Nghiên cứu định tính, bán định lượng tanshinon IIa trong cao đan sâm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI VĂN DUẨN NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, BÁN ĐỊNH LƯỢNG TANSHINON IIa TRONG CAO ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI VĂN DUẨN Mã sinh viên: 1101080 NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, BÁN ĐỊNH LƯỢNG TANSHINON IIa TRONG CAO ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thuận ThS Trần Thị Lan Hương Nơi thực Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI-2016 www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com LỜI CẢM ƠN Ơ N Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân H thành tới TS Nguyễn Thị Thuận Th.S Trần Thị Lan Hương, hai người TP Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới: Q suốt trình thực đề tài Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com tạo điều kiện giúp hoàn thành khóa luận ẠO Tập thể giảng viên, kĩ thuật viên môn Hóa Dược hết lòng giúp đỡ N G Viện Dược liệu Trung Ương giúp trình phân tích mẫu H Ư thị trường TR ẦN Hai em Lê Đình Hùng-M3K67 Lê Thị Quỳnh-M1K67 hỗ trợ, giúp đỡ, động viên suốt thời gian nghiên cứu khoa học môn B Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà 10 00 trường, giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội, người dìu dắt A suốt năm học qua H Ó Cuối xin cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Mai Văn Duẩn D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- bên quan tâm chăm sóc, giúp đỡ hoàn thành khóa học Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y N cô trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com MỤC LỤC Ơ N LỜI CẢM ƠN H MỤC LỤC Q DANH MỤC CÁC BẢNG TP DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ẠO ĐẶT VẤN ĐỀ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com CHƯƠNG TỔNG QUAN G Đ 1.1 Đan sâm H Ư N 1.1.1 Cây Đan sâm 1.1.2 Dược liệu Đan sâm TR ẦN 1.1.3 Cao Đan sâm 1.1.4 Tanshinon IIa B 1.2 Tổng quan phương pháp Sắc ký lớp mỏng hiệu cao 10 00 1.2.1.Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng 1.2.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng hiệu cao 10 Ó A CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 Í- H 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 -L 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 ÁN 2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất 12 TO 2.1.3 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 12 ÀN 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y N DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT D IỄ N Đ 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 13 2.3.2 Thẩm định phương pháp 14 2.3.3 Phân tích mẫu cao Đan sâm thị trường 16 2.3.4 Phương pháp xử lí kết 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 3.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 18 3.1.2 Lựa chọn dung môi chiết 18 N H Ơ 3.1.3 Tiêu chuẩn cho phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm 19 N 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 18 Q 3.2.