Nghiên cứu định tính, bán định lượng tanshinon IIa trong cao đan sâm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI VĂN DUẨN NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, BÁN ĐỊNH LƯỢNG TANSHINON IIa TRONG CAO ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI VĂN DUẨN Mã sinh viên: 1101080 NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, BÁN ĐỊNH LƯỢNG TANSHINON IIa TRONG CAO ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thuận ThS Trần Thị Lan Hương Nơi thực Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI-2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Thuận Th.S Trần Thị Lan Hương, hai người cô trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới: Tập thể giảng viên, kĩ thuật viên môn Hóa Dược hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện giúp hoàn thành khóa luận Viện Dược liệu Trung Ương giúp trình phân tích mẫu thị trường Hai em Lê Đình Hùng-M3K67 Lê Thị Quỳnh-M1K67 hỗ trợ, giúp đỡ, động viên suốt thời gian nghiên cứu khoa học môn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội, người dìu dắt suốt năm học qua Cuối xin cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè bên quan tâm chăm sóc, giúp đỡ hoàn thành khóa học Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Mai Văn Duẩn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đan sâm 1.1.1 Cây Đan sâm 1.1.2 Dược liệu Đan sâm 1.1.3 Cao Đan sâm 1.1.4 Tanshinon IIa 1.2 Tổng quan phương pháp Sắc ký lớp mỏng hiệu cao 1.2.1.Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng 1.2.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng hiệu cao 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất 12 2.1.3 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 13 2.3.2 Thẩm định phương pháp 14 2.3.3 Phân tích mẫu cao Đan sâm thị trường 16 2.3.4 Phương pháp xử lí kết 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 18 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 18 3.1.2 Lựa chọn dung môi chiết 18 3.1.3 Tiêu chuẩn cho phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm 19 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 21 3.2.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc 21 3.2.2 Đường chuẩn- khoảng nồng độ hồi quy 23 3.2.3 Độ lặp lại phương pháp 24 3.2.4 Độ 25 3.2.5 So sánh với phương pháp công nhận 25 3.3 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ số mẫu cao thu thị trường 27 3.4 Bàn luận 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 4.1 Kết luận 32 4.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AOAC : Hiệp hội nhà hóa phân tích thông (Association of Officail Analytical Chemists) EtOH : Ethanol EtOAc : Ethyl acetat HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Perfomance Liquid Chromatography) HPTLC : Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High Perfomance Thin Layer Chromatography) Rf : Hệ số lưu giữ r : Hệ số tương quan RSD : Độ lệch chuẩn tương tối (Relative Standard Deviation) TCCS : Tiêu chuẩn sở TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TNHH : Trách nhiệm hữu hạn TW : Trung ương UV : Tử ngoại (Ultraviolet) VIS : Khả kiến (Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 So sánh số tham số TLC HPTLC 11 Bảng 2.1 Mẫu thử thu thập thị trường dùng để phân tích 16 Bảng 3.1 Giá trị Rf ứng với Tanshinon IIa vết sắc ký 22 Bảng 3.2 Kết đánh giá đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa 23 Bảng 3.3 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử cao Đan sâm nghiên cứu 24 Bảng 3.4 Kết độ thu hồi 25 Bảng 3.5 Kết mẫu thử cao E1 theo phương pháp HPTLC 26 Bảng 3.6 Kết phân tích bán định lượng mẫu thử cao E1 phương pháp HPLC 26 Bảng 3.7 Kết T-test 27 Bảng 3.8 Kết đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa 28 Bảng 3.9 