Phương pháp số có xác suất

cao nhất)

Phương pháp MPN

• Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số

lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một thể tích mẫu

• Được thực hiện dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các

độ pha loãng khác nhau của mẫu

• Thông thường các độ pha loãng được

chọn liên tiếp nhau

Phương pháp MPN (tt)

Phương pháp MPN (tt)

B1: Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho

sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng

Phương pháp MPN (tt)

B2: Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp B3: Ủ mẫu đã cấy ở nhệt độ thích hợp

Phương pháp MPN (tt)

B4: Ghi nhận sự phát triển của vi sinh vật trong MT

B5: ghi nhận số ống dương tính

3

Lựa chọn các độ pha loãng

Thứ tự ưu tiên chọn từ 1→4

1.Chọn nồng độ thấp nhất có tất cả ống (+) → chọn 2 nồng độ nhỏ hơn để tính, ví dụ1; nếu có nhiều hơn 1 trong 3 nồng độ được chọn này

Phương pháp MPN (tt)

B6: Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV

3

KẾT QUẢ

MPN calculator software

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG

PHƯƠNG PHÁP MPN

• Trực khuẩn gram âm

• Không sinh bào tử

• Hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý,

• Có khả năng lên men lactose sinh acid

và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ

• E coli là một Coliforms phân

Phạm vi áp dụng

• Thực phẩm, thức ăn chăn nuôi

• Các mẫu môi trường khu vực sản xuất và

xử lý thực phẩm

Nguyên lý của phương pháp

• Coliforms: Định lượng vi sinh vật lên menlactose sinh khí khi nuôi cấy trong môitrường tăng sinh chọn lọc ở 30oC, 37oC vàphù hợp trong phép thử khẳng định

• E coli: là nhóm coliforms phân, được xác

định dựa trên khả năng lên men lactosesinh khí và tạo thành Indol từ Tryptophankhi nuôi cấy trong canh thang tăng sinh

TIẾN HÀNH

Chuẩn bị môi trường

Coliforms and E coli

Bước 1: Đồng nhất mẫu

• Cân 10 g/10ml mẫu

• Đồng nhất mẫu trong 90 ml dd NMSLtrong bình tam giác → nồng độ 10-1

Coliforms and E coli

Bước 2: Pha loãng mẫu

Coliforms and E coli

Bước 3: Nuôi cấy trên môi

trường tăng sinh chọn lọc 1

• Tại mỗi nồng độ được chọn, cấy mẫu lên 3 ống môi

trường TLS

• Ủ 37oC/24-48h

• Quan sát hiện tượng

đục/sinh khí

Bước 4: Nuôi cấy trên môi

trường chọn lọc 2

• Chọn các ống môi trường TLS có kết quả dương tính (đục/sinh khí)

• Cấy chuyển huyền dịch vi khuẩn

từ môi trường TLS sang môi

trường canh thang Brilient green

• Ủ 37 o C/24-48h

• Xác định các ống môi trường Brillient

green cho kết quả dương tính (có sinh hơi) → Coliforms dương tính

• Xác định số ống môi trường TLS dương tính với Coliforms tại mỗi nồng độ pha loãng mẫu sử dụng

• Tra bảng MPN → tính kết quả

• Ủ 44oC/24-48h

E coli

E coli

Bước 5: Thử khả năng sinh Indol

• Cấy chuyển huyền dịch vi khuẩn ở các

ống EC dương tính sang môi trường

E coli

E coli

• Xác định số ống môi trường TLS dương

tính với E coli tại mỗi nồng độ pha loãng

mẫu sử dụng

• Tra bảng MPN → tính kết quả