Thiết lập quy trình định tính và định lượng những vi sinh vật gây bệnh đường ruột chính trên người trong thực phẩm bằng real time pcr

Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ THỊ CHI Thiết lập quy trình định tính định lượng vi sinh vật gây bệnh đường ruột người real time-PCR Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2009 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh VÀ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TSKH NGUYỄN QUỐC BÌNH - Cán chấm nhận xét 1: - Cán chấm nhận xét 2: - Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày …… tháng …… năm …… TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LÊ THỊ CHI Giới tính : Nữ Ngày, tháng, năm sinh : Nơi sinh : Quảng Ngãi 09/10/1984 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học MSHV: 03107107 1- TÊN ĐỀ TÀI: Thiết lập quy trình định tính định lượng vi sinh vật gây bệnh đường ruột người thực phẩm real time-PCR 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thiết lập quy trình để ứng dụng phát định lượng nhanh vi sinh vật gây bệnh thực phẩm kỹ thuật real time-PCR (RTi-PCR) Nội dung nghiên cứu bao gồm:  Tối ưu môi trường tiền tăng sinh cho vi khuẩn đích  Lựa chọn cặp primer đặc hiệu lồi vi khuẩn đích cho phân tích RTi-PCR  Tối ưu đơn giản hoá phương pháp chuẩn bị DNA cho phân tích RTi-PCR  Xác định độ xác, độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp RTi-PCR so với phương pháp nuôi cấy chuẩn  Ứng dụng để phân tích trạng nhiễm khuẩn số mẫu thực phẩm 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 01/2009 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 08/2009 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TSKH NGUYỄN QUỐC BÌNH Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CB HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em vô biết ơn thầy Nguyễn Quốc Bình, người tận tâm hướng dẫn lắng nghe em suốt trình học tập thực đề tài Cám ơn cô Nguyễn Thúy Hương, người cô luôn yêu thương, giúp đỡ động viên em khó khăn Cảm ơn tất thầy cô trang bị cho em kiến thức kỹ người làm khoa học Con xin cám ơn ba me sinh nuôi dưỡng để có ngày hôm Em không nhớ chị Hai, người vừa người chị, người mẹ người bạn em suốt đường qua Cám ơn anh, chị, em gia đình cho em nguồn động viên em tưởng chừng vượt qua Để hoàn thành tốt luận văn em vô cảm ơn chị Thảo, em Việt, anh chị Trung tâm Công nghệ sinh học cô, chị phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách khoa tạo cho em điều kiện thuận lợi Để hoàn thành tốt đề tài em quên giúp đỡ tạo điều kiện anh, chị Trung tâm Phân tích Thí nghiệm TPHCM để em thuận lợi nghiên cứu Đồng thời ơn tất bạn, anh chị cao học khóa 2007 động viên chia sẻ TÓM TẮT: Các bệnh ngộ độc thực phẩm gây nên mối quan tâm toàn xã hội cho sức khỏe cộng đồng Hiện nay, hầu hết trung tâm phân tích, phịng thí nghiệm chủ yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát hiện, phương pháp có độ nhạy cao nhiều thời gian, công sức phức tạp để khẳng định thường vài ngày cho kết âm tính - ngày cho kết dương tính Với mục tiêu “Thiết lập quy trình phát định lượng nhanh số vi sinh vật gây bệnh đường ruột người thực phẩm real time-PCR” Quy trình phát định lượng nhanh lồi vi khuẩn đích RTi-PCR thiết lập Trong đó, quy trình thiết lập chung cho lồi đích Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes, Bacillus cereus với mơi trường tiền tăng sinh chung quy trình khác cho Vibrio