TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCMKHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMMÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨMNội dung1. Tình hình ngộ độc thực phẩm2. Đặc điểm Salmonella3. Phạm vi áp dụng4. Nguyên tắc5. Dụng cụ, thiết bị, môi trường vàhóa chất6. Quy trình phân tích7. Các bước tiến hành
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHÓM 5: Trần Anh Tuấn Trần Thị Lan Lê Thị Thúy Hoa Nguyễn Phúc Nhật Huy Huỳnh Thị Hương Hảo Bảng phân công nhiệm vụ Họ tên MSSV Nhiệm vụ Trần Anh Tuấn 2022180032 Tình hình ngộ độc thực phẩm Phạm vi áp dụng Trần Thị Lan 2022181028 Đặc điểm Salmonella Lê Thị Thúy Hoa 2022181022 Nguyên tắc Dụng cụ, thiết bị, mơi trường hóa chất Nguyễn Phúc Nhật Huy 2022181026 Quy trình phân tích Huỳnh Thị Hương Hảo 2022181019 Các bước tiến hành Nội dung Tình hình ngộ độc thực phẩm Đặc điểm Salmonella Phạm vi áp dụng Nguyên tắc Dụng cụ, thiết bị, môi trường hóa chất Quy trình phân tích Các bước tiến hành Tình hình ngộ độc thực phẩm • Theo thống kê từ Cục An tồn thực phẩm (BYT), năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân 100-200 ca từ vong • Nguyên nhân xác định xuất phát từ thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật (38.7%), độc tố tự nhiên(28.4%), hóa chất (4.2%), Tình hình ngộ độc thực phẩm • Từ năm 2010-2019 nước ghi nhận 1.556 vụ ngộ độc thực phẩm, với 47.400 người mắc, có 217 người chết, gần 40.190 người phải nhập viện điều trị • Riêng năm 2020, toàn quốc ghi nhận 48 vụ ngộ độc thực phẩm làm 870 người mắc, 842 người nhập viện điều trị 22 người tử vong So sánh với kỳ năm 2019 tăng 11 vụ (29.7%) ngộ độc thực phẩm, số người mắc tăng 18 người từ vong tăng 17 người Tình hình ngộ độc thực phẩm • Ngồi ra, thời tiết mùa hè khiết thực phẩm nhanh hỏng, ôi thiu Theo thống kê, khoảng 70% số vụ ngộ độc thực phẩm bếp ăn tập thể sử dụng suất ăn từ nơi khác vận chuyển đến, không bảo quản tốt • Hiện nay, ngành ATTP tiếp tực đẩy mạnh tuyên truyền, phổ biến quy định pháp luật ATTP, hướng dẫn người dân cách sử dụng thực phẩm an toàn Đặc điểm Salmonella • Salmonella vi sinh vật thuộc hệ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae • Là trực khuẩn gram âm (-), hiếu khí kị khí tùy nghi, khơng tạo bào tử, có khả di động (trừ S.gallinarum S.pullorum), có tiêm mao (trừ S.gallimarum) nhuộm kỹ thuật gram bắt màu đỏ hồng • Khơng lên men saccharose lactose, không sinh indol, không phân giải ure, hầu hết sinh H2S (trừ S.typhi) Đặc điểm Salmonella • Salmonella gây dạng bệnh: Sốt thương hàn (S.typhi), nhiễm trùng máu (S.cholera-sius) rối loạn tiêu hóa (S.typhymurium S.enterididis) • Kích thước tế bo: 0.5 - 3àm ã Vo c th t phõn ( người, động vật lông vũ) từ người bệnh, gây tiêu chảy, ói mửa, buồn nơn • Nhiệt độ: 370C, pH: – 9, chịu nhiệt • Nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn sống đến 15 ngày Đặc điểm Salmonella Salmonella phát triển môi trường nuôi cấy thông thường Trên mơi trường thích hợp, vi khuẩn phát triển sau 24 Có thể mọc mơi trường có chất ức chế chọn lọc DCA (deoxycholate citrate agar) XLD (xylose lysine deoxycholate), mơi trường XLD chất ức chế nên thường dùng để phân lập Salmonella Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella mơi trường trịn, lồi, suốt, có tâm đen, tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ Phạm vi áp dụng Dụng cụ, thiết bị, môi trường hóa chất ❖ Mơi trường hóa chất: Mơi trường hóa chất Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW) Canh Rappaport - Vassiliadis Soya Peptone (RVS) Selenit xystin / Tetrathionat (TT) Xylose Lysine Desoxycholate (SLD) Hektoen Entric Agar (HE) Tryptone Soy Agar (TSA) Lysine Decacboxylase broth (LDC) Voges-Proskauer (VP) Ure Broth Tryptone Water Kligler