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử phân tích thị trường 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh rễ Đan sâm Hình 1.2 Công thức cấu tạo Tanshinon IIa Hình 3.1 Vết sắc ký mẫu chiết EtOAc 19 Hình 3.2 Vết sắc ký mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, dung dịch chuẩn Tanshinon IIa 21 Hình 3.3 Hình ảnh vết sắc ký mẫu thử cao Đan sâm/cồn mẫu trắng thêm chuẩn Tanshinon IIa 22 Hình 3.4 Đường chuẩn dung dịch Tanshinon IIa 24 Hình 3.5 Hình ảnh vết sắc mẫu phân tích thị trường 28 Hình 3.6 Đường chuẩn Tanshinon IIa tiến hành phân tích mẫu thị trường 29 Hình 3.7 Thông tin quảng bá công dụng cao F 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm vị thuốc sử dụng rộng rãi toàn giới với tác dụng tác dụng chống đông, giãn mạch, kháng khuẩn chống viêm Đan sâm áp dụng lâm sàng Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản số nước châu Á khác có Việt Nam [16],[25] Hiện Việt Nam nhu cầu sử dụng thuốc từ Đan sâm dược liệu khác nói chung không ngừng gia tăng, số bệnh viện lớn Việt Nam sử dụng chế phẩm từ Đan sâm điều trị Trên thị trường Việt Nam, trừ chế phẩm thuốc sắc, ngâm rượu dùng nguyên dược liệu, chế phẩm có Đan sâm chủ yếu dùng dạng cao Đan sâm Trong đó, Việt Nam lại chưa có tiêu chuẩn quy định cách điều chế kiểm nghiệm cao Đan sâm Vì vậy, xây dựng tiêu chuẩn cho cao Đan sâm phù hợp với điều kiện Việt Nam điều cần thiết Tanshinon IIa hợp chất Đan sâm Dược điển Việt Nam IV có quy định bắt buộc thử định tính dược liệu Đan sâm phải có Tanshinon IIa Do với mục đích góp phần xây dựng tiếu chuẩn cao Đan sâm tiến hành đề tài “Nghiên cứu định tính, bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm” với ba mục tiêu chính: Xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm phương pháp HPTLC Thẩm định phương pháp vừa xây dựng Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ số mẫu cao thu thị trường CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đan sâm 1.1.1 Cây Đan sâm Đan sâm, hay gọi huyết sâm, xích sâm, huyết Sở dĩ có tên rễ giống sâm mà lại có màu đỏ (Đan đỏ) Tên khoa học Salvia multiorrhiza Bunge., thuộc họ Hoa môi Lamiaceae (Labiatae) [9] Hình 1.1 Hình ảnh rễ Đan sâm 1.1.1.1 Mô tả thực vật Đan sâm loại cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5cm, màu đỏ nâu Thân vuông có gân dọc Lá kép, mọc đối: 3-5 chét, đặc biệt có Lá chét thường lớn Lá kép có cuống dài, cuống chét ngắn có dìa Lá chét dài 2-7,5cm, rộng 0,8-5cm Mép chét có cưa tù Mặt chét màu xanh, có lông mềm màu trắng, mặt màu xanh tro, có lông dài Gân mặt dưới, chia phiến chét thành múi nhỏ Cụm hoa mọc thành chùm đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20cm Hoa mọc vòng, vòng 3-10 hoa thường hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, môi, môi trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi xẻ thùy, thùy có cưa tròn Hai nhị môi dưới, bầu có vòi dài lồi môi Quả nhỏ, dài mm, rộng 1,5 mm Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo) mùa tháng 6-9 [9] 21 - Định tính: Sắc ký đồ mẫu thử phải có vết có màu tím hồng có Rf tương đương với vết Tanshinon IIa chuẩn - Bán định lượng: Kết phân tích phải thu đường chuẩn hồi quy, độ lặp lại độ đạt giá trị theo quy định 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc Hình 3.2 thể sắc ký đồ mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, mẫu thử dung dịch Tanshinon IIa chuẩn Hình 3.2 Vết sắc ký mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, dung dịch chuẩn Tanshinon IIa Nhận xét: Sắc ký đồ mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước không xuất vết tương ứng với vết sắc ký đồ mẫu thử chứa Tanshion IIa Trên mỏng khác: chấm vết dung dịch chuẩn C1-C6, vết mẫu thử khác T1-T6, vết dung dịch trộn Tr1, Tr2, Tr3 (cao Đan sâm + chuẩn Tanshinon IIa) Sau khai triển, quan