Quy trình định tính salmonella

• Có thể mọc trên các môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA và XLD.• Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen,.... QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM

ĐOÀN NGỌC TÂM THIỆN NGUYỄN THỊ ÁI LY

PHAN THỊ KIM NGÂN NGUYỄN TIẾN PHƯỚC

VI KHUẨN

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH

TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC DO SALMONELLA

 Trên thế giới, mỗi năm nhiễm khuẩn salmonella từ thực phẩm xảy

ra ở 1.4 triệu người với 95% các trường hợp có triệu chứng ngộ độc

 Các nguồn gốc chung của ngộ độc thực phẩm salmonella là các thực phẩm sống hoặc chưa nấu chín như trứng sống, trứng húp, sữa chưa được tiệt trùng, nước chưa được đun sôi kỹ, các sản

phẩm từ thịt và từ gia cầm chưa chín kỹ

Salmonella

xâm nhập vào

cơ thể????

• Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín.

• Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa

bảo quản không tốt)

• Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm

cao.

• Khi tiếp xúc với người bị nhiễm salmonella hoặc

phân người và súc vật có nhiễm salmonella.

• Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”

• Bất cứ thực phẩm sống hay chưa nấu chín.

• Sản phẩm từ gia cầm( kể cả các sản phẩm bơ sữa

bảo quản không tốt)

• Thịt gà và trứng: thực phẩm có nguy cơ nhiễm

cao.

• Khi tiếp xúc với người bị nhiễm salmonella hoặc

phân người và súc vật có nhiễm salmonella.

• Có thể bị “nhiễm khuẩn chéo”

TRIỆU

CHỨNG

 Tiêu chảy, đau bụng, buồn ói và ói, sốt, đau đầu,

…

 Thường xảy ra khoảng 12-36h sau khi ăn

 Các triệu chứng có thể kéo dài từ 2 ngày đến 1 tuần

TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC DO SALMONELLA

Biện pháp ngăn chặn nhiễm khuẩn do Salmonella:

•Hạn chế ăn trứng sống và chưa nấu chín Hạn chế hoặc

tránh món ăn có chứa trứng sống

•Luộc chín kỹ thịt gà (tới khi thịt không còn đỏ hoặc

màu hồng).Tách biệt giữa thực phẩm nấu chín và chưa nấu

•Sau khi chế biến những món sống làm sạch các dụng

cụ chế biến, bếp… bằng xà bông và nước hoặc dung dịch tẩy rửa

VI KHUẨN

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH

• Có thể mọc trên các môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA và XLD.

• Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường

là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen,

không phân giải ure,…

3

Có thể tiết ra 2 loại độc tố:

•Ngoại độc tố

•Nội độc tố

ĐẶC ĐIỂM SALMONELLA

VI KHUẨN

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Salmonella có thể được phát hiện bằng quy trình gồm 4 bước

 Nước peptone đệm (Buffered Peptone Water, BPW).

 Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RV).

 Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV cải tiến).

 Tetrethionate Muller-Kauffmann( TT).

 Thạch Xylose Lysine Desoxycholate ( XLD ).

 Thạch Hektoen Entric Agar ( HE ).

 Thạch Bismuth Sulphite Agar ( BS ).

 Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose ( BPLS ).

 Thạch Triple Sugar Iron ( TSI ).

 Canh Urea.

 Canh Lysine Decarboxylase.

 Canh Ornithine Decarboxylase.

 Canh Mannitol ( Phenol Red Broth Base).

 Canh Sucrose (Phenol Red Broth Base).

 Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base).

 Canh Tryptone.

 Thuốc thử Kovac’s.

 Kháng huyết thanh Salmonella đa giá.

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

MÔI TRƯỜNG-HÓA

Canh RV, RV cải tiến, TT Tăng sinh chọn lọc

XLD, HE, BS, BPLS Phân lập, nhận diện Sal

TSI, canh urea, canh

tryptone,… Khẳng định lại sự hiện diện của Sal trong mẫu

Thuốc thử:

Thuốc thử kovac

Thuốc thử methyl red

Phenol red

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Đồng nhất 25g mẫu trong

225ml môi trường tăng sinh

BPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ

Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang

môi trường tăng sinh chọn lọc

TSA, ủ qua đêm

Thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm ngưng kết kháng

huyết thanhKết luận

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

BƯỚC 1: TĂNG SINH

 Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm

 Là môi trường tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế

 Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu, chọn quy trình tăng sinh phù hợp

 Tỷ lệ thông thường giữa mẫu và môi trường là 1:9, trong nhiều trường hợp có thể thay đổi

