quy trình định tính salmonella
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm BỘ CƠNG THƯƠNGNhóm TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Đề tài: Quy trình định tính Salmonella GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Thực nhóm Lớp Thứ 3, Buổi chiều, Tiết 7-8 Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 04 năm 2016 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm DANH SÁCH NHĨM VÀ BẢN PHÂN CƠNG VIỆC NHĨM MỤC LỤC Trang GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Nhóm Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT TPCN: Thực phẩm chức GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm LỜI MỞ ĐẦU Những năm gần vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm tâm điểm phương tiện truyền thơng đại chúng Ngày có nhiều vụ ngộ độc thực, vấn đề ngộ độc thực phẩm tình trạng vệ sinh an tồn thực phẩm sở chế biến có xu hướng ngày gia tăng Các báo cáo cho thấy phần lớn chúng vi sinh vật gây nên Có nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ Clostridium butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes Trong đó, Salmonella loài vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết nhiều bệnh nghiêm trọng khác Hiện có khoảng 4% người thường mang mầm bệnh Tất tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm điều khơng cho phép có Salmonella thành phẩm Sự diện chúng kiểm tra gắt gao quan chức Để kiểm soát chúng, quan nhà nước đưa quy trình phát Salmonella quy định văn cụ thể Nhằm giới thiệu quy trình trên, chúng tơi thực đề tài: “Quy trình trình định tính Salmonella” Chúng tơi hy vọng qua đề tài lần cung cấp thêm cho bạn số kiến thức Salmonella, phương pháp dùng để phát Salnonella trình phát Salmonella Trong q trình thực đề tài khơng tránh khỏi số sai sót, mong đóng góp để giúp nhóm hồn thiện đề Nhóm Trang GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm TỔNG QUAN VỀ SALMONELLA 1.1 Lịch sử phát Năm 1885 Slamon Smith (Mỹ) tìm Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả gọi tên Bacỉlus cholerasuỉs, gọi Salmonella Nhưng sau Schweinittz Dorset 1903 chứng minh bệnh dịch tả loại vi rút gây nên xác định S.choleraesuis vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn Năm 1888 A.Gartner phân lập mầm bệnh từ thịt bò lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn Bacillus enteritidis ngày vi khuẩn gọi GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm S.enterỉtỉdỉs Vi khuẩn gọi nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner Năm 1889 Klein phân lập S.gallinarum Rettger phân lập S.pullorum năm 1909 Trước người ta cho ràng hai loại vi khuẩn gây hai bệnh khác lên gọi chung bệnh phó thương hàn gà Typhus avium) bệnh có tên chung S.gallinarum - pullorum Năm l896 C.Archard Rbensauded phân lập vi khuẩn Sparatyphi equi Sparatyphi bacilus Ngày vi khuẩn gọi tên Sparatyphi B đến năm 1898, Sparatyphi A tìm N.Guyn H Keyser 1.2 Phân loại Về phân loại khoa học, Salmonella xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Bộ: proteobacteria Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Loài: Salmonella bongori Salmonella enterica Hiện theo phân loại hệ thống Viện Pasteur thê giới, Trung tâm Kiêm soát ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ CDC (Control and Prevent Disease Center), giống Salmonella chia làm hai loài: S enterica S bongori Trong S bongori gồm tất kiểu huyết (serotype) cua loài phụ số V, S enterica chia làm loài phụ đánh số: I, II IIIa, IIIb, IV VI Các loài loài phụ phân biệt phan ứng sinh hóa Trong mồi lồi phụ có nhiều kiểu huyết Cho đến xác định 2463 kiểu huyết thuộc giống Salmonella Theo hệ thống Kauffman White, kiểu huyết chia dựa kháng nguyên thân O, kháng nguyên tiêm mao H kháng nguyên bề mặt Vi Phần lớn kiểu huyết đặt tên theo công thức kháng nguyên, số khác Trang GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm đặt tên riêng Enteritidis (S enteritidis), Typhi (S typhi), Paraphi ( S paraphi), Typhimurim ( S.typhimurium)… Loài phụ enterica chiếm đa (99%), tìm hầu hết động vật nóng S hầu số thấy máu Lồi phụ chiếm 59% (1454/2463) tổng số kiểu huyết Salmonella có khả xâm nhập gây nhiễm cao cho người động vật máu nóng, lồi phụ khác động vật máu lạnh mơi trường Như có tới 41% (1009/2463) số kiểu huyết không phân lậpp từ bệnh phẩm người, tỉ lệ có ý nghĩa để quan chức xem xét sửa đổi tiêu chuẩn hành thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho nhà sản xuất tiêu thụ thực phẩm 1.3 Các loài điển hình Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella typhi Salmonella paratyphi: Gây bệnh phó thương hàn GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Salmonella cholera_suis: Gây bệnh nhiễm trùng máu Hình 1.2 Vi khuấn Salomonella cholera _suis Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa Hình 1.3 Vi khuẩn Salmonella entertidis Một số chủng Salmonella khác: s thompson, s derbv, s newport, s kissangani, s sen/lenberg, s meleagnidis, s anatum, s aberdeeh, s panama, s montevideo, s dubỉin, s london, s anatum, s minnesota, s gaỉỉỉnarum Một số bệnh thường gặp động vật Salmonella gây ra: phó thương hàn bò lợn, bệnh sảy thai cừu ngựa, bệnh bạch lỵ gà, bệnh thương hàn chuột, bệnh viêm phổi bò 1.4 Đặc điểm Salmonella 1.4.1 Đặc điểm hình thái Salmonella trực khuẩn gram (-), hình que, kích thước trung bình từ – x 0.5 – 1µm, hiếu khí kị khí tùy nghi, có tiên mao, di động (trừ S.gallinarum S.pullorum), khơng tạo bào tử, sinh acid từ glucose mantinol không len mên saccharose, không sinh indol không phân giải urê Hầu hết chủng dinh H 2S (trừ S.typhi), chúng phát triển tốt nhiệt độ 6°C - 42°C, thích hợp 35°C - 37°C, pH từ - thích hợp pH = 7,2 Ở nhiệt độ từ 18°C - 40°C sống đến 15 ngày Trang GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Salmonella vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn phát triển sau 24 Có thể mọc mơi trường có chất ức chế chọn lọc DCA (deoxycholate citrate agar) XLD (xylose lysine deoxycholate), mơi trường XLD chất ức chế nên thường dùng để phân lập Salmonella Khẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường tròn, lồi, suốt, có tâm đen, tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ 1.4.2 Đặc điểm hóa sinh Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose hầu hết chúng sinh H2S, sinh Thường không lên men sucrose, salicin inositol, sử dụng citrate môn trường Simmons Tuy nhiên lồi Salmonella có tính chất trên, ngoại lệ xác định s.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate môi trường Simmon, hầu hết chùng s.paratyphi S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella số chủng Salmonella khác 1.4.3 Cấu trúc Salmonella có ba loại kháng nguyên chất xuất thể tạo kích thích đáp ứng miễn dịch kết hợp đặc hiệu với sản phẩm kích thích gồm: kháng ngun thân O, kháng nguyên lông H kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S.typhi có kháng nguyên V (Virulence) yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên tế bào bạch cầu Hình 1.4 Các kháng nguyên bề mặt Salmonella GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O) Thành phân vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm lớp Trong lớp peptidoglycan mỏng, cách lớp khơng gian chu chất tới lớp màng ngồi (outer membrane) phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein lipopolysaccharide Bao bên lớp peptidoglycan lớp phospholipid A B (quyết định độc tố Nội độc tố), sau hai lớp polysaccharide khơng mang tính đặc hiệu Kháng nguyên nội độc tố có chất hóa học lypopolysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu kháng nguyên O LPS một, tính miễn dịch khác nhau: kháng ngun O ngồi LPS bao gồm lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch mạnh