Quy trình định tính samonella

Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín. Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa bảo quản không tốt) Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm cao. Khi tiếp xúc phân người và súc vật có nhiễm salmonella. Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MƠN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Salmonella xâm nhập vào thể???? • • • • • • Bất thực phẩm sống hay chưa nấu chín Sản phẩm từ gia cầm( kể sản phẩm bơ sữa bảo quản khơng tốt) Thịt gà trứng: thực phẩm có nguy nhiễm cao Khi tiếp xúc phân người súc vật có nhiễm salmonella Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo” triệu chứng đau bụng, tiêu chảy TRIỆU    Tiêu chảy, đau bụng, buồn ói ói, sốt, đau đầu,… Thường xảy khoảng 12-36h sau ăn Các triệu chứng kéo dài từ ngày đến tuần CHỨNG Không ăn / uống sữa sản phẩm từ sữa chưa trùng Rửa hoa quả, rau củ trước ăn 0 Giữ thực phẩm nhiệt độ 4.4 C -18 C Chỉ ăn thức ăn nấu chín Rửa dụng cụ sau thái thực phẩm sống Đặc điểm chung vi sinh vật Salmonella trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình từ 0.53µm Di chuyển tiên mao trừ S.gallimarum S.pullorum, không tạo bào tử Phát triển thích hợp nhiệt độ 35-37oC, pH từ 4-9 thích hợp pH=7.2 Tính chất hóa sinh Lên men glucose mannitol sinh acid không lên men saccharose lactose Không sinh indol, khơng phân giải ure, khơng có khả tách nhóm amine từ tryptophane   Hầu hết chúng sinh H2S Mơi trường hóa chất Mục đích Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW) Tăng sinh sơ Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RVS) Tăng sinh chọn lọc Selenit xystin/ Tetrathionat (TT) Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Phân lập Hektoen Entric Agar (HE) Tryptone soy agar (TSA) Phục hồi   Phương pháp thực *Quy trình định tính BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH Đây khâu quan trọng thiếu quy trình kiểm nghiệm Là sử dụng mơi trường tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa chất ức chế Ủ 37 độ C 1824h 25g mẫu 25g mẫu Đồng mẫu máy Stomacher + 225ml BPW 60 giây BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH Tên môi trường Thành phần Pepton 10g Dung dịch Buffered Peptone Water NaCl 5g (BPW) Na2HPO4 3,5g KH2PO4 1,5g Ngồi cịn sử dụng số môi trường: -Môi trường dịch thể Tryptic soy broth(TSB) Môi trường HE • Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen, tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc Tâm đen Môi trường BS (Bismuth Sulfite Agar) Polypeptone (hay peptone) 10g Cao thịt 5g Dextrose 5g Na2HP04 (anhydrous) 4g FeS04 (anhydrous) 0,3g Bismuth sulfite 8g Brilliant green 0,025g Agar 20g Nước cất 1lít Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, có xuất ánh kim tím Bước 4: Phục hồi • • Nếu đĩa có khuẩn lạc điển hình nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ cấy ria lên NA/TSA Ủ 3710C 24   Môi trường Thành phần Trypeptone Tryptic Soya Agar (TSA) Peptone đậu nành Agar 15g/l 5g/l 15g/l Bước :Khẳng định Nhằm xác nhận lại khuẩn lạc đặc trưng cho Samonella xuất môi trường phân lập Bước dựa việc sử dụng thử nghiệm sinh hóa thử nghiệm huyết đặc trưng cho Salmonella Thử nghiệm sinh H2S mơi trường TSI (+) • Cấy ria bề mặt nghiêngỐng thạch cấy đâm sâu xuống 1: mơi trường TSI khơng có VSV Ống 2: xuất đáy màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose tốt) Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí Ống 4: màu đỏ phần thạch nghiêng, màu