Iron Agar (KIA)/TSI Đĩa giấy ONPG Dung dịch creatine Kháng huyết Dung dịch α-naphtol KOH 40% Thuốc thử Kovac's HCl NaOH 10% Mục đích Tăng sinh sơ Tăng sinh chọn lọc Phân lập Phục hồi Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella Thuốc thử phản ứng sinh hóa Chỉnh pH Quy trình phân tích Quy trình phân tích - Cân 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng => Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu thử - Thêm 225ml BPW (Buffered Peptone Water) (BPW giúp khôi phục Salmonella bị tổn thương trình bảo quản thục phẩm) Dập mẫu phút => Ủ (37±1)°C/ (18±2) 0.1 ml 10ml môi trường RVS broth (Tăng sinh chọn lọc vi khuẩn trì pH ổn định) Ủ (41.5±1)°C/ (24±3) ml 10ml môi trường MKTTn (Tăng sinh chọn lọc) Ủ (37±1)°C/ (24±3) XLD agar => Ủ (37±1)°C/ (24±3) - Tiến hành cấy HE agar => Ủ (35)°C/ (18-24) Quy trình phân tích - Xem khuẩn lạc Có khuẩn lạc Khơng có khuẩn lạc điển hình nghi ngờ Khơng phát Salmonella 25g/25ml mẫu thử Đánh dấu khuẩn lạc => Cấy lên NA/TSA (thúc đẩy tăng trưởng) => Ủ (37±1)°C/ (24±3) Tiền tăng sinh Tăng sinh chọn lọc Phân lập Phục hồi Khẳng định MỤC TCVN 10780-1:2017 ISO 6579-1:2017 STT Phản ứng sinh hóa Thạch TSI H2S Sinh Đỏ/ vàng Có/Khơng LDC (+) Ure (-) Indol (-) ONPG (-) VP (-) Kết Bảng: Kết phản ứng sinh hóa Nguyên tắc: Xác định khả sử dụng nguồn carbohydrate, có khơng có sinh H2S Cách lấy mẫu: - Cấy ria bề mặt nghiêng thạch cấy đâm sâu xuống đáy - Ủ 37±1°C 24±3 Nguyên tắc: Sử dụng để phát vi khuẩn sinh enzyme decarboxylase Cách lấy mẫu: - Cấy phía bề mặt môi trường lỏng, phù lớp paraffin hay dầu khống lên bề mặt mơi trường - Ủ 37±1°C 24±3 Nguyên tắc: sử dụng để phát khả phân cắt ure thành amoniacdo hoạt tính enzyme urease từ VSV Cách lấy mẫu: - Cấy ria mặt nghiêng thạch - Ủ 37±1°C 24±3 Nguyên tắc: phát khả oxi hóa trytophan thành dạng indol: Indol, Skatol( methyl indol) indolacetate Cách lấy mẫu: - Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường tryptone water - Ủ 37±1°C 24±3 - Sau ủ, thêm ml thuốc thử kovac's Nguyên tắc: xác định khả lên men lactose vi sinh vật Cách lấy mẫu: - Cho vòng đầy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vô trùng chứa 0,25ml dung dịch muối sinh lý - Thêm giọt toluen lắc ống - Đặt ống vào nồi cách thủy 37°C để vài phút - Thêm 0,25ml thuốc thử lắc - Đặt lại ống vào nồi cách thủy để 37°C để 24±3 giờ, kiểm tra ống thường xuyên • Loại trừ chủng tự ngưng kết: - Nhỏ giọt nước muối sinh lý lên phiến kính thủy tinh làm cách cẩn thận, - Dùng que cấy vòng trộn dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu huyền phù đục đồng - Lắc nhẹ phiến kính từ 30 -60 giây - Quan sát kết tối • Kiểm tra O, H, - Nhỏ giọt anti-O H lên lam kính sạch, - Dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn từ mơi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, - Chờ 30-60 giây, quan sát đen Phản ứng sinh hóa Tự ngưng kết Điển hình Khơng Điển hình Khơng Điển hình Có Khơng điển hình - Phản ứng huyết Kháng nguyên O H dương tính Kháng ngun O và/hoặc H âm tính Khơng thử nghiệm - Kết Salmonella Có thể Salmonella Khơng Salmonella Bảng: Diễn giải kết phép thử khẳng định ... Phương pháp dùng để định tính kết luận phát hay khơng phát Salmonella lượng mẫu lấy Quy trình phát Salmonella bắt buộc phải qua giai đoạn phải sử dụng chủng đối chứng toàn q trình phân tích Ngun... sinh chọn lọc Phân lập Phục hồi Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella Thuốc thử phản ứng sinh hóa Chỉnh pH Quy trình phân tích Quy trình phân tích - Cân 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng => Bao PE... huyết Kháng nguyên O H dương tính Kháng ngun O và/hoặc H âm tính Khơng thử nghiệm - Kết Salmonella Có thể Salmonella Khơng Salmonella Bảng: Diễn giải kết phép thử khẳng định