LPS Màng ngồi có cấu trúc gần giống tế bào chất phospholipid gặp lớp trong, lớp ngồi lipopolysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm thành phần: Lipid A, Polysaccharide lõi, Kháng ngun O Màng ngồi có thêm protein: Protein chất: protein vi khuẩn gọi protein lỗ xuyên màng với chức cho phép số loại phân tử qua chúng dipeptide, disaccharide, ion vơ Protein màng ngồi: chức vận chuyển số phân tử riêng biệt đưa qua màng ngồi Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên với lớp màng Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K – kháng nguyên Vi) Bản chất hóa học vỏ vi khuẩn polypeptid polysaccharide Vỏ vi khuẩn gây miễn dịch không mạnh gắn với tế bào vi khuẩn vỏ gây miễn dịch Kháng nguyên vỏ dùng để phân loại chủng Salmonella Kháng nguyên K: Không phức lạp, có kháng nguyên vỏ kháng nguyên Vi có Ivpe huyết s.typhi s.paratyphi Kháng nguyên Vi - angtigen Felix cộng phát năm 1935 Kháng nguyên Vi gây tượng ngưng kết chậm xuất hạt vỏ, kháng nguyên Vi kháng nguyênn vỏ bao bọc bên ngồi kháng ngun o, khánh ngun Vi khơng tham gia vào trình gây bệnh Trang 10 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm l Nhóm Dung dịch lục sáng Lục sáng Nước 31 Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Bột cao nấm men Natri clorua (NaCI) Xyloza Lactoza Sucroza L-Lyzin hydroclorua Natri thiosulfat Sắt (III) amoni xitrat Phenol đỏ Natri deoxycholat Thạch Nước 32 Tryptone Soy Agar (TSA) Trypticase peptone Phytone peptone NaCI Agar Nước cất Trang 32 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm 33 Lysine Decacboxylase broth (LDC) L-Lystin monohydroclorua Cao men Glucoza Bromocresol tía Nước 34 Voges-Proskauer (VP) Pepton Glucoza Dinatri hydro phosphat (K2HPO4) Nước 35 Ure Broth a Môi trường Pepton Glucoza Natri clorua Kali dihydrooctophosphat (KH2PO4) Đỏ phenol Thạch Nước m Dung dịch urê Urê Nước 36 Trypton Water Tryptone trypicase GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang 33 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Nước cất 37 Kligler Iron Agar (KIA) / TSI Cao thịt Cao men Pepton Natri clorua Lactoza Sucroza Glucoza Sắt (II) xitrat Natri thiosunfat Đỏ phenol Thạch Nước 38 Thuốc thử để phát -galactosidaza a n Toluen Dung dịch đệm Natri dihydro phosphat (NaH2PO4) Dung dịch natri hydroxit 10 mol/l Nước o Dung dịch ONPG o-Nitrophenyl ß-D-galactopyranosid (ONPG) Nước Trang 34 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm 3.4 Quy trình phân tích Báo cáo kết Khơng phát Salmonella 25g/25ml Khô GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang 35 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Ủ (37±1)oC/(24±3)h 3.5 Các bước Âm tính 3.5.1 Chuẩn bị tiến hành mẫu Để chuẩn bị dung dịch ban đầu, cho 25 g mẫu thử vào 225 ml mơi trường tiền tăng sinh, tỷ lệ mẫu thử với môi trường tiền tăng sinh quy định phương pháp Nếu phần mẫu thử khác với 25 g, sử dụng lượng mơi trường tiền tăng sinh cần thiết để tạo độ pha lỗng 1/10 (khối lượng/thể tích) 39 Sữa ngun liệu, sữa xử lý nhiệt sản phẩm sữa dạng lỏng Dùng pipet lấy 25 ml mẫu thử cho vào bình tam giác chứa 225 ml mơi trường tiền tăng sinh lắc 40 Sản phẩm sữa khô Chuẩn bị bình có nắp đậy chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh Cân 25 g mẫu thử cách vô trùng đổ lên bề mặt chất lỏng đựng bình Đậy nắp bình, khơng lắc Để yên nhiệt độ phòng 60 phút ± 10 phút trước đem nuôi ấm Không cần chỉnh pH Nếu sau ủ ấm mà sữa bột chưa tan, dung tay để lắc bình để trộn lượng chứa bình khuấy dao trộn vô trùng 41 Lactoza Cân 25 g mẫu thử cách vơ trùng cho vào bình có nắp đậy chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh lắc tan 42 Casein, caseinat phomat Cân 25 g mẫu thử cách vô trùng cho vào cốc đựng vô trùng máy trộn tốc độ cao loại nhu động Thêm 225 ml môi trường tiền tăng sinh nhiệt độ 45 °C Trộn mẫu thử phân tán (từ phút đến