sát sắc ký đồ ánh sáng khả 22 kiến, kết thu hình 3.3 Giá trị Rf độ lệch chuẩn tương đối vết bảng 3.1 Hình 3.3 Hình ảnh vết sắc ký mẫu thử cao Đan sâm/cồn mẫu trắng thêm chuẩn Tanshinon IIa Bảng 3.1 Giá trị Rf ứng với Tanshinon IIa vết sắc ký Mẫu Rf chuẩn mẫu chuẩn C1 0,4260 T1 0,3960 Tr 0,4090 C2 0,4130 T2 0,4020 Tr 0,4020 C3 0,4050 T3 0,3990 Tr 0,4020 C4 0,3990 T4 0,4040 C5 0,4020 T5 0,4040 C6 0,3960 T6 0,4020 Trung bình = 0,4041 SD = 0,0073 RSD = 1.79 % Mẫu thử Rf Mẫu trộn mẫu thử Rf mẫu trộn 23 Nhận xét: Sắc ký đồ mẫu thử có vết Tanshinon IIa có hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với vết sắc ký đồ mẫu chuẩn Giá trị Rf mẫu chuẩn mẫu thử có độ lệch chuẩn tương đối RSD= 1,79 % < 3% Như phương pháp đảm bảo độ chọn lọc- đặc hiệu 3.2.2 Đường chuẩn- khoảng nồng độ hồi quy Nồng độ dung dịch chuẩn: 0,27; 0,36; 0,45; 0,54; 0,63; 0,72 mg/ml Kết phân tích đưa hình 3.4 bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết đánh giá đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa Dung dịch Nồng độ(*) (mg/ml) Diện tích (mAU) C1 0,2646 49972,7 C2 0,3528 71466,2 C3 0,4410 90179,3 C4 0,5292 104661,7 C5 0,6174 117213,0 C6 0,7056 127694,7 PT hồi quy y = -182965x2+ 352547x-30282 r2 0,9998 r 0,9999 24 đường chuẩn Tanshinon IIa 140000 y = -182965x2 + 352547x - 30282 R² = 0,9998 120000 diện tích 100000 80000 60000 40000 20000 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 nồng độ (mg/ml) Hình 3.4 Đường chuẩn dung dịch Tanshinon IIa Nhận xét: Dựa vào đường chuẩn phương trình hồi quy, ta thấy mối tương quan diện tích nồng độ mối tương quan bậc hai, có tính hồi quy cao với r = 0,9999 gần với Như đường chuẩn đạt yêu cầu tính hồi quy 3.2.3 Độ lặp lại phương pháp Kết xác định độ lặp lại thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử cao Đan sâm nghiên cứu Mẫu thử Hàm lượng Tanshinon IIa (%) T1 0,0945 T2 0,0996 T3 0,0970 T4 0,1028 T5 0,1009 T6 0,0970 Trung bình 0,0987 SD 0,0027 RSD (%) 2,79 25 Nhận xét: Hàm lượng Tanshinon IIa thu có độ lệch chuẩn tương đối RSD=2,79 % < 3,7 %, phương pháp có độ lặp lại tốt 3.2.4 Độ Kết xác định độ thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết độ thu hồi Vết mẫu thử trộn Lượng Tanshinon Lượng Độ thu hồi (Tr) IIa thêm vào Tanshinon IIa Tanshinon IIa (mg) thu hồi (%) (mg) 1,764 1,6943 96,05 1,764 1,6938 96,02 1,764 1,6778 95,11 Trung bình 95,73 Nhận xét: Độ phương pháp tính theo độ thu hồi, kết 95,73 % > 95 % Như phương pháp có độ tương đương với độ cần thiết phương pháp định lượng 3.2.5 So sánh với phương pháp công nhận Phương pháp định lượng HPLC công nhận độ xác, ổn định Vì với mong muốn đánh giá tương đối kết hàm lượng Tanshinon IIa phương pháp HPTLC so với HPLC Kết xác định hàm lượng Tanshinon IIa phương pháp HPTLC bảng 3.5 kết xác định hàm lượng Tanshinon IIa phương pháp HPLC bảng 3.6 26 Bảng 3.5 Kết mẫu thử cao E1 theo phương pháp HPTLC Mẫu Thử Thử Thử Lượng cân 3,110 3,077 2,940 Độ pha loãng 10 10 10 Diện tích pic 58180,93 57625,57 56403,42 Nồng độ (mg/ml) 0,2182 0,2136 0,2036 Hàm lượng (%) 0,0702 0,0694 0,0693 (mAU) Bảng 3.6 Kết phân tích bán định lượng mẫu thử cao E1 phương pháp HPLC Mẫu Thử Thử Thử Lượng cân (g) 1,3282 1,2393 1,2224 Độ pha loãng (lần) 25 25 25 2401678 2197951 2108156 2079491 0,040 0,0366 0,0351 0,0346 0,0689 0,0708 0,0698 Diện tích pic Chuẩn (mAU) Nồng độ (mg/ml) Hàm lượng (%) Chúng tiến hành tính T-Test kết hai phương pháp, kết bảng 3.7 Kết T-test p= 0,767527 > 0,05 cho thấy kết hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử cao Đan sâm tính theo phương pháp HPLC HPTLC khác có ý nghĩa thống kê Phương pháp vừa xây dựng có kết tương đương với phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn sở công nhận 27 Bảng 3.7 Kết T-test Phương pháp Mẫu Hàm lượng (%) HPTLC 0,0702 0,0694 0,0693 