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc 21 TP 3.2.2 Đường chuẩn- khoảng nồng độ hồi quy 23 ẠO 3.2.3 Độ lặp lại phương pháp 24 Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com 3.2.4 Độ 25 N G 3.2.5 So sánh với phương pháp công nhận 25 TR ẦN H Ư 3.3 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ số mẫu cao thu thị trường 27 3.4 Bàn luận 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 10 00 B 4.1 Kết luận 32 4.2 Đề xuất 32 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó A TÀI LIỆU THAM KHẢO Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 21 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ơ N : Hiệp hội nhà hóa phân tích thông : Ethanol EtOAc : Ethyl acetat HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao TP Q U Y N EtOH H (Association of Officail Analytical Chemists) : Sắc ký lớp mỏng hiệu cao HPTLC Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com ẠO (High Perfomance Liquid Chromatography) G (High Perfomance Thin Layer Chromatography) : Hệ số lưu giữ r : Hệ số tương quan RSD : Độ lệch chuẩn tương tối TR ẦN H Ư N Rf (Relative Standard Deviation) : Tiêu chuẩn sở TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TNHH : Trách nhiệm hữu hạn TW : Trung ương H Ó A 10 00 B TCCS -L : Khả kiến (Visible) D IỄ N Đ ÀN TO ÁN VIS : Tử ngoại (Ultraviolet) Í- UV Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú AOAC Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com Ơ Bảng 1.2 So sánh số tham số TLC HPTLC 11 N DANH MỤC CÁC BẢNG H Bảng 2.1 Mẫu thử thu thập thị trường dùng để phân tích 16 U Y N Bảng 3.1 Giá trị Rf ứng với Tanshinon IIa vết sắc ký 22 TP Bảng 3.3 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử cao Đan sâm nghiên cứu 24 www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com ẠO Bảng 3.4 Kết độ thu hồi 25 Đ Bảng 3.5 Kết mẫu thử cao E1 theo phương pháp HPTLC 26 H Ư N G Bảng 3.6 Kết phân tích bán định lượng mẫu thử cao E1 phương pháp HPLC 26 TR ẦN Bảng 3.7 Kết T-test 27 Bảng 3.8 Kết đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa 28 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó A 10 00 B Bảng 3.9 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử phân tích thị trường 29 Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú Q Bảng 3.2 Kết đánh giá đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa 23 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com Ơ Hình 1.1 Hình ảnh rễ Đan sâm N DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ H Hình 1.2 Công thức cấu tạo Tanshinon IIa Q Hình 3.2 Vết sắc ký mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, dung dịch chuẩn Tanshinon IIa 21 ẠO TP Hình 3.3 Hình ảnh vết sắc ký mẫu thử cao Đan sâm/cồn mẫu trắng thêm chuẩn Tanshinon IIa 22 Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Hình 3.4 Đường chuẩn dung dịch Tanshinon IIa 24 N G Hình 3.5 Hình ảnh vết sắc mẫu phân tích thị trường 28 H Ư Hình 3.6 Đường chuẩn Tanshinon IIa tiến hành phân tích mẫu thị trường 29 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó A 10 00 B TR ẦN Hình 3.7 Thông tin quảng bá công dụng cao F 30 Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y N Hình 3.1 Vết sắc ký mẫu chiết EtOAc 19 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm vị thuốc sử dụng rộng rãi toàn giới với Ơ N tác dụng tác dụng chống đông, giãn mạch, kháng khuẩn chống viêm H Đan sâm áp dụng lâm sàng Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản U Y N số nước châu Á khác có Việt Nam [16],[25] Hiện Việt TP không ngừng gia tăng, số bệnh viện lớn Việt Nam sử dụng ẠO chế phẩm từ Đan sâm điều trị Trên thị trường Việt Nam, trừ chế Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com phẩm thuốc sắc, ngâm rượu dùng nguyên dược liệu, chế phẩm có Đan sâm N G chủ yếu dùng dạng cao Đan sâm Trong đó, Việt Nam lại chưa có tiêu chuẩn H Ư quy định cách điều chế kiểm nghiệm cao Đan sâm Vì vậy, xây dựng TR ẦN tiêu chuẩn cho cao Đan sâm phù hợp với điều kiện Việt Nam điều cần thiết Tanshinon IIa hợp chất Đan sâm Dược B điển Việt Nam IV có quy định