phút) Giữ nhiệt độ không 45 °C Trang 36 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 43 Nhóm Bơ Lắc mẫu thử làm tan chảy Dùng pipet để chuyển 25 ml phần mẫu thử ủ trước đến khoản 45 °C, cho vào bình tam giác chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh lắc 44 Sản phẩm sữa đông lạnh (kể kem thực phẩm) Dùng pipet để chuyển 25 ml mẫu thử làm tan chảy ủ trước đến khoảng 37 ºC, cho vào bình chứa 225 ml mơi trường tiền tăng sinh lắc 45 Sữa lên men, sữa chua, bánh kem tráng miệng Cân 25 g mẫu thử cách vơ trùng cho vào bình có nắp đậy chứa viên bi thủy tinh 225 ml môi trường tiền tăng sinh lắc cho tan Để đơn giản việc kiểm tra, mẫu kiểm tra gồm nhiều phần mẫu thử 25 g lấy từ lô hàng sữa sản phẩm sữa qui định cần kiểm tra, chứng minh việc tạo thành mẫu chung (gộp chung phần mẫu thử) không làm ảnh hưởng đến kết sữa sản phẩm sữa gộp lại thành phần mẫu thử Ví dụ, kiểm tra 10 mẫu thử, mẫu 25 g kết hợp 10 mẫu với để tạo thành mẫu thử chung 250 g đem hòa tan khuếch tán 2,25 lít mơi trường tiền tăng sinh Hoặc cách khác, phần 0,1 ml môi trường tiền tăng sinh (môi trường RVS) 10 ml môi trường tiền tăng sinh (selenit/xystin) từ 10 phần riêng rẽ kết hợp lại đem tăng sinh tương ứng 0,1 lít lít mơi trường chọn lọc.Kiểm tra pH huyền phù chỉnh đến 6,8 ± 0,1 cần, trừ có qui định khác 3.5.2 Tiền tăng sinh (Tăng sinh sơ bộ) Mẫu tiền tăng sinh môi trường tăng sinh không chọn ọc (BPW) ủ 37 C ±30C khoảng 16h-20h 3.5.3 Tăng sinh chọn lọc Cho 0,1 ml dịch cấy thu vào ống cấy có chứa 10 ml môi trường RVS Chuyển 10 ml dịch cấy thu vào bình tam giác có chứa 100 ml mơi trường selenit/xystin GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang 37 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Ủ môi trường RVS cấy nồi cách thủy tủ ấm đặt 41,5 ºC 18 đến 24 Ủ môi trường selenit/xystin cấy tủ ấm đặt 37 ºC 18 đến 24 Hình 3.1 Salmonella mơi trường selenit/xystin Bước 3: Phân lập Hình 3.2 Salmonella mơi trường XLD BPLS Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ canh thang tăng sinh chọn lọc RVS selenit/xystin lên đĩa thạch chứa môi trường chọn lọc XLD BPLS Sau cấy, lật ngược đĩa cho đáy hướng lên ủ 370C khoảng 20h ± 24h Sau ủ 20h ± 24h kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình mà nghi ngờ Salmonella Trên mơi trường XLD khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hồng suốt, có khơng có tâm màu đen Trên thạch lục sáng/đỏ phenol, khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hồng với vùng mơi trường bao quanh đỏ tươi Đánh dấu vị trí khuẩn lạc đáy đĩa Sau ủ ấm tiếp môi trường RVS môi trường selenit/xystin 18 đến 24 giờ, lặp lại việc cấy qui trình ủ ấm.Sau lần ủ ấm (9.4.3 9.4.4)kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc Salmonella điển hình Nếu khuẩn lạc mọc yếu khơng có mặt khuẩn lạc Salmonella điển hình ủ ấm lại đĩa thêm 18 đến 24 tủ ấm đặt 37 ºC kiểm tra lại đĩa có mặt khuẩn lạc Salmonella điển hình Trang 38 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm 3.5.4 Phục hồi môi trường dinh dưỡng NA / TSA Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ từ đĩa môi trường phân lập XLD BPLS Nếu đĩa có khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ cấy ria lên NA / TSA Ủ 370C ± 10C khoảng 24h ± 3h Hình 3.3 Salmonella môi trường TSA Trường hợp 1: từ đĩa thử khuẩn lạc đặc trưng, cho kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận phát Salmonella mẫu Trường hợp 2: khuẩn lạc cho kết thử nghiệm sinh hóa khơng phù hợp tiến hành thử khuẩn lạc lại đánh dấu, bốn khuẩn lạc cho kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận phát Salmonella mẫu ngược lại kết luận khơng phát Salmonella mẫu 3.5.5 Khẳng định sinh hóa kháng huyết Từ khuẩn lạc chọn cấy ria lên NA / TSA,dùng que cấy cấy vào môi trường sau: 46 Thạch TSI Nguyên tắc: xác định khả sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết hợp với môi trường tăng trưởng bản, có khơng có sinh hydrogen sulfide (H 2S) Cách lấy mẫu: cấy ria bề mặt nghiêng thạch cấy đâm sâu xuống đáy ủ 370C ± 10C khoảng 24h ± 3h Diễn giải thay đổi môi trường sau: Cấy đâm sâu GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang 39 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Màu vàng glucose dương tính (sử dụng glucose) Màu đỏ khơng đổi màu glucose âm tính (không sử dụng glucose) Màu đen sinh hydro sunfua Bọt vết rạn sinh khí từ glucose Cấy bề mặt nghiêng thạch Màu vàng lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặc sucrose) Màu đỏ khơng đổi màu lactose sucrose âm tính (không sử dụng lactose không sử dụng sucrose) Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể tính kiềm (màu đỏ) bề mặt nghiêng thạch cấy đâm sâu mang tính acid (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) với khoảng 90% trường hợp sinh hydrosunfua (thạch bị đen) Khi Salmonella có lactoza dương tính phân lập, mặt nghiêng thạch TSI có màu vàng Do đó, việc khẳng định sơ Salmonella không dựa vào kết thử thạch TSI Hình 3.4 Salmonella phản ứng dương tính với TSI 47 Thạch Ure Nguyên tắc: sử dụng để phát khả phân cắt ure thành ammoniac hoạt tính enzyme urease từ vi sinh vật kết mội trường bị kiềm hóa NH3 tạo Cách cấy mẫu: cấy cấy ria bề mặt nghiêng thạch Ủ 37 ± 1oC 24±3h Nếu phản ứng dương tính, việc phân giải urê giải phóng amoniac, làm đổi màu phenol đỏ sang màu hoa hồng sau di chuyển sang màu đỏ tím Phản ứng thường xảy sau đến Trang 40 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Hình 3.5 Thử nghiệm Salmonella môi trường thạch Ure 48 Lysine decarboxylase Nguyên tắc: sử dụng để phát vi khuẩn sinh enzyme decarboxylase, enzyme tuơng tác với amino acid có gốc carboxyl (-COOH) cuối, tạo thành amine hay diamine carbon dioxide (CO2) Cách cấy mẫu: cấy phía bề mặt mơi trường lỏng, phủ lớp paraffin hay dầu khoáng lên bề mặt môi trường Ủ 37 ± 1oC 24±3h Salmonella có phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau nuôi cấy, môi trường giữ nguyên màu tím Phản ứng âm tính mơi trường có màu vàng Hình 3.6 Salmonella dương tính mơi trường LDC Control Escherichia coli ATCC 25922 Serratia marcescens ATCC 8100 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang 41 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 49 Nhóm Salmonella Typhimurium ATCC 14028 Salmonella Enteritidis ATCC 13076 Phát β-galactosidase Nguyên tắc: xác định khả lên men lactose vi sinh vật Cách cấy mẫu: cho vòng đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vơ trùng có chứa 0,25ml dung dịch muối sinh lý Thêm giọt toluen lắc ống Đặt ống vào nồi cách thủy 37 oC để vài phút( khoảng phút ) Thêm 0,25ml thuốc thử để phát β-galactosidase lắc Đặt lại ống nồi cách thủy để 37oC để 24±3h, kiểm tra ống thường xuyên Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính Phản ứng thường xuất sau 20 phút Nếu sử dụng đĩa giấy bán sẵn, theo dẫn nhà sản xuất Hình 3.7 So sánh Salmonella citrobacter phản ứng ONPG 50 Môi trường phản ứng Indol Nguyên tắc: phát khả oxy hóa tryptophan thành dạng indol: indol, skatol (methyl indol ) indol acetate Trang 42 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm Cách cấy mẫu: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường tryptone water Ủ 37 ± 1oC 24±3h Sau ủ, thêm 1ml thuốc thử kovac’s, phản ứng dương tính bề mặt mơi trường xuất vòng màu đỏ chứng tỏ chứng tỏ phản ứng dương tính, xuất màu khác phản ứng âm tính Hình 3.8 Thử nghiệm Indole 51 Voges-Proskauer Ngun tắc: xác định khả sinh acetylmethylcarbinol(acetoin) trình lên men glucose số vi sinh vật Cách cấy mẫu: cho vòng đầy khuẩn lạc ngi ngờ vào ống vơ trùng có chứa 3ml mơi trường VP Ủ 37 ± 1oC 24±3h sau ủ, thêm giọt dung dịch creatine, giọt dung dịch α-naphthol sau thêm giọt dung dịch kali hydroxide (KOH), lắc sau lần thêm