parahaemolyticus Sáu cặp primer đặc hiệu cho lồi vi khuẩn đích, khơng có tượng phản ứng chéo cặp primer chọn chủng khơng phải chủng đích Phương pháp chọn có độ nhạy cao từ - 10 tế bào/phản ứng có khả phát diện vi sinh vật đích từ - 10 tế bào/25g mẫu thực phẩm trước làm giàu Đặc biệt chúng tơi có nghiên cứu diện tế bào vi khuẩn đích/25g mẫu mà nghiên cứu trước chưa đề cập, kết phân tích chúng tơi thu có 65.00% số mẫu nghiên cứu phát Listeria monocytogenes, 50.00% phát Salmonella Bacillus cereus, 41.67% E coli, 37.50% dương tính với V parahaemolyticus 30.00% Shigella thí nghiệm gây nhiễm nhân tạo Độ xác, độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp chọn cao, giá trị tính tốn trung bình tương ứng 97.99%; 98.05%; 95.60% Từ kết nghiên cứu này, phương pháp RTi-PCR xây dựng nên hồn tồn thay phương pháp chuẩn nuôi cấy truyền thống để phát vi sinh vật gây bệnh mẫu thực phẩm phương diện độ nhạy độ xác Mặt khác phương pháp có thời gian thực ngắn nhiều (4 - 30h so với - ngày) với thao tác đơn giản phương pháp nuôi cấy cổ điển Phương pháp cần nên ứng dụng cho trung tâm phân tích cho việc đánh giá an tồn vệ sinh thực phẩm đặc biệt hữu ích trường hợp chẩn đoán nhanh ca ngộ độc thực phẩm ABSTRACT: Foodborne diseases remain a persistent challenge to the public health Most of presents the agency's preferred laboratory procedures for microbiological analyses of foods These methods had higly sensitive but these procedures are timeconsuming and laborious and several days are required for negative confirmation and about - days for a positive confirmation The objectives of this study were “To establish process for the rapid detection and quantification foodborne pathogenes which are major cause intestinal tracts in the human by real time-PCR” Processes for rapid detection and quantification target foodborne pathogenes was developed with the protocol used a universal culture preenrichment medium and sets of specific primers for RTi-PCR to detect Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogene and Bacillus cereus and a particular protocol for diagnosis Vibrio parahaemolyticus The primers 100% specific as determined target species and no interference reation with non- target species was observed This method had highly sensitive, with detection limits from to 10 copies/reaction as pure DNA 100% samples were possitive results as infection more than cell/25g food Especially, in this study I investigated to ability present of target strains as less than cell/25g food before enrichment step that was not mentioned in last studies The results of this study is 65.00% positive Listeria monocytogenes, 50.00% positive Salmonella and Bacillus cereus, 41.67% with E coli, 37.50% positive V parahaemolyticus 30.00% positive result Shigella The accuracy, sensitivity and specificity is high in comparison with traditional culture method These averange values was calculated 97.99%, 98.05%, 95.60% respectively in artificially contamination experiments For this reason, this method should replace method traditional culture to detect foodborne pathogens based on accuracy and sensitivity On the other hand, the time to finish diagnosis only spent - 30 hours in comparison with classical culture in - days This method should applied to evaluate food safety Especially, that is very useful for rapid diagnosis foodborne outbreaks APW: Alkaline Peptone Water BAM: FDA's