bắt buộc thử định tính dược liệu Đan sâm phải 10 00 có Tanshinon IIa Do với mục đích góp phần xây dựng tiếu chuẩn cao Đan A sâm tiến hành đề tài “Nghiên cứu định tính, bán định lượng H Ó Tanshinon IIa cao Đan sâm” với ba mục tiêu chính: Í- Xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa -L cao Đan sâm phương pháp HPTLC ÁN Thẩm định phương pháp vừa xây dựng cao thu thị trường D IỄ N Đ ÀN TO Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ số mẫu Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú Q Nam nhu cầu sử dụng thuốc từ Đan sâm dược liệu khác nói chung Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đan sâm Ơ N 1.1.1 Cây Đan sâm H Đan sâm, hay gọi huyết Q tên rễ giống khoa học Salvia ẠO Tên TP sâm mà lại có màu đỏ (Đan đỏ) Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com multiorrhiza Bunge., thuộc họ Hoa N G môi Lamiaceae (Labiatae) [9] H Ư Hình 1.1 Hình ảnh rễ Đan sâm TR ẦN 1.1.1.1 Mô tả thực vật Đan sâm loại cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn B màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5cm, màu đỏ nâu 10 00 Thân vuông có gân dọc Lá kép, mọc đối: 3-5 chét, đặc biệt A có Lá chét thường lớn Lá kép có cuống dài, cuống chét ngắn H Ó có dìa Lá chét dài 2-7,5cm, rộng 0,8-5cm Mép chét có cưa tù Mặt Í- chét màu xanh, có lông mềm màu trắng, mặt màu xanh tro, có -L lông dài Gân mặt dưới, chia phiến chét thành múi nhỏ Cụm ÁN hoa mọc thành chùm đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20cm Hoa mọc TO vòng, vòng 3-10 hoa thường hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y N sâm, xích sâm, huyết Sở dĩ có D IỄ N Đ ÀN môi, môi trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi xẻ thùy, thùy có cưa tròn Hai nhị môi dưới, bầu có vòi dài lồi môi Quả nhỏ, dài mm, rộng 1,5 mm Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo) mùa tháng 6-9 [9] Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 21 - Định tính: Sắc ký đồ mẫu thử phải có vết có màu tím hồng có Rf tương đương với vết Tanshinon IIa chuẩn Ơ N - Bán định lượng: Kết phân tích phải thu đường chuẩn hồi quy, N H độ lặp lại độ đạt giá trị theo quy định .Q 3.2.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc TP Hình 3.2 thể sắc ký đồ mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, ẠO Í- H Ó A 10 00 B TR ẦN H Ư N G Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com mẫu thử dung dịch Tanshinon IIa chuẩn ÁN -L Hình 3.2 Vết sắc ký mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, dung dịch chuẩn Tanshinon IIa TO Nhận xét: Sắc ký đồ mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước không xuất Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích D IỄ N Đ ÀN vết tương ứng với vết sắc ký đồ mẫu thử chứa Tanshion IIa Trên mỏng khác: chấm vết dung dịch chuẩn C1-C6, vết mẫu thử khác T1-T6, vết dung dịch trộn Tr1, Tr2, Tr3 (cao Đan sâm + chuẩn Tanshinon IIa) Sau khai triển, quan sát sắc ký đồ ánh sáng khả Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 22 kiến, kết thu hình 3.3 Giá trị Rf độ lệch chuẩn tương đối TR ẦN Hình 3.3 Hình ảnh vết sắc ký mẫu thử cao Đan sâm/cồn mẫu trắng thêm chuẩn Tanshinon IIa Mẫu Rf chuẩn mẫu chuẩn C1 0,4260 Ó T1 0,3960 Tr 0,4090 0,4130 T2 0,4020 Tr 0,4020 0,4050 T3 0,3990 Tr 0,4020 0,3990 T4 0,4040 C5 0,4020 T5 0,4040 C6 0,3960 T6 0,4020 Đ ÀN TO C4 IỄ N Mẫu thử Rf Mẫu trộn mẫu thử A H ÁN -L Í- C2 C3 D 10 00 B Bảng 3.1 Giá trị Rf ứng với Tanshinon IIa vết sắc ký Rf mẫu trộn Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú H Ư N G Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com