0,0689 0,0708 0,0698 HPLC SD T-test 0,000776 0,767527 0,000403 Như phương pháp vừa xây dựng đáp ứng yêu cầu định tính bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm 3.3 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ số mẫu cao thu thị trường Kết bán định lượng chế phẩm thể hình 3.5, bảng 3.8, hình 3.6 (đường cong chuẩn) bảng 3.9 (bán định lượng cao) 28 Hình 3.5 Hình ảnh vết sắc mẫu phân tích thị trường Bảng 3.8 Kết đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa Nồng độ (*) (mg/ml) Dung dịch Diện tích (mAU) C1 0,294 66558,34 C2 0,392 75616,13 C3 0,49 83644,48 C4 0,588 89690,16 C5 0,686 93647,94 C6 0,784 95804,27 PT hồi quy y = -94435 x2+ 161968x + 26940 r2 0,9998 r 0,9999 (*) Nồng độ hiệu chỉnh theo hàm lượng chuẩn tinh khiết đường chuẩn tanshinon IIa 120000 y = -94435x2 + 161968x + 26940 R² = 0,9998 100000 80000 60000 40000 20000 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 29 Hình 3.6 Đường chuẩn Tanshinon IIa tiến hành phân tích mẫu thị trường Bảng 3.9 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử phân tích thị trường Mẫu cao Vết Định tính chấm Bán định lượng Hàm lượng Hàm lượng Tanshinon IIa (%) Tanshinon IIa trung bình (%) Cao N Cao F Cao R Cao E1 Cao E2     + 0,0647 + 0,0637 + 0,0702 + 0,0694 + 0,0693 + 0,0510 + 0,0499 + 0,0497 0,0644 0,0696 0,0502 (-) Không phát thấy Tanshinon IIa Kết luận: Mẫu cao N: không phát thấy Tanshinon IIa Mẫu cao F: không phát thấy Tanshinon IIa Mẫu cao R: Có chứa Tanshinon IIa, với hàm lượng 0,0644% Mẫu cao E1: Có chứa Tanshinon IIa với hàm lượng 0,0696% 30 Mẫu cao E2: Có chứa Tanshinon IIa với hàm lượng 0,0502% Các mẫu cao có khác kết định tính bán định lượng 3.4 Bàn luận Trong trình xây dựng phương pháp HPTLC, sử dụng detector Videoscan, detector phân tích vết thông qua ảnh chụp làm dẫn đến sai số nên detector chưa có độ nhạy khả phát hàm lượng detector densitometer, nên tiến hành xác định hàm lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm mức bán định lượng Thành phần hoạt chất loại cao khác có khác dẫn đến công dụng hay định cao Đan sâm phải khác Tuy nhiên thị trường, chế phẩm cao thị trường chưa nói rõ loại cao thành phần hoạt chất gì, hàm lượng sở để đưa công dụng hay định cho sản phẩm Hai năm mẫu cao Đan sâm phân tích không tìm thất Tanshinon IIa, lấy ví dụ cao F không tìm thấy Tanshinon IIa cao chiết nước công bố công dụng, định (Hình 3.7) tác dụng sinh học Tanshinon IIa Hình 3.7 Thông tin quảng bá công dụng cao F [5] Nhận thấy có chênh lệch lớn hàm lượng Tanshinon IIa (một thành phần có tác dụng sinh học quan trọng) mẫu cao Đan sâm (ba mẫu có hàm lượng 0,0502 %; 0,0644 % 0,0696 %) Điều 31 ảnh hưởng nhiều tới chất lượng (tác dụng sinh học) cao nói chung chế phẩm chứa cao Đan sâm nói riêng thị trường 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Trong khóa luận này, qua trình nghiên cứu thực nghiệm, hoàn thành mục tiêu đề ra: Đã xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm Đánh giá phương pháp vừa xây dựng: - Phương pháp vừa xây dựng có độ chọn lọc cao, khoảng hồi quy tốt (r = 0,9999), độ lặp lại tốt (RSD = 2,79 %), độ tốt (tỉ lệ thu hồi = 95,73 %), đạt yêu cầu cho phương pháp định lượng - Phương pháp vừa xây dựng có kết tương đương với phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn sở viện Dược liệu TW Phân tích số mẫu cao thị trường Kết định tính kết bán định lượng Tanshinon IIa mẫu cao có khác biệt lớn 4.2 Đề xuất Do thời gian điều kiện có hạn nên thực mẫu cao chiết cồn, đề xuất: - Sử dụng detector densitometer để tăng độ xác phương pháp, cho phép định lượng cao Đan sâm thay bán định lượng - Để hoàn thiện thêm tiêu chuẩn cho loại cao Đan sâm, xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng/định lượng mẫu cao chiết nước mẫu cao chiết cồn-nước để đảm bảo định lượng