loại thuốc thử Khi xuất màu hồng đến màu đỏ sáng 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính, phản ứng âm tính dịch vi khuẩn không đổi màu Cần tuân thủ nghiêm ngặt trật tự Nếu, ví dụ: cho kali hydroxit vào trước dung dịch 1-naphtol cồn pepton có mặt, kết cho dung dịch có màu hồng nhạt mà che khuất phản ứng dương tính Hình 3.8 Phản ứng VP GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Trang 43 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm 52 Nhóm Thử phản ứng kháng huyết Việc phát có mặt kháng nguyên Salmonella O-, Vi- H- tiến hành phản ứng ngưng kết phiến kính huyết thích hợp với khuẩn lạc khiết (9.5.2) sau loại trừ chủng tự ngưng kết (9.5.5.2) a Loại trừ chủng tự ngưng kết Cho giọt dung dịch muối lên phiến kích rửa cẩn thận Dàn khuẩn lạc cần thử nghiệm giọt dung dịch cho thu thể huyền phù đục đồng Lắc nhẹ phiến kính 30 giây đến 60 giây Quan sát kết đen, tốt nên dùng kính lúp Nếu vi khuẩn vón lại thành đơn vị nhiều có ngưng kết chủng coi tự ngưng kết, không cần thử phản ứng huyết Nếu khơng có vón cục vi khuẩn rời nhau, chủng xem khơng tự ngưng kết, cần phải tiếp tục thử phản ứng huyết p Kiểm tra kháng nguyên O,H, Vi Nhỏ giọt anti-O H lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn từ mơi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30-60 giây, quan sát đen Phản ứng dương tính có tượng ngưng kết xảy Đơi cần quan sát tượng ngưng kết kính lúp hay kính hiển vi với độ phóng đại thấp Ngược lại, vi khuẩn phân bố huyết thanh,làm cho giọt dung dịch đục xem kết âm tính Mẫu kết luận dương tính với Salmonella có khuẩn lạc đặc trưng môi trường phân lập cho kết sinh hóa sau:TSI/KIA: đỏ/vàng, có/khơng có H2S sinh hơi; Ure (-); Indol(-); VP(-); ONPG(-); LDC(+) 3.6 Kết Phát hiện(hay không phát hiện) Salmonella 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng 3.6.1 Giải thích từ thử nghiệm sinh hố Bảng 3.1 Giải thích kết Phép thử khẳng định Trang 44 Phản ứng âm tính dương tính Phần trăm chủng Salmonella cho thấy có phản ứng GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Nhóm TSI glucoza (sinh axit) + 100 TSI glucoza (sinh khí) + 91,9 TSI lactoza - 99,2 a TSI sucroza - 99,5 TSI nidro sunfua + 91,6 Phân giải urê - 100 L-Lyxin decacboxyl + 94,6 Phản ứng β-galactoxidaza - 98,5 Phản ứng Voges – Proskauer - 100 Phản ứng indol - 98,9 a Các Salmonella enterical sub sp, arizonae diarizonae cho phản ứng lactoza dương tính âm tính ln ln cho phản ứng β-galactosidaza dương tính Các Salmonella nhóm II cho cho phản ứng lactoza âm tính cho phản ứng β-galactosidaza dương tính 3.6.2 Giải thích từ phản ứng sinh hoá huyết Bảng 3.2 Giải thích từ phép thử khẳng định Các phản ứng sinh hoá Tự ngưng kết Các phản ứng huyết Phản ứng điển hình Khơng Kháng ngun O-, Vi- Các chủng coi H- dương tính Salmonella Phản ứng điển hình Khơng Tất phản ứng âm tính Có thể Salmonella Phản ứng điển hình Có Khơng thử Có thể Salmonella Phản ứng khơng điển hình Khơng Kháng ngun O-, Vihoặc H- dương tính Có thể Salmonella Phản ứng khơng điển Khơng Tất phản ứng âm Không coi GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh Giải thích Trang 45 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm hình Nhóm tính Salmonella TÀI LIỆU KHAM KHẢO Trang 46 GVHD : Nguyễn Thị Kim Oanh ... tài: Quy trình trình định tính Salmonella Chúng tơi hy vọng qua đề tài lần cung cấp thêm cho bạn số kiến thức Salmonella, phương pháp dùng để phát Salnonella trình phát Salmonella Trong q trình. .. cho phép có Salmonella thành phẩm Sự diện chúng kiểm tra gắt gao quan chức Để kiểm soát chúng, quan nhà nước đưa quy trình phát Salmonella quy định văn cụ thể Nhằm giới thiệu quy trình trên,... Nguyên lý PCR RT-PCR CHƯƠNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA 3.1 Phạm vi áp dụng Quy trình tham chiếu theo TCVN 6402:2007 dùng để phát Salmonella sữa sản phẩm từ sữa