ẠO TP Q U Y N H Ơ N vết bảng 3.1 Trung bình = 0,4041 SD = 0,0073 RSD = 1.79 % Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 23 Nhận xét: Sắc ký đồ mẫu thử có vết Tanshinon IIa có hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với vết sắc ký đồ mẫu chuẩn Giá Ơ N trị Rf mẫu chuẩn mẫu thử có độ lệch chuẩn tương đối RSD= 1,79 N H % < 3% Như phương pháp đảm bảo độ chọn lọc- đặc hiệu U Y 3.2.2 Đường chuẩn- khoảng nồng độ hồi quy N G www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Đ Nồng độ(*) (mg/ml) Dung dịch ẠO Bảng 3.2 Kết đánh giá đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa Diện tích (mAU) 0,2646 C2 0,3528 71466,2 0,4410 90179,3 0,5292 104661,7 0,6174 117213,0 0,7056 127694,7 TR ẦN H Ư C1 C3 10 00 B C4 C5 -L Í- r2 H Ó PT hồi quy A C6 y = -182965x2+ 352547x-30282 0,9998 0,9999 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN r 49972,7 Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú TP Kết phân tích đưa hình 3.4 bảng 3.2 Q Nồng độ dung dịch chuẩn: 0,27; 0,36; 0,45; 0,54; 0,63; 0,72 mg/ml Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 24 đường chuẩn Tanshinon IIa 140000 Ơ H 80000 60000 N U Y 40000 Q 20000 0,1 0,2 0,3 0,4 TP 0,5 0,6 www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com G Đ Hình 3.4 Đường chuẩn dung dịch Tanshinon IIa H Ư N Nhận xét: Dựa vào đường chuẩn phương trình hồi quy, ta thấy mối tương quan diện tích nồng độ mối tương quan bậc hai, có tính hồi quy 10 00 B 3.2.3 Độ lặp lại phương pháp TR ẦN hồi quy cao với r = 0,9999 gần với Như đường chuẩn đạt yêu cầu tính Kết xác định độ lặp lại thể bảng 3.3 Mẫu thử Hàm lượng Tanshinon IIa (%) T1 0,0945 T2 0,0996 T3 0,0970 T4 0,1028 T5 0,1009 T6 0,0970 Trung bình 0,0987 SD 0,0027 RSD (%) 2,79 Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó A Bảng 3.3 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử cao Đan sâm nghiên cứu IỄ N D 0,8 ẠO nồng độ (mg/ml) 0,7 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú diện tích 100000 N y = -182965x2 + 352547x - 30282 R² = 0,9998 120000 www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 25 Nhận xét: Hàm lượng Tanshinon IIa thu có độ lệch chuẩn tương đối Ơ N RSD=2,79 % < 3,7 %, phương pháp có độ lặp lại tốt H 3.2.4 Độ Q Lượng Độ thu hồi (Tr) IIa thêm vào Tanshinon IIa (mg) thu hồi TP Lượng Tanshinon ẠO Vết mẫu thử trộn Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Bảng 3.4 Kết độ thu hồi Tanshinon IIa (%) 1,764 1,764 96,05 1,6938 96,02 1,6778 95,11 95,73 10 00 B Trung bình 1,6943 H Ư 1,764 TR ẦN N G (mg) A Nhận xét: Độ phương pháp tính theo độ thu hồi, kết H Ó 95,73 % > 95 % Như phương pháp có độ tương đương với độ Í- cần thiết phương pháp định lượng -L 3.2.5 So sánh với phương pháp công nhận ÁN Phương pháp định lượng HPLC công nhận độ xác, TO ổn định Vì với mong muốn đánh giá tương đối kết hàm Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y N Kết xác định độ thể bảng 3.4 định hàm lượng Tanshinon IIa phương pháp HPTLC bảng 3.5 kết xác định hàm lượng Tanshinon IIa phương pháp HPLC bảng 3.6 D IỄ N Đ ÀN lượng Tanshinon IIa phương pháp HPTLC so với HPLC Kết xác Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 26 Bảng 3.5 Kết mẫu thử cao E1 theo phương pháp HPTLC Thử Thử Thử Lượng cân 3,110 3,077 2,940 Độ pha loãng 10 10 10 Diện tích pic 58180,93 57625,57 56403,42 Nồng độ (mg/ml) 0,2182 0,2136 Hàm lượng (%) 0,0702 0,0694 Ơ H N 0,0693 Đ ẠO TP 0,2036 Chuẩn Lượng cân (g) 10 00 B Độ pha loãng (lần) Diện tích pic 2401678 0,040 H Ó Nồng độ (mg/ml) A (mAU) Thử Thử 1,3282 1,2393 1,2224 25 25 25 