loại cao khác thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phạm Kim Anh (2014), Nghiên cứu bán định lượng số vitamin hỗn hợp phương pháp HPTLC, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, chủ biên, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y Tế ( 2007), Hóa phân tích, Tập 2, NXB Y Học, tr.205-208 Domesco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 20/04-2016, trang web http://www.domesco.com/c/dan-sam tam-that/ Đông Y Minh Phúc FITÔCOROM, truy cập ngày:13/05/2106, trang webhttp://dongyminhphuc.com/Tim-Thuoc-Theo-Benh/TimMach/Fitocoton-722153 Fito Pharma (2014), Đan sâm Tam thất, truy cập ngày-10/05, trang web http://www.fitoco.com/product-items/dan-sam-tam-that/ Nguyễn Thị Thu Hòa, Trần Việt Hùng Nguyễn Thị Bích Thu (2012), "Định tính định lượng tanshinon IIa cao đặc hỗn hợp hoàng kỳ đan sâm sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng hiệu cao", Tạp chí Dược liệu 17, tr 370-375 Đinh Thị Thúy Hương (2014), Xây dựng quy trình định lượng Anthocyanin thực phẩm chức phương pháp HPLC HPTLC, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội Đỗ Tât Lợi (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.818 10 LTD Tasly Phar International Co Thiên sứ hộ tâm đan, truy cập ngày 20/04/2016, trang web http://www.tasly.com.vn/ct-sp/744/thien-suho-tam-dan 11 Traphaco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 20/04-2016, trang web http://www.traphaco.com.vn/san-pham/dan-sam-tam 12 Viện Dược liệu (2002), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.732 13 Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà Nội, tr.24-58 Tiếng Anh 14 British Pharmacopoeia Commission (2014), British Pharmacopoeia, chủ biên, Stationery Office Books 15 Machindra J Chavan, Devanand B Shinde and Pravin S Wakte (2011), High-Performance ThinLayer Chromatography (HPTLC), pp.117 16 Hanqing Pang, Liang Wu and Yuping Tang (2016), "Chemical Analysis of the Herbal Medicine Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma (Danshen)", Molecules 21(1) 17 Hildebert Wagner and Gudrun Ulrich-Merzenich Evidence and Rational Based Research on Chinese Drugs, Springer-Verlag Wien, Wien, tr.254 18 National Center for Biotechnology Information Tanshinone IIA, accessed date: 23/04/2016, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/164676 19 Limin Zhou MSc, Zhong Zuo PhD Moses Sing Sum Chow PharmD (2005), "Danshen: an overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use", J Clin Pharmacol 45(12), pp 134559 20 M Liu and X H Xia (2010), Study on the chemical stability of tanshinone IIa, Zhong Yao Cai 33(4), pp 606-9 21 Marina Santiago Scott Strobel (2013), "Thin layer chromatography", Methods Enzymol 533, pp 303-24 22 Yuan-yuan Jiang, Long Wang and Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia miltiorrhiza) in Medicine Volume 1, Springer Netherlands, Dordrecht, pp 97-102 23 Yuan-yuan Jiang, Long Wang and Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia miltiorrhiza) in Medicine Volume 1, Springer Netherlands, Dordrecht, pp.140 24 Yuan-yuan Jiang, Long Wang Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia miltiorrhiza) in Medicine Volume 2, Springer Netherlands, pp.119-129 25 Yufei Feng, Shaowa Lu Shuang Sun (2012), "Analysis of Salvia miltiorrhiza (Danshen)", African Journal of Microbiology Research [...]