vàng đáy chứng tỏ VSV lên men glucose Ống 5: màu đen xuất chứng tỏ có q trình khử lưu huỳnh sinh H2S Được thực môi trường urea lỏng , chứa thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu pH 6.8-8.4) Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc chủng vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn vi khuẩn ủ 37 C 48 Salmonella không phân giải urea thành NH3 nên không làm thay đổi pH môi trường; sau nuôi cấy môi trường giữ nguyên màu vàng cam Thử nghiệm urea (-) Môi trường sử dụng môi trường lỏng Clark-Lubs (mơi trường MR-VP), pH 6.9 Dùng que cấy vịng cấy vào ống mơi trường MR-VP sinh khối từ khuẩn lạc chủng ủ 18-24 môi trường KIA Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Đọc kết sau 20 phút chậm Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có tượng khơng đổi màu bề mặt mơi trường Thử nghiệm VP(-) Lên men LDC (+) Salmonella có phản ứng lysine decarbonxylase dương tính nên sau ni cấy, mơi trường giữ ngun màu tím Thử nghiệm khả sinh indol (-) Cấy khuẩn lạc nghi ngờ ống chứa 5ml môi trường tryptone water Salmonella không sinh indol nên xuất màu vàng ống nghiệm Thử nghiệm ONPG Cho que cấy vòng đầy khuẩn lạc nghi ngờ môi trường vô trùng có chứa 0,25ml dung dịch nước muối sinh lý Thêm giọt toluen lắc ống Salmonella khơng có khả lên men đường lactose nên cho kết âm tính QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Thử nghiệm Mơi trường Biểu đặc trưng H2S(+) TSI Phần nghiêng đỏ sâu vàng, nứt thạch xuất vạch đen LDC(+) LDC Không đổi màu Urea(-) Urea Không đổi màu ONPG(-) ONPG Khơng đổi màu Indol(-) Tryptone Khơng xuất vịng đỏ nhỏ thuốc thử Kovac’s VP(-) VP Không đổi màu nhỏ α-napthol 5% KOH 40% Kiểm tra phản ứng kháng huyết Mục đích: Khẳng định Salmonella phân lập  Kiểm tra tự kết dính chủng: Cho giọt dung dịch nước muối sinh lý lên phiến kính Dàn khuẩn lạc cần thử giọt dung dịch cho thu thể huyền phù đồng Lắc nhẹ phiến kính 30-60s Nếu vi khuẩn vón lại chuẩn tự kết dính Salmonella có loại kháng nguyên: Kháng nguyên O(kháng nguyên thân): bền với nhiệt, dùng để chia thành nhóm Kháng nguyên H(kháng nguyên tiên mao): không bền với nhiệt dùng để định loại, có chất protein Kháng ngun Vi: khơng bền với nhiệt thường che lấp ngăn chặn kháng nguyên O Nhỏ giọt anti-O H lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy sinh khối từ môi trường để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30-60s Quan sát phản ứng dương tính xảy tượng ngưng kết Giải thích kết phép thử khẳng dịnh Phản ứng sinh hoá Tự ngưng kết Phản ứng huyết Giải thích Điển hình Khơng Kháng ngun O, Vi H Các chủng coi dương tính Salmonella Điển hình Khơng Tất phản ứng âm tính Điển hình Có Khơng thử nghiệm Phản ứng khơng điển hình Khơng/ Có Phản ứng khơng điển hình Khơng/ Có Có thể Salmonella Kháng nguyên O, Vi H dương tính Tất phản ứng âm tính Khơng coi Salmonella ... (HE) Tryptone soy agar (TSA) Phục hồi   Phương pháp thực *Quy trình định tính BƯỚC 1: TIỀN TĂNG SINH Đây khâu quan trọng khơng thể thiếu quy trình kiểm nghiệm Là sử dụng môi trường tăng sinh không... Thêm giọt toluen lắc ống Salmonella khơng có khả lên men đường lactose nên cho kết âm tính QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA Thử nghiệm Môi trường Biểu đặc trưng H2S(+) TSI Phần nghiêng đỏ sâu vàng,... phản ứng âm tính Điển hình Có Khơng thử nghiệm Phản ứng khơng điển hình Khơng/ Có Phản ứng khơng điển hình Khơng/ Có Có thể Salmonella Kháng nguyên O, Vi H dương tính Tất phản ứng âm tính Khơng