2197951 2108156 2079491 0,0366 0,0351 0,0346 0,0689 0,0708 0,0698 ÁN -L Í- Hàm lượng (%) Thử TR ẦN Mẫu H Ư pháp HPLC N G Bảng 3.6 Kết phân tích bán định lượng mẫu thử cao E1 phương TO Chúng tiến hành tính T-Test kết hai phương pháp, kết bảng 3.7 Kết T-test p= 0,767527 > 0,05 cho thấy kết hàm lượng Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y Q (mAU) www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com N Mẫu D IỄ N Đ ÀN Tanshinon IIa mẫu thử cao Đan sâm tính theo phương pháp HPLC HPTLC khác có ý nghĩa thống kê Phương pháp vừa xây dựng có kết tương đương với phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn sở công nhận Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 27 Bảng 3.7 Kết T-test Mẫu Hàm lượng (%) HPTLC 0,0702 0,0694 0,0693 0,0689 0,0708 0,0698 T-test Ơ H N ẠO TP 0,767527 Đ 0,000403 N H Ư TR ẦN Như phương pháp vừa xây dựng đáp ứng yêu cầu định tính bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm B 3.3 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ số mẫu 10 00 cao thu thị trường A Kết bán định lượng chế phẩm thể hình 3.5, bảng D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó 3.8, hình 3.6 (đường cong chuẩn) bảng 3.9 (bán định lượng cao) Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú Q U Y 0,000776 G www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com HPLC SD N Phương pháp Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 28 Hình 3.5 Hình ảnh vết sắc mẫu phân tích thị trường Ơ 0,294 66558,34 C2 0,392 75616,13 C3 0,49 C4 0,588 C5 0,686 C6 0,784 TP Q C1 G Đ ẠO 83644,48 89690,16 N 93647,94 H Ư 95804,27 y = -94435 x2+ 161968x + 26940 TR ẦN PT hồi quy r2 0,9999 10 00 B r 0,9998 Ó A (*) Nồng độ hiệu chỉnh theo hàm lượng chuẩn tinh khiết 120000 Í- H đường chuẩn tanshinon IIa ÁN -L y = -94435x2 + 161968x + 26940 R² = 0,9998 100000 TO 80000 Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y (mAU) www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com H Diện tích N Nồng độ (*) (mg/ml) Dung dịch N Bảng 3.8 Kết đường chuẩn chất chuẩn Tanshinon IIa 40000 D IỄ N Đ ÀN 60000 20000 0 0,1 0,2 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 29 Hình 3.6 Đường chuẩn Tanshinon IIa tiến hành phân tích mẫu thị Ơ Bảng 3.9 Hàm lượng Tanshinon IIa mẫu thử phân tích thị N Bán định lượng Hàm lượng Tanshinon IIa (%) Tanshinon IIa TP Q Hàm lượng chấm + + 0,0647 0,0637 + 0,0702 + 0,0694 + 0,0693 + 0,0510 + 0,0499 + 0,0497 H Ó TO ÁN -L Cao E2 ẠO  Đ G  N H Ư  A Cao E1 Í- Cao R  TR ẦN Cao F B Cao N 10 00 www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com trung bình (%) 0,0644 0,0696 0,0502 Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y Định tính H trường Mẫu cao Vết N trường D IỄ N Đ ÀN (-) Không phát thấy Tanshinon IIa Kết luận: Mẫu cao N: không phát thấy Tanshinon IIa Mẫu cao F: không phát thấy Tanshinon IIa Mẫu cao R: Có chứa Tanshinon IIa, với hàm lượng 0,0644% Mẫu cao E1: Có chứa Tanshinon IIa với hàm lượng 0,0696% Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 30 Mẫu cao E2: Có chứa Tanshinon IIa với hàm lượng 0,0502% Các mẫu cao có khác kết định tính bán định lượng Ơ N 3.4 Bàn luận H Trong trình xây dựng phương pháp HPTLC, sử dụng U Y N detector Videoscan, detector phân tích vết thông qua ảnh chụp làm TP lượng detector densitometer, nên tiến hành xác định hàm ẠO lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm mức bán định lượng Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Thành phần hoạt chất loại cao khác có khác N G dẫn đến công dụng hay định cao Đan sâm phải khác Tuy H Ư nhiên