... lí do chính trong việc giảm hàm lượng Tanshinon IIa trong toàn bộ quá trình chiết, cô đặc, xát hạt, sấy khô [20],[ 25] - Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính, định lượng Tanshinon IIa Tanshinon hấp thu mạnh UV ở bước sóng từ 254–280 [25] 1.1.4.3 Các phương pháp định tính, định lượng Tanshinon IIa trong cao - Dược điển Việt Nam IV chưa có tiêu chuẩn cho cao Đan sâm, tuy nhiên... Đối tượng nghiên cứu Cao Đan sâm do Công ty TNHH Tư Vấn Y Dược Quốc Tế (IMC) sản xuất 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất - Chất chuẩn Tanshinon IIa (Shyuanye): B20257 - 20mg (hàm lượng 98%) LOT: KJ0719CA14 - Các mẫu cao Đan sâm thu thập được: + Cao đặc đan sâm 1 (IMC) chiết bằng cồn: kí hiệu là mẫu cao E0 + Cao đặc đan sâm 2 (IMC) chiết bằng cồn: kí hiệu là mẫu cao E1 + Cao đặc đan sâm 3 (IMC)... dược liệu đang và sẽ được trang bị ngày càng nhiều các máy HPTLC, tuy nhiên mới chỉ ứng dụng chủ yếu để định tính nguyên liệu Vì vậy chúng tôi đề xuất kết hợp sử dụng chức năng thứ hai của HPTLC là định lượng/ bán định lượng các thành phần trong dược liệu và cao, cụ thể ở đây là định tính và bán định lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm 9 1.2 Tổng quan về phương pháp Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Phương... giữ Rf tương đồng với Tanshinon IIa chuẩn cho thấy EtOAc có thể chiết được Tanshinon IIa vết sắc ký lên gọn, tách tốt nên trong phương pháp chuẩn bị mẫu chúng tôi lựa chọn EtOAc làm dung môi chiết Tanshinon IIa trong cao Đan sâm 3.1.3 Tiêu chuẩn cho phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm 3.1.3.1 Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được đưa vào phân tích bằng HPTLC - Chuẩn... Như vậy phương pháp vừa xây dựng đã đáp ứng được yêu cầu định tính và bán định lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm 3.3 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ bộ một số mẫu cao thu được trên thị trường Kết quả bán định lượng các chế phẩm được thể hiện trong hình 3.5, bảng 3.8, hình 3.6 (đường cong chuẩn) và bảng 3.9 (bán định lượng các cao) 28 Hình 3.5 Hình ảnh vết sắc của các mẫu phân tích... [17] - Cao chiết trong cồn: Thành phần chủ yếu sẽ là các thành phần tan trong dầu như là Tanshinon I, IIa, IIb, methylenTanshinon, tanshindiol-A,… - Cao chiết cồn-nước: Thành phần của cả hai loại cao trên [24] 1.1.4 Tanshinon IIa Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh[14], Việt Nam, … Tanshinon IIa là một trong những chất chính được dùng để định tính, có thể định lượng dược... hồi lưu và chiết trong methanol - Ngoài ra, viện Dược liệu TW có xây dựng một tiêu chuẩn nội bộ (TCCS) để định lượng Tanshinon IIa trong dược liệu bằng phương pháp HPLC Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để xác định hàm lượng Tanshinon IIa trong cao 7 Quy trình định lượng Tanshinon IIa theo TCCS của viện Dược liệu TW như sau: + Chuẩn bị dung dịch chuẩn, thử: Chuẩn bị mẫu Tanshinon IIa đối chiếu: cân... daucosterol tìm thấy trong cao chiết EtOH, trong khi đó vitamin E và tannin được tìm thấy trong dịch chiết EtOAc Trong vài năm qua, những nghiên cứu còn chỉ ra Đan sâm còn có các hợp chất polysaccarid, các hợp chất này Đang càng ngày được nghiên cứu toàn diện hơn [16] 1.1.2 Dược liệu Đan sâm Dược liệu Đan sâm (Radix Salviae miltiorrhizae) là rễ phơi khô hay sấy khô của cây Đan sâm (Salvia multiorrhiza... bằng cồn: kí hiệu là mẫu cao E2 + Cao đặc đan sâm (IMC) chiết bằng nước: kí hiệu là mẫu cao N + Cao đan sâm dạng bột khô: kí hiệu mẫu cao R + Cao đan sâm dạng viên nang cứng (CT TNHH Fito pharma): kí hiệu là mẫu cao F - Nước cất, ethyl acetat, toluen đạt tinh khiết phân tích 2.1.3 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu - Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag: bộ phận chấm mẫu bán tự động Linomat 5,... Đan sâm đã được nghiên cứu từ đầu những năm 30 của thế kỉ trước [19] Hiện tại có hơn 100 chất hóa học được tách chiết và xác định từ Đan sâm Dựa trên tính tan của các chất hóa học thì có thể chia các nhóm thành phần trong Đan sâm ra làm ba loại: các thành phần tan trong nước, các thành phần tan trong dầu và các thành phần khác [22] - Thành phần tan trong nước Các thành phần tan trong nước của Đan sâm