Bacteriological Analytical Manual BPW: Bufferer Peptone Water CDC: Trung tâm Kiểm dịch Phòng bệnh Mỹ (Center for Disease Control and Prevention) ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FDA: Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration) IMS LA: Latex Agglutination LB: Luria Bertani PCR: Polymerase chain reaction RPLA: Reverse passive latex agglutination RTi-PCR: Real time-PCR TSBYE: Tryptic Soya Broth Yeast Extract USDA/ERS: Cơ quan Nghiên cứu Dịch vụ Kinh tế Nông nghiệp Mỹ (United States Department of Agricultural/Economic Research Service ) USDA: Bộ Nông nghiệp Mỹ (United States Department of Agricultural) VSV: Vi sinh vật MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT 2.2 CÁC VI SINH VẬT GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM PHỔ BIẾN VÀ NGUY HIỂM .5 2.2.1 Escherichia coli 2.2.1.1 Đặc điểm phân loại 2.2.1.2 Bệnh, chế nhân tố gây độc 2.2.2 Bacillus cereus 2.2.2.1 Đặc điểm phân loại 2.2.2.2 Bệnh, chế nhân tố gây độc 2.2.3 Listeria monocytogenes 2.2.3.1 Đặc điểm phân loại 10 2.2.3.2 Bệnh, chế nhân tố gây độc 10 2.2.4 Salmonella 12 2.2.4.1 Đặc điểm phân loại 12 2.2.4.2 Bệnh, chế nhân tố gây độc 13 2.2.5 Shigella 15 2.2.5.1 Đặc điểm phân loại 15 2.2.5.2 Bệnh, chế nhân tố gây độc 17 2.2.6 Vibrio parahaemolyticus 20 2.2.6.1 Đặc điểm phân loại 20 2.2.6.2 Bệnh, chế nhân tố gây độc 21 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM 22 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống 22 2.3.2 Các phương pháp nhanh 23 2.3.2.1 Các mini kit dựa vào sinh hóa 23 2.3.2.2 Các phương pháp miễn dịch 26 2.3.2.3 Các phương pháp dựa acid nucleic 32 2.4 POLYMERASE CHAIN REACTION VÀ REAL TIMEPOLYMERASE CHAIN REACTION 33 2.4.1 Polymerase chain reaction 34 2.4.2 Multiplex polymerase chain reaction 35 2.4.3 Real-time polymerase chain reaction 35 2.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 40 2.5.1 Trong nước 40 Lê Thị Chi – 0310 7107 50g mẫu thực phẩm + 450 mL Butterfield's phosphate - buffered water (BPBW) Đồng phút Kiểm tra E coli Pha loãng thập phân cần thiết với BPBW Kiểm tra Bacillus cereus Từ độ pha loãng kiểm tra lặp lại đĩa, mL mẫu pha lỗng vào Petri vơ trùng Thêm mL Tryptic soya agar (TSA), lắc để phân tán mẫu đĩa, để 2h chờ cho thạch đông Hút 0.1mL trải lên đĩa môi trường MYP Ủ 30oC/24h Chọn đĩa có khoảng 25 - 250 khuẩn lạc đặc trưng, đếm Bổ sung thêm 10 mL môi trường (VRBA), lắc để đơng hồn tồn Chọn khuẩn lạc đặc trưng để kiểm tra PCR Úp ngược đĩa ủ 40o C 24h Chọn đĩa có khoảng 25 - 250 khuẩn lạc đặc trưng, đếm Tính tốn kết Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy vào EC Broth Chọn khuẩn lạc cho kết sinh EC broth Khẳng định PCR g PL3 MỘT SỐ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH Bảng PL1: Sự phát triển vi khuẩn đích số mơi trường tiền tăng sinh (CFU/mL) Môi trường BPW APW LB TSBYE LEB 1.3x108 3.0x107 1.6x109 12.5x109 1.0x109 ±1.79x105 ±1.79x105 ±1.6x107 ±2.9x107 ±4.2x107 2.7x108 2.6x106 3.1x108 7.4x109 Không ±5.45x106 ±2.5x105 ±2.3x106 ±1.9x105 kiểm tra 1.4x107 9.1x104 1.9x107 3.0x107 Không ±1.79x105 ±1.7x103 ±1.79x105 ±1.79x105 kiểm tra 3.0x107± 9.0x105 2.7x107 2.9x107 Không 9.0x105 ±4.1x104 ±3.0x105 ±8.02x105 kiểm tra 1.3x108± 1.8x107 1.4x108 7.7x109 Không 2.6x106 ±1.2x105 ±6.6x105 ±1.3x107 kiểm tra 2.8x1010± 6.7x108 2.4x109 Không 2.1x107 ±3.6x106 ±9.1x107 kiểm tra Loài L mononocyt ogenes Salmonella Shigella B cereus E coli V parahaemo