thị trường, chế phẩm cao thị trường chưa nói rõ loại TR ẦN cao thành phần hoạt chất gì, hàm lượng sở để đưa công dụng hay định cho sản phẩm Hai năm mẫu cao Đan B sâm phân tích không tìm thất Tanshinon IIa, lấy ví dụ cao F không 10 00 tìm thấy Tanshinon IIa cao chiết nước công bố công dụng, D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó A định (Hình 3.7) tác dụng sinh học Tanshinon IIa Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú Q dẫn đến sai số nên detector chưa có độ nhạy khả phát hàm Hình 3.7 Thông tin quảng bá công dụng cao F [5] Nhận thấy có chênh lệch lớn hàm lượng Tanshinon IIa (một thành phần có tác dụng sinh học quan trọng) mẫu cao Đan sâm (ba mẫu có hàm lượng 0,0502 %; 0,0644 % 0,0696 %) Điều Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 31 ảnh hưởng nhiều tới chất lượng (tác dụng sinh học) cao nói chung Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó A 10 00 B TR ẦN H Ư N G Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com ẠO TP Q U Y N H Ơ N chế phẩm chứa cao Đan sâm nói riêng thị trường Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Ơ N Trong khóa luận này, qua trình nghiên cứu thực nghiệm, H hoàn thành mục tiêu đề ra: Q cao Đan sâm TP Đánh giá phương pháp vừa xây dựng: ẠO - Phương pháp vừa xây dựng có độ chọn lọc cao, khoảng hồi quy Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com tốt (r = 0,9999), độ lặp lại tốt (RSD = 2,79 %), độ tốt (tỉ lệ thu N G hồi = 95,73 %), đạt yêu cầu cho phương pháp định lượng H Ư - Phương pháp vừa xây dựng có kết tương đương với phương TR ẦN pháp HPLC theo tiêu chuẩn sở viện Dược liệu TW Phân tích số mẫu cao thị trường Kết định tính kết B bán định lượng Tanshinon IIa mẫu cao có khác biệt lớn 10 00 4.2 Đề xuất A Do thời gian điều kiện có hạn nên thực H Ó mẫu cao chiết cồn, đề xuất: Í- - Sử dụng detector densitometer để tăng độ xác phương -L pháp, cho phép định lượng cao Đan sâm thay bán định lượng phương pháp định tính, bán định lượng/định lượng mẫu cao chiết nước mẫu cao chiết cồn-nước để đảm bảo định lượng loại cao khác thị trường D IỄ N Đ ÀN TO ÁN - Để hoàn thiện thêm tiêu chuẩn cho loại cao Đan sâm, xây dựng Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú U Y N Đã xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt N Phạm Kim Anh (2014), Nghiên cứu bán định lượng số vitamin Ơ N H hỗn hợp phương pháp HPTLC, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại TP Bộ Y Tế ( 2007), Hóa phân tích, Tập 2, NXB Y Học, tr.205-208 Domesco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 20/04-2016, trang web Đ ẠO G www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Hà Nội Đông Y Minh Phúc FITÔCOROM, truy cập ngày:13/05/2106, trang H Ư N http://www.domesco.com/c/dan-sam tam-that/ Mach/Fitocoton-722153 B Fito Pharma (2014), Đan sâm Tam thất, truy cập ngày-10/05, trang 10 00 TR ẦN webhttp://dongyminhphuc.com/Tim-Thuoc-Theo-Benh/Tim- web http://www.fitoco.com/product-items/dan-sam-tam-that/ Nguyễn Thị Thu Hòa, Trần Việt Hùng Nguyễn Thị Bích Thu (2012), A H Ó "Định tính định lượng tanshinon IIa cao đặc hỗn hợp hoàng kỳ Í- đan sâm sắc ký lớp mỏng sắc ký lỏng hiệu cao", Tạp chí -L Dược liệu 17, tr 370-375 Đinh Thị Thúy Hương (2014), Xây dựng quy trình định lượng ÁN D IỄ N Đ ÀN TO Anthocyanin thực phẩm chức phương pháp HPLC Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, chủ biên, Nhà xuất Y học, Q U Y học Dược Hà Nội HPTLC, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội Đỗ Tât Lợi (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.818 10 LTD Tasly Phar