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

BƯỚC 1: TĂNG SINH

Tên môi trường Thành phần

BPW

Pepton 10g NaCl 5g

Na2HPO4 3,5g

KH2PO4 1,5g

Ngoài ra còn có thể sử dụng một số môi trường:

-Môi trường dịch thể Tryptic soy broth(TSB)

-Môi trường dịch thể lactose

10ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm đến độ 42

Ủ ở 42 ± 0,20C trong 18-24h

BƯỚC 2: TĂNG SINH

CHỌN LỌC

Canh RV ức chế vi khuẩn khác nhờ MgCl2 bằng cách tác động lên

tế bào vi khuẩn và nhờ màu xanh Malachite ức chế các vi khuẩn Gr(+)

• Mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ khác nhau

để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella cần dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu

• Mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của Salmonella

• Mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ khác nhau

để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella cần dùng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu

Môi trường XLD: khuẩn lạc có

màu hồng trong suốt, có hay không

có tâm đen Một số dòng

Salmonella có thể có tâm đen bóng

rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn

lạc

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Môi trường Thành phần môi trường

XLD

(Xylose Lysine Desoxycholate)

Cao nấm men: 3gL-lysine: 5g

Xylose: 3.75gLactose: 7.5gSucrose: 7.5gSodium deoxycholate: 2.5g

Ferric ammonium citrate: 0.8g

Sodium thiosulfate: 6.8gNaCl: 5g

Agar:15g

Phenol red: 0.08g

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

BƯỚC 3: PHÂN LẬP

VÀ NHẬN DIỆN

Môi trường HE: khuẩn lạc có màu

thay đổi từ xanh dương đến màu

xanh lục, có hay không có tâm đen

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

HE(Hektoen Entric Agar)

Proteose Peptone: 12.0gYeast Extract: 3.0g

Bile Salts No 3: 9.0gLactose: 12.0g

Saccharose: 12.0gSalicin: 2.0g

sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:

Thử nghiệm sinh H2S trên môi

trường KIA

Hình 15: thử nghiệm KIA Ống 1: môi trường KIA không có VSV Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt) Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men glucose Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử lưu huỳnh

và sinh H2S.

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Thử nghiệm urea được thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa

chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang

đỏ (vùng chuyển màu là pH 6.8-8.4) Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều

vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48 giờ

Salmonella không phân giải urea thành NH3 nên không làm thay đổi pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng cam

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Thử nghiệm VP(-)

môi trường được sử dụng là môi trường

lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH

6.9 Dùng que cấy vòng cấy vào các ống

môi trường MR-VP một ít sinh khối từ

khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ

trên môi trường KIA Sau thời gian ủ, bổ

sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi

trường Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm

nhất 4 giờ Salmonella cho phản ứng âm

tính với thử nghiệm VP có hiện tượng

không đổi màu trên bề mặt môi trường Thử

nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt

môi trường

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Lên men mannitol

(+)

Salmonella có khả năng lên men

đường mannitol sinh acid Khi

có mặt thuốc thử Phenol Red sẽ

làm môi trường chuyển từ đỏ

sang vàng

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Lên men LDC (+)

Sau khi nuôi cấy môi

trường chuyển thành kiềm,

màu môi trường được

chuyển thành màu như ban

đầu.

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Thử nghiệm khả

năng sinh indol (-) • Môi trường thử nghiệm là

nước tryptone, trong thành phần có chứa tryptophan

• Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc thử

Kovac’s Quan sát sau vài phút

- Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng

H2S(+) TSI/KIA Phần nghiêng đỏ sâu vàng,

nứt thạch và xuất hiện vạch

đen

Mannitol,

sorbitol(+) Mannitol, sorbitol Bị acid hóa, môi trường chuyển sang màu vàng

Indol(-) Tryptone Không xuất hiện vòng đỏ

khi nhỏ thuốc thử Kovac’s

α-napthol 5% và KOH 40%

QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

giúp kết luận có hay không có sự hiện

diện của Salmonella trong mẫu.

Để khẳng định được tên chủng phân lập được cần gửi chúng đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh

vật

Salmonella chứa dòng bệnh rất nguy

hiểm nên cần các biện pháp an toàn khi

làm việc

Sal có 3 loại kháng nguyên:

- Kháng nguyên O(kháng nguyên thân): bền với nhiệt, được dùng để chia thành nhóm.

-Kháng nguyên H(kháng nguyên tiên mao): không bền

với nhiệt dùng để định loại, có bản chất là protein

-kháng nguyên Vi: không bền với nhiệt thường che lấp

ngăn chặn kháng nguyên O.