International Co Thiên sứ hộ tâm đan, truy cập ngày 20/04/2016, trang web http://www.tasly.com.vn/ct-sp/744/thien-suho-tam-dan Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 11 www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com Traphaco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 20/04-2016, trang web http://www.traphaco.com.vn/san-pham/dan-sam-tam N Viện Dược liệu (2002), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Ơ 12 N Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia (2010), U Y 13 H Tập 1, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.732 ẠO Đ G biên, Stationery Office Books Machindra J Chavan, Devanand B Shinde and Pravin S Wakte (2011), TR ẦN 15 N British Pharmacopoeia Commission (2014), British Pharmacopoeia, chủ H Ư www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Tiếng Anh 14 TP khoa học kĩ thuật, Hà Nội, tr.24-58 High-Performance ThinLayer Chromatography (HPTLC), pp.117 B Hanqing Pang, Liang Wu and Yuping Tang (2016), "Chemical Analysis 10 00 16 of the Herbal Medicine Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma Ó Hildebert Wagner and Gudrun Ulrich-Merzenich Evidence and Rational H 17 A (Danshen)", Molecules 21(1) National Center for Biotechnology Information Tanshinone IIA, -L 18 Í- Based Research on Chinese Drugs, Springer-Verlag Wien, Wien, tr.254 ÁN accessed date: 23/04/2016, TO https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/164676 IỄ N Đ ÀN 19 Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú Q Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Limin Zhou MSc, Zhong Zuo PhD Moses Sing Sum Chow PharmD (2005), "Danshen: an overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use", J Clin Pharmacol 45(12), pp 1345- D 59 20 M Liu and X H Xia (2010), Study on the chemical stability of tanshinone IIa, Zhong Yao Cai 33(4), pp 606-9 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 21 www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com Marina Santiago Scott Strobel (2013), "Thin layer chromatography", Methods Enzymol 533, pp 303-24 N Yuan-yuan Jiang, Long Wang and Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia Ơ 22 N H miltiorrhiza) in Medicine Volume 1, Springer Netherlands, Dordrecht, TP miltiorrhiza) in Medicine Volume 1, Springer Netherlands, Dordrecht, Yuan-yuan Jiang, Long Wang Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia Đ www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com 24 ẠO pp.140 Yufei Feng, Shaowa Lu Shuang Sun (2012), "Analysis of Salvia H Ư 25 N G miltiorrhiza) in Medicine Volume 2, Springer Netherlands, pp.119-129 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ó A 10 00 B TR ẦN miltiorrhiza (Danshen)", African Journal of Microbiology Research Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú Yuan-yuan Jiang, Long Wang and Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia Q 23 U Y pp 97-102 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial ... A sâm tiến hành đề tài Nghiên cứu định tính, bán định lượng H Ó Tanshinon IIa cao Đan sâm với ba mục tiêu chính: Í- Xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa -L cao Đan sâm. .. chủ yếu để định tính nguyên liệu Vì đề xuất kết hợp sử dụng chức thứ hai HPTLC định lượng/ bán định lượng thành phần dược liệu cao, cụ thể định tính bán định lượng Tanshinon IIa cao Đan sâm Đóng... Cao đặc đan sâm (IMC) chiết cồn: kí hiệu mẫu cao E0 H Ư + Cao đặc đan sâm (IMC) chiết cồn: kí hiệu mẫu cao E1 TR ẦN + Cao đặc đan sâm (IMC) chiết cồn: kí hiệu mẫu cao E